文摘
介绍:嗜中性粒细胞胞外陷阱(网)(即释放。,NETosis) has been recently implicated in the pathomechanism underlying severe end-organ damage in Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) and could present a novel therapeutic target. We aimed to determine whether circulating levels of cell-free DNA (cfDNA), a surrogate for NETosis, may be associated with the development of acute kidney injury (AKI), a major contributor to poor outcomes and mortality in COVID-19.方法:血液样本前瞻性地收集了从成人患者感染SARS-CoV-2向应急部门(ED)。循环的cfDNA量化从病人的血清水平。进一步评估cfDNA水平之间的相关性和阿基的标志(即。,serum creatinine (SCr), cystatin C, neutrophil gelatinase–associated lipocalin (NGAL)), biomarkers of thrombotic microangiopathy and of inflammation in patients’ serum was performed.结果:51 COVID-19患者登记。cfDNA水平被发现明显高于那些发达国家严重的阿基( )和那些需要肾脏替代治疗( )。NGAL cfDNA积极与ED可控硅,半胱氨酸蛋白酶抑制物C,中性粒细胞计数,neutrophil-to-lymphocyte比率,C3a, C5a, Scb5-9, il - 6、il - 10, TNF -引发α、LDH、c反应蛋白、铁蛋白和纤维蛋白原和ADAMTS13 /血管性血友病因子比率负相关淋巴细胞计数。在多元逻辑回归,增加1个单位cfDNA值与增加4.6%的几率严重阿基( ; )。最后,建立网组件cfDNA显著相关性,髓过氧物酶和中性粒细胞弹性蛋白酶。结论:血管内NETosis可能发展的一个重要因素microthrombosis和COVID-19-associated AKI。迫切需要进一步的研究来理解的角色NETosis COVID-19和评估治疗途径针对这一过程。
1。介绍
最近解剖研究描述漫射endotheliitis和广泛microthrombi在肺,心脏,肾微脉管系统的冠状病毒疾病患者2019 (COVID-19) [1- - - - - -4]。这些观察,加上实验室发现的低ADAMTS13活动(即。,a disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin type 1 motif, member 13, a circulating enzyme which cleaves von Willebrand factor (VWF) multimers reducing their activity) to von VWF antigen (VWF:Ag) ratio [5),提高乳酸脱氢酶(LDH) [6)和白细胞介素- 6 (il - 6)、血小板减少(7,8),和贫血9),表明COVID-19可能会导致血栓性微血管病——(TMA)像的条件。这一现象被认为是患者的发病率和死亡率的主要因素等终末器官损害严重COVID-19和结果急性肺损伤(ALI) (10),急性心脏损伤(ACI) [11),和急性肾损伤)12,13]。TMA在COVID-19的发病机制的机制,然而,尚未完全阐明。
大量的证据表明,中性粒细胞的发病机理中发挥核心作用在COVID-19 TMA-like现象患者,通过特异表达形成中性粒细胞胞外陷阱(网)14,15]。网是细胞外纤维组成的双链脱氧核糖核酸(dsDNA)组蛋白和酶如弹性蛋白酶和髓过氧化酶(MPO) [16]。最初被Brinkman et al。17)在2004年作为一个中性粒细胞杀菌机制,网络已经涉及通过捕获microthrombi血小板的形成,从而促进他们的激活,粘附和聚集18]。他们也丰富的组织因子(TF),它可以激活凝血级联(19]。此外,网已被证明损害患者纤溶途径non-COVID-19脓毒性休克,导致持久性microthrombi毛细管内网络(20.),并建议扮演一个角色在sepsis-induced multiorgan失败(21和COVID-19-induced脓毒症22]。虽然NETosis日益公认为大量球员终末器官损害的病理生理学COVID-19 [23),NETosis标记和COVID-19-related严重AKI的预测作用还有待评估。
在此,我们进行了前瞻性研究,以确定循环水平的游离DNA (cfDNA),代孕网发布(NETosis)和组织损伤,可能与终末器官损伤有关,特别是COVID-19-induced阿基。为此,我们分析了cfDNA血清水平及其相关的标记阿基血清肌酐(SCr),半胱氨酸蛋白酶抑制物C,和中性粒细胞白明胶酶相关lipocalin (NGAL),以及TMA和炎症生物标记(ADAMTS13活动/ VWF: Ag (ADAMTS13: VWF)比补充因素3 (C3a),补5因素(C5a),溶膜攻击复杂(Scb5-9)、LDH、il - 6,引发,il - 10,肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、c反应蛋白(CRP)、铁蛋白、纤维蛋白原、井中性白细胞,淋巴细胞和血小板计数)。最后,我们进一步验证cfDNA NETosis通过分析其相关性的代孕网组件的血清髓过氧化酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶。
2。材料和方法
2.1。研究设计
这是一个前瞻性研究。成人(≥18岁)向急诊室(ED)辛辛那提大学的医学中心与呼吸道症状分类暗示COVID-19和积极的反转录聚合酶链反应(rt - pcr)检测COVID-19通过鼻咽拭子了。本研究通过辛辛那提大学的机构审查委员会(IRB) (IRB协议ID, 2020 - 0278;批准日期,03/17/2020)和下进行知情同意的豁免。
2.2。样本收集、处理和生物测量
血液样本中EDTA和/或heparin-containing收集管通过常规临床适应症的ED。集合后,样本离心机在4°C 2000克15分钟,随后冻结在−80°C到测量。
血清肌酐是化验使用动能碱性苦味酸盐(修改Jaffe)方法在贝克曼库尔特AU480化学分析仪(沥青、钙、美国)或贝克曼库尔特AU5822化学分析仪。血清半胱氨酸蛋白酶抑制物C (sCysC)测量使用西门子N乳胶半胱氨酸蛋白酶抑制物C测定(REF: OQNM19) BN II系统。血清NGAL (sNGAL)与NGAL化验测试(BioPorto诊断/ S, Hellerup,丹麦),一个particle-enhanced比浊法,使用十亿II系统。
全血计数与微分量化使用贝克曼库尔特UniCel DxH 800细胞分析系统(沥青、钙、美国)。血浆纤维蛋白原浓度、铁蛋白和c反应蛋白(CRP)测量通过immunonephelometry贝林浊度计二世(美国BNII,西门子医疗解决方案,Inc .莫尔文,PA,美国)。血浆il - 6的浓度、引发、il - 10和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)测量使用内消旋规模发现(MSD) U-Plex化验(美国马里兰州罗克维尔市)。Quidel(美国圣地亚哥,CA) MicroVue ELISA包被用来测量补充组件:C3a C5a, sC5b-9。
乳酸脱氢酶是评估维度RxL马克斯综合化学系统(美国西门子医疗解决方案公司,莫尔文,PA,美国)。VWF: Ag是化验使用Technozym ELISA (Diapharma西切斯特,哦,美国),而ADAMTS13活动测量使用荧光共振能量转移(FRET)试验(美国GA Immucor公司,桃树角落)。中性粒细胞弹性蛋白酶和MPO水平测量使用人类中性粒细胞弹性蛋白酶酶联免疫试剂盒(美国Abcam)和人类Quantikine髓过氧化物酶联免疫试剂盒(研发系统、MN、美国),分别,如前所述24,25]。使用的所有化验调查进行根据制造商的指示和建议。
2.3。量化的cfDNA
cfDNA循环水平的量化从病人的血清使用Quant-iT PicoGreen dsDNA试剂和装备(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)根据制造商的指示,除了15μL的病人血清添加到185年μL PicoGreen试剂溶液的反应总额为200μL 96孔板。样本兴奋在485 nm,荧光强度测量在520 nm协同H1读者(BioTek仪器有限公司、Winooski VT,美国)。
2.4。数据收集、结果和研究的定义
前瞻性研究数据记录从病人的电子病历(EMR)和立即记录到一个搬运工(研究电子数据捕获)数据库。提取的变量包括病人特点和人口统计,过去的病史,临床过程初始接触后30天,结果,和SARS-CoV-2-related并发症。数据提取是由一个研究医生,检查精度与所选的记录由第二个医生。
感兴趣的主要结果是严重的阿基的发展,定义为肾脏疾病改善全球的结果(KDIGO)阶段根据可控硅标准2 + 3 (26]。二次结果是肾脏替代治疗的必要性(RRT)。
2.5。统计分析
数据的分析进行了使用R (R版本4.0.2,基础统计计算,维也纳,奥地利)。分类数据报告为频率(%),在连续数据报告为中位数和四分位范围(差)。比较cfDNA /患者没有严重的阿基与患者之间需要/不需要使用Mann-Whitney RRT进行U测试。cfDNA的诊断性能预测严重阿基RRT评估的必要性和接受者操作特征(ROC)曲线分析,通过计算曲线下的面积(AUC)及其95%置信区间(95% CI)。执行逻辑回归来估计cfDNA集中在主要和次要的影响结果,调整了年龄、性别、和并发症,并计算调整后的优势比(ORs)瓦尔德CI与相应的95%。此外,cfDNA之间的相关性和阿基的标记,蓝玉,炎症进行使用斯皮尔曼等级相关系数。
3所示。结果
3.1。病人的特点
共有51 COVID-19患者包括在内。年龄中位数为50.5 (IQR: 39.3 - -66.0)岁,和57.7%是男性。他们的基线特征和并发症如表所示1。在承认,19例(37.3%)有轻微COVID-19, 26(51.0%)有中度疾病,和6例(11.8%)有严重的疾病。在高峰,19例(37.3%)有轻微的疾病,16例(31.4%)有中度疾病,和16个(31.4%)有严重的疾病。总共12个(23.5%)病人COVID-19开发严重的阿基,RRT需要8人(66.6%)。
3.2。cfDNA水平之间的关系和严重阿基/ RRT的必要性
cfDNA水平明显高于那些被发现患上严重的阿基(164.8[139.7差:-200和123.0 (IQR: 100.9 - -137.7 ng / mL; )(图1(一))和那些需要RRT(164.8[136.7差:-200和125.0 (IQR: 101.6 - -139.3 ng / mL; )(图1 (b))。接收机操作曲线(ROC) auc cfDNA浓度预测严重的阿基,需要RRT分别为0.82 (95% CI 0.67 - -0.98, )(图1 (c))和0.76 (95% CI 0.54 - -0.98, )(图1 (c)),分别。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。cfDNA作为严重AKI的预测水平
多元逻辑回归(调整年龄、并发症和ED可控硅),cfDNA值每增加1个单位,增加4.6%几率的发展严重的阿基( ;95%可信区间1.002 - -1.092, )(表2)。
3.4。cfDNA水平之间的相关性和阿基标记,TMA,和炎症
cfDNA与ED可控硅被发现呈正相关( ; ),NGAL ( ; ),半胱氨酸蛋白酶抑制物C ( ; ),嗜中性粒细胞计数( ; ),neutrophil-to-lymphocyte比( ; ),C3a ( ; ),C3a / C3比( ; ),ca5 ( ; ),Scb5-9 ( , ),il - 6 ( ; ),引发( ; ),il - 10 ( ; ),肿瘤坏死因子-α( ; ),LDH ( ; ),c反应蛋白( ; ),铁蛋白( ; ),和纤维蛋白原( ; )和与ADAMTS13 / VWF比率负相关( ; )和淋巴细胞计数( ; )。与血小板计数观察负相关,几乎达到统计学意义( )(表3并补充图S1)。
3.5。相关性cfDNA水平和其他网组件
cfDNA水平被发现与中性粒细胞弹性蛋白酶(呈正相关 ; )和MPO ( ; ),这是网的组件,进一步验证cfDNA NETosis代理(图2和表3)。有趣的是,中性粒细胞弹性蛋白酶在患者明显高于严重阿基(242.6 ng / mL (IQR: 173.1 - -368.9))相比,患者没有(132.4 ng / mL (IQR: 95.8 - -218.4); )(补充数据S2和S3)。
4所示。讨论
在这个前瞻性研究中,我们观察到一个高架cfDNA严重阿基显著相关,RRT的需要,提供进一步的证据表明,血管内NETosis可能发展的一个重要因素microthrombosis和COVID-19-associated AKI。我们发现cfDNA明显与标记相关的严重COVID-19 [27),包括嗜中性、促炎细胞因子海拔,over-activation补充。在COVID-19内皮损伤是由hypercytokinemia特异表达的免疫反应,这可能是加剧了其他机制,如可能直接病毒感染内皮细胞(28]。此外,cfDNA NETosis与其他特定标记,MPO和中性粒细胞弹性蛋白酶。有人建议网可能作为内皮损伤病理之间的桥梁和其他形式的蓝玉,补体激活等造血细胞transplant-associated TMA (29日]。最近,NETosis提出关键的罪魁祸首之一的终末器官损害pathomechanism COVID-19 [30.,31日]。
我们观察到的负相关cfDNA ADAMTS13: VWF比率,一个标记与COVID-19严重程度和严重的阿基,连同与LDH正相关,铁蛋白,结合珠蛋白,建议二次TMA的照片。多个进程之间的交互背后VWF、ADAMTS13和cfDNA /网。总之,NETosis ADAMTS13活动的减少将导致通过氧化等机制,citrullination,蛋白质水解,绑定VWF竞争32]。最终,这可能会导致高架VWF: Ag)和传播的超大型VWF多聚体,促进血栓形成(32]。这种多聚体也可以招募和激活中性粒细胞,加强NETosis和进一步加剧thromboinflammation,在无情的循环32]。我们还观察到显著正相关性与补充cfDNA组件C3a C5a, Scb5-9。鉴于补充系统之间的交互和中性粒细胞,我们怀疑这两个组件之间的串扰的先天免疫导致补overactivation和驱动器NETosis代self-amplifying循环,最终凝血通路的激活和内皮损伤,从而进一步加剧thromboinflammation和组织损伤。
体外研究证明的能力SARS-CoV-2激活NETosis在人类中性粒细胞(33]。总的来说,NETosis是一个重要的控制和消灭病原体的免疫机制。病毒已经演示了通过toll样受体激活中性粒细胞(通常)4、7和8,导致释放活性氧和蚊帐,以及通过阻塞干扰病毒复制的蛋白激酶C通路(34]。然而,过度NETosis会导致微血管血栓形成和组织损伤。血管内网可以激活接触途径和提高凝固的外在途径通过TF表达同时扰乱抗凝血剂的功能,如抗凝血酶和TF通路抑制剂(35- - - - - -38]。
本研究受限于一个相对比较小的样本大小,同时加强富人生物标记测量在这个队列的集合,允许评估cfDNA与多个系统的交互。有趣的是,我们发现了一个统计学无意义的血小板计数和cfDNA之间负相关( )。考虑到边缘价值,我们认为,这可能与样本的时间测量,这是表现在这项研究中相对在发病的早期,起初表示埃德。我们怀疑血小板水平与疾病进展将继续下降,进一步研究评估这些协会获得样品后的疾病,在更大的群体,是必要的。
疑似突出作用的内皮损伤和微血管血栓形成的病理和临床结果COVID-19,这NETosis可以作为多个系统之间的一座桥梁驾驶multiorgan受伤,网新临床试验可能是一种有吸引力的目标。迄今为止,治疗SARS-CoV-2感染仍然有限,考虑到多因子的严重疾病的病理,确定有效的治疗目标是具有挑战性的。事实上,药物干扰NETosis这个病理过程可能桥多系统损伤,如潘生丁(39和肝素40),在早期研究表明承诺。此外,许多其他药物,干扰可用网(34]。迫切需要进一步的研究来理解的角色NETosis COVID-19和评估治疗途径针对这一过程。
5。结论
高架cfDNA明显严重的阿基与RRT的需要,提供进一步的证据表明,血管内NETosis可能发展的一个重要因素microthrombosis和COVID-19-associated AKI。迫切需要进一步的研究来理解的角色NETosis COVID-19和评估治疗途径针对这一过程。
数据可用性
期间生成的数据集和/或分析在当前研究并不公开由于病人隐私和机密性,但可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者没有利益冲突的声明。
补充材料
补充图S1:散点图的DNA (cfDNA)浓度和游离TMA生物标志物。蓝色的点线表示线性协会。与C3a cfDNA被发现呈正相关( ; ),C3a / C3比( ; ),Scb5-9 ( , ),TMAIL-6 ( ; ),LDH ( ; ),铁蛋白( ; ),纤维蛋白原( ; ),VWF ( ; ),并结合珠蛋白(HAPT) ( ; ?)与ADAMTS13呈负相关( ; )。补充图S2:协会之间的弹性蛋白酶和MPO水平测量在演示的ED和发展严重的阿基或RRT的必要性。只有弹性蛋白酶水平明显不同根据发展严重的阿基(A), MPO和弹性蛋白酶的水平显示增高无统计学意义的趋势和发展严重的阿基需要RRT (B, C, D)。补充图S3:接受者操作特征曲线(ROC)的弹性蛋白酶和髓过氧化物酶(MPO)的发展严重的阿基或RRT的必要性。弹性蛋白酶,曲线下面积(AUC) = 0.72(95%置信区间:0.55—-0.89)需要严重的阿基,(AUC) = 0.7(95%置信区间:0.53—-0.87)需要RRT (A, B);MPO、曲线下面积(AUC) = 0.602(95%置信区间:0.4—-0.82)需要严重的阿基,AUC = 0.71(95%置信区间:0.49—-0.93)需要RRT (C, D)。(补充材料)