文摘

一个集成的方法结合网络药理学和体内实验进行研究辣椒素的治疗机制对急性肺损伤(Cap)。潜在的关键基因和信号通路参与帽的疗效预测的网络药理学分析。此外,组织学评估、ELISA和RT-qPCR进行确认行动涉及治疗效果和潜在机制。我们的发现表明TNF、il - 6、处于CXCL2, CXCL10前50名基因的一部分。富集分析显示,这些潜在的基因在肿瘤坏死因子信号通路和丰富IL-17信号通路。在活的有机体内实验结果表明,帽缓解组织病理学变化,减少炎症细胞和炎症细胞因子,渗透和提高抗氧化酵素活动支气管肺泡灌洗液(BALF)。此外,帽治疗有效地表达下调TNF、il - 6, NF -κB处于CXCL2, CXCL10肺部组织。因此,我们的研究结果表明,帽子有疗效LPS-induced在新生儿急性肺损伤大鼠通过抑制肿瘤坏死因子信号通路和IL-17信号通路。

1。介绍

急性肺损伤的初始阶段是整个急性呼吸窘迫综合征的病理进程。这也是一个致命的炎症综合征死亡率和发病率高(1]。急性呼吸窘迫综合征是更严重的急性肺损伤的表现,它的特点是肺部炎症,肺水肿,弥漫性肺泡损伤,增加中性粒细胞浸润[2,3]。新生儿,尤其是早产儿,易患急性肺损伤,这是新生儿死亡最常见的原因之一(4,5]。此外,据报道,不受控制的肺部炎症参与了急性肺损伤的病理过程在婴儿6]。迄今为止,目前没有有效的治疗策略减少急性肺损伤的死亡率和发病率7]。因此,它是非常迫切需要开发一个有效的药物治疗急性肺损伤。

脂多糖(LPS)是一个致病的革兰氏阴性细菌内毒素促进炎性细胞因子的产生和活性氧(8]。先前的报道表明,细菌有限合伙人管理新生儿老鼠可能导致炎症损伤的新生儿肺9,10]。因此,有限合伙人已被广泛用作诱导的急性肺损伤肺损伤模型的建立11,12]。一些信号通路参与LPS-induced急性肺损伤的发病机制,这是密切相关的氧化应激和炎症反应的调控8]。积累的报告表明,有限合伙人可能会引发肺部炎症通过激活核factor-kappa (NF - BκB),导致过度的促炎细胞因子il - 6和TNF -α(13,14]。随后,这些炎性细胞因子可能进一步导致肺组织内皮和上皮细胞损伤。因此,抑制肺促炎细胞因子水平可能是一个有效的治疗策略的预防和治疗新生儿急性肺损伤。

辣椒素(Cap)是辣椒的活性成分,已被广泛研究的多种药理活性,包括镇痛,抗炎,抗氧化剂,生理调节,antilithogenic,心血管和抗癌的效果15,16]。先前的报道表明,帽施加chemopreventive效应对肺部致癌作用通过减少炎性细胞因子的表达(17]。帽预处理可以降低肺动脉高血压通过抑制肺部炎症(18]。然而,帽对LPS-induced急性肺损伤的疗效尚未报道。

在目前的研究中,网络药理学方法用来预测潜在的关键基因和信号通路的帽子在急性肺损伤的治疗。此外,我们建立了一个新生儿急性肺损伤大鼠模型进一步验证治疗急性肺损伤机制的上限。

2。材料和方法

2.1。预测目标基因的帽子

“辣椒素”关键字搜索PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载2维结构。然后,收集帽子的潜在基因从SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)和数据库(挤http://ctdbase.org/)。

2.2。肺损伤的靶基因的集合

“肺损伤”关键字搜索在数据库,供(http://ctdbase.org/)和GeneCards数据库(http://www.genecards.org)收集疾病相关基因。然后,两个数据库之间的重复基因整合,和收集到的基因被确定为肺伤害有关的基因。最后,十字路口Cap-related基因的基因和肺部伤害有关的基因被定义为潜在的治疗基因对肺损伤的限制。

2.3。PPI网络的建设

常见的基因导入到数据库(字符串https://www.string-db.org/),信心得分被设置为0.9,该物种是智人。然后,TSV格式下载并导入Cytoscape软件(3.8.0)。Cytoscape CytoHubba插件的屏幕用于网络的关键基因。

2.4。动物

动物实验操作都严格按照指南进行批准的南方医科大学动物保健和使用委员会制度。Sprague-Dawley新生儿老鼠(10到16 g体重和4 - 8天)获得动物实验中心的广东省和安置在一个特定的无菌环境标准条件(湿度55 - 60%,20 - 22°C的温度,和黑暗12 h /光周期)。所有的动物都被允许免费的水和食物随意。

2.5。实验动物模型和药物干预

所有的老鼠被随机分为对照组和实验组四( ):脂多糖(LPS)组(3毫克/公斤的腹腔内注射LPS诱导急性肺损伤),有限合伙人+ 2毫克/公斤帽集团有限合伙人+ 4毫克/公斤帽集团和有限合伙人+ 8毫克/公斤的帽子。有限合伙人曝光后,模型的大鼠组皮下注射帽每日连续八天。有限合伙人(大肠杆菌055:从Sigma-Aldrich B5)获得,剂量的选择是基于以前的报告(10]。帽在目前的研究中使用的剂量是根据以前的报告和我们的初步实验19]。最后帽干预24 h后,新生儿老鼠牺牲通过腹腔内注射戊巴比妥(50毫克/公斤)。肺组织收集并存储在-80°C的分析。

2.6。肺组织的组织学评估

肺组织和4%多聚甲醛固定。组织样本使用一系列浓度的乙醇脱水。脱水样本嵌入石蜡,然后切成5μ米厚的部分。然后,部分使用hematoxylin-eosin试剂染色,在显微镜下观察到。

2.7。评价肺部水肿

收集到的肺组织与冰0.9%生理盐水冲洗,用滤纸干。然后,肺组织立即重获取湿重。肺组织被烤干70°C 48 h,重又获得干重。最后的价值 计算评价肺部水肿。

2.8。测量炎症细胞和炎症细胞因子渗透的支气管肺泡灌洗液(BALF)

实验后,BALF制备基于前面的研究(20.]。BALF离心机在1500克15分钟在4°C,和上层清液收集获取渗入细胞。然后,沉积物细胞resuspended冰0.9%生理盐水和沾Wright-Giemsa染色(建成生物工程研究所,中国)。在显微镜下细胞数使用血细胞计数器。炎性细胞因子(TNF -α、il - 6和il - 1βBALF)水平测定每个制造商的协议使用商业套装(建成生物工程研究所,中国)。

2.9。测量的蛋白质浓度、MPO活性和抗氧化酵素的活动

总蛋白水平BALF决心使用bicinchoninic酸蛋白质工具包基于制造商的协议(建成生物工程研究所,中国)。肺组织均质在冰0.9%盐水然后在10000 g离心10分钟在4°C。上层清液收集,MPO活性和抗氧化的酶活性(SOD及谷胱甘肽)测量每个制造商的协议使用商业套装(建成生物工程研究所,中国)。

2.10。定量rt - pcr

肺组织的总RNA提取使用试剂盒是基于制造商的指令(美国TIANGEN)。2μg孤立的RNA reverse-transcribed进cDNA使用互补脱氧核糖核酸合成装备(美国热费希尔)基于制造商的协议。然后,使用SYBR qPCR由绿色主人混合(美国热费希尔)LightCycler rt - pcr系统(美国罗氏诊断)。的 方法被用来量化mRNA表达水平。引物的补充文件表所示S1。

2.11。统计分析

值表示为 (SD)。GraphPad 5软件被用来执行统计分析。统计学意义的差别组测量单向方差分析Dunnett紧随其后的多重比较检验。一个 值低于0.05代表一个显著差异。

3所示。结果

3.1。识别潜在目标的帽子

帽的2 d化学结构呈现在图1(a)。基于SwissTargetPrediction和CTD数据库,收集621的潜在基因帽后删除重复的基因。

(一)
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(b)
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图1
潜在的基因对急性肺损伤的限制。帽(a)的化学结构。维恩之间的映射目标基因从帽和肺损伤(b)。
3.2。识别和分析已知的急性肺伤害有关的基因

删除重复的基因后,总共有28815个基因来自CTD和GeneCards数据库。然后,621潜在基因帽加上28815急性肺伤害有关的基因用维恩工具来识别潜在的基因对急性肺损伤的限制。如图1(b), 619个常见基因被确定,可能代表了潜在的基因治疗急性肺损伤与帽,如图2,PPI网络的潜在基因帽作用在急性肺损伤是由字符串构造数据库。


图2
PPI网络的建设对急性肺损伤的帽子。
3.3。炎症相关的基因的识别

如图3,排名前50的基因筛查帽对急性肺损伤的关键目标。他们中的大多数是炎症相关的基因,如CXCL8,趋化因子受体CXCR4,处于受控,CXCL2, il - 6, CXCL10, CCL20, CCL19, 2、TNF。结果表明,炎症反应可能的机制之一在急性肺损伤的治疗。


图3
PPI网络的前50名潜在的基因。随着目标基因的程度增加,颜色变暗和圆就更大了。
3.4。功能富集分析的关键目标

KEGG去富集分析探讨相应的病理过程帽关键基因在急性肺损伤的治疗。如图4(一)十大信号通路筛选和泡沫地图构建。特别是,TNF、il - 6、处于CXCL2,和CXCL10主要富集在炎症通路,如IL-17和肿瘤坏死因子信号通路(补充文件表S2)。因此,这些炎症相关的基因被选在接下来的动物实验和验证。

(一)
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(b)
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图4
泡沫浓缩地图分析:(a) KEGG富集分析帽对急性肺损伤(十大上市);(b)去浓缩分析帽对急性肺损伤(十大上市)。

如图4 (b),十大生物过程是筛选和泡沫地图了。结果表明,多个生物过程参与急性肺损伤的治疗,如脂多糖,反应分子的细菌来源,对机械的刺激做出反应,积极应对外部刺激,监管和应对细菌,这些炎症相关的基因密切相关。

基于网络药理学的研究,我们进一步进行在活的有机体内实验来验证限制作用在急性肺损伤的治疗效果。

3.5。帽缓解LPS-Induced在新生大鼠急性肺损伤

)染色进行评估帽的防护效果,如图5(一个)在对照组肺组织显示,正常肺结构。相反,新生儿的老鼠模型组受到有限合伙人展示清晰和明显的组织病理学改变,如肺泡出血,炎症细胞浸润,肺泡壁水肿。然而,这些病理特征是不同程度的缓解治疗帽(4和8毫克/公斤)。特别是在有限合伙人+帽(8毫克/公斤),肺泡明显恢复与轻微的病理形态学变化。如数据所示5 (b)- - - - - -5 (d)湿/干重比、BALF的总蛋白质,MPO活性显著增加有限合伙人管理后与对照组相比。所有这些异常是逆转治疗不同程度的帽子(4和8毫克/公斤),特别是在有限合伙人+帽。然而,低剂量的限制(2毫克/公斤)不影响LPS-treated新生儿肺损伤的老鼠。

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图5
上限的影响实验急性肺损伤肺损伤动物模型。(一)代表)染色(放大200倍)每组的肺组织。(b)每组肺湿/干重比。(c) BALF中总蛋白质含量。(d)在肺组织MPO的活性。结果表示为 ( )。 # # 相对于对照组; 和 相比LPS组。
3.6。帽治疗减少炎性细胞聚集在新生儿急性肺损伤大鼠

LPS刺激据报道诱导强烈的炎症反应。在目前的研究中,我们测量了水平的炎症细胞计数BALF调查潜在的保护帽对肺损伤的影响通过抑制炎症积累进入肺泡。如图6,总细胞、中性粒细胞和巨噬细胞测定对照组。相反,新生大鼠LPS-exposed显示明显的积累总细胞,中性粒细胞,巨噬细胞,表明模型组炎症反应的存在。渗透到炎症细胞的数量都在不同程度上降低了治疗帽(4和8毫克/公斤),特别是在有限合伙人+帽(8毫克/公斤)。然而,低剂量的限制(2毫克/公斤)并没有减少炎性细胞在新生大鼠LPS-treated积累。

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图6
帽可以抑制炎性细胞聚集在新生儿急性肺损伤大鼠。总细胞的数量(a),中性粒细胞(b)和BALF中巨噬细胞(c)。结果表示为 ( )。 # # 相对于对照组; 和 相比LPS组。
3.7。帽治疗抑制炎性细胞因子的分泌新生儿急性肺损伤大鼠

在我们的研究中,BALF的促炎细胞因子,包括TNF -α、il - 6和il - 1β,测量使用商业套装,进一步证明新生儿上限的抗炎作用与急性肺损伤大鼠。如图7LPS组,肿瘤坏死因子的水平α、il - 6和il - 1β明显高于对照组。炎性细胞因子的水平都在不同程度上降低了治疗帽(4和8毫克/公斤),特别是在有限合伙人+帽(8毫克/公斤)。然而,低剂量的限制(2毫克/公斤)没有减少这些炎性细胞因子水平LPS-treated新生儿老鼠。这些结果暗示帽LPS-evoked减轻炎症反应,抑制炎性细胞的招聘和促炎细胞因子分泌减少。

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图7
帽抑制促炎细胞因子的释放在新生儿急性肺损伤大鼠。肿瘤坏死因子的水平α(一)、il - 6 (b)和il - 1βBALF中(c)。结果表示为 ( )。 # # 相对于对照组; 和 相比LPS组。
3.8。帽治疗改善新生儿急性肺损伤大鼠的抗氧化酵素活动

如图8LPS组,SOD的活动及谷胱甘肽显著低于对照组。抗氧化酵素的活动都在不同程度上提高了治疗帽(4和8毫克/公斤),特别是在有限合伙人+帽(8毫克/公斤)。然而,低剂量的限制(2毫克/公斤)没有改善抗氧化酵素活动LPS-treated新生儿老鼠。基于这些结果,高剂量的上限(8毫克/公斤)选择在接下来的实验。

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图8
上限提高抗氧化酶的活动在新生儿急性肺损伤大鼠。SOD的含量(a)和BALF中谷胱甘肽(b)。结果表示为 ( )。 # # 相对于对照组; 相比LPS组。
3.9。帽治疗新生儿中表达下调炎症相关的基因表达与急性肺损伤大鼠

据报道,炎症参与了急性肺损伤的发病机制和进展21]。在目前的研究中,候选人上限目标(TNF、il - 6,处于受控,CXCL2 CXCL10)被发现在中存在的网络药理学分析进一步验证实验。如图9,LPS组il - 6, NF - TNF的表达κB处于CXCL2, CXCL10显著高于对照组。帽治疗TNF的表达,使之抑制il - 6, NF -κB处于CXCL2, CXCL10 LPS-treated新生儿老鼠。

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图9
上限下调炎症相关的基因表达在新生儿急性肺损伤大鼠。肿瘤坏死因子(a)的mRNA表达,il - 6 (b), NF -κB (c),处于受控(d), CXCL2 (e)和CXCL10 (f)在肺部组织。结果表示为 ( )。 # # 相对于对照组; 和 相比LPS组。

4所示。讨论

急性肺损伤是一种炎症性疾病预后不良和困难的治疗(22]。以前的报告显示,急性肺损伤的发病机制是伴随着功能性细胞凋亡,系统性炎症、肺部免疫内稳态的障碍,导致濒危的生命和器官衰竭(23]。急性肺损伤是一种耐火材料与高死亡率和呼吸道疾病发病率高,给社会和家庭带来的负担。虽然一些药物在急性肺损伤中发挥抗炎作用,这些药物还没有被翻译成临床治疗和使用目前仅限于协助肺疾病管理(24,25]。因此,有必要开发新颖和有效的治疗药物治疗急性肺损伤。

有限合伙人源于革兰氏阴性细菌的细胞壁,引起组织损伤和水肿、促炎细胞因子的过度生产,炎性细胞浸润(26]。因此,LPS-induced急性肺损伤是一个理想的和可靠的动物模型研究相关的肺炎的疾病。帽是辣椒的活性成分,它吸引了更多的关注其各种生理活动(15,16]。帽施加chemopreventive效应对肺部致癌作用通过下调炎性细胞因子的表达(17]。因此,我们推测,帽子也可能炎性肺疾病的治疗效果。在目前的研究中,网络药理学和动物实验是用来调查限制急性肺损伤的治疗效果。

首先,我们使用网络药理学方法筛选的潜在目标和信号通路在急性肺损伤的治疗。PPI网络的结果显示,619潜在的目标上限有至关重要的作用在急性肺损伤的治疗,和一些inflammatory-related基因,如CXCL8,趋化因子受体CXCR4,处于受控,CXCL2, il - 6, CXCL10, CCL20, CCL19, 2,和肿瘤坏死因子,筛选对急性肺损伤治疗密切相关限制。此外,KEGG富集分析显示,IL-17和肿瘤坏死因子信号通路帽对急性肺损伤的重要途径。接下来,一个动物实验进一步证实,帽减轻肺损伤通过抑制促炎的一代新生儿急性肺损伤大鼠。

急性肺损伤的发病机制之一是炎症反应的失衡恶化内皮和上皮细胞的损伤27,28),导致肺泡蛋白质含量的增加(29日]。组织学检查急性肺损伤的特点是肺纤维化的形成,alveolar-capillary通透性增加,大量肺泡上皮细胞的凋亡和严重急性炎症反应30.]。此外,促炎细胞因子的释放,过多的中性粒细胞迁移,破坏alveolar-capillary膜完整性也急性肺损伤的主要表现细胞病理学(31日- - - - - -33]。它已经表明,中性粒细胞和巨噬细胞的主要来源是多种炎性细胞因子在肺损伤的发生和发展。在LPS刺激,大量的中性粒细胞积聚在肺部毛细血管被激活,释放细胞毒性成分,导致肺细胞损伤34,35]。以前的报告显示,T淋巴细胞和中性粒细胞促进肺部疾病的发展36]。MPO、酶促炎主要是由激活中性粒细胞生成,它可以促进炎症恶化,延长。先前的研究已经表明,肺组织的MPO活性通常被认为是一个生物标志物的中性粒细胞浸润37]。在目前的研究中,肺组织的组织病理学变化引起的有限合伙人被盖好恢复治疗。新生大鼠肺水肿和MPO活性与急性肺损伤也减轻了。此外,肺部炎症改善了帽,可以减少中性粒细胞和巨噬细胞,抑制炎性细胞因子的分泌。

多种炎症介质在肺组织的急性肺损伤模型,和TNF IL-17信号通路参与释放促炎细胞因子(11,38]。肿瘤坏死因子-α,主要在生物促炎介质,促进巨噬细胞的激活和肺内皮细胞,引起炎症反应39]。il - 6的促炎介质释放在急性肺损伤和主要是由先天免疫系统生成。先前的报道表明,pulmonary-derived白介素诱发特发性肺炎综合征通过促进Th17细胞分化40]。在LPS刺激,代化学引诱物处于受控/ CXCL2发起招募中性粒细胞的早期阶段(41]。中性粒细胞被处于到受感染的组织,消除病原体在急性肺损伤42]。CXCL2主要是在居民中肺泡巨噬细胞在LPS-induced肺损伤(43]。基因CXCL10被确认为一个潜在的生物标志物的诊断和治疗急性呼吸窘迫综合征(44]。NF -κB,上游转录因子,唤起许多基因参与炎症、细胞粘附和免疫调节45]。以前的报告表明NF -κB激活涉及LPS-induced急性肺损伤(46]。此外,氧化应激是重新考虑另一个诱导物与肺损伤的进展(47]。据报道,有限合伙人治疗引起活性氧的生成和炎性细胞因子,从而导致急性肺损伤的小鼠模型(48]。因此,任何成分,抑制炎症和氧化应激可能与肺损伤起到治疗作用。在这个实验中,帽治疗预防促炎细胞因子的分泌,改善抗氧化酶的活动,并抑制upregulation TNF、il - 6, NF -κB,处于受控,CXCL2 CXCL10 LPS引起的,这表明TNF和IL-17信号通路对急性肺损伤治疗帽很重要。因此,这些结果表明,限制有效地阻止了肺部炎症和氧化应激控制急性肺损伤发展和验证网络药理学的结果。

5。结论

总之,本研究初步预测的潜在基因和信号通路帽通过网络药理学减轻急性肺损伤。与此同时,我们进行了动物实验,证实网络药理学的结果。这些结果提供了一个科学依据急性肺损伤的预防和治疗。

数据可用性

用来支持研究的数据可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

补充材料

表S1:引物序列用于定量实时PCR。表S2: KEGG浓缩的结果分析。(补充材料)