文摘

溃疡性结肠炎(UC)是一个复杂的炎症性肠病(IBD)与线粒体功能相关。Atractylenolide III (III)是一种天然产品与抗炎作用。这项工作的目的是探讨在三世的保护作用在加州大学和它的底层机制。,葡聚糖硫酸酯钠- (DSS)诱导的小鼠和脂多糖(LPS)刺激肠道上皮细胞(IEC-6)是用来模拟UC病态在活的有机体内和在体外。在DSS-induced老鼠,结果表明,三世显著逆转人体体重,减少结肠长度、疾病活动指数(DAI)增加,和组织学损伤。生产减少促炎因子和抗氧化剂在三世结肠炎被抑制。此外,我们证明了在三世减毒肠上皮屏障的破坏和线粒体功能障碍引起的DSS,类似在体外导致LPS-treated IEC-6细胞。p-AMPK的蛋白质含量,SIRT1, PGC-1α随着乙酰化PGC-1α在三世也调节了吗在活的有机体内和在体外。总之,这些研究结果支持在三世可能防止线粒体功能异常的激活AMPK / SIRT1 / PGC-1α信号通路在加州大学的发展。

1。介绍

溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性复发性炎症性肠病(IBD)由多种因素引起的,如环境、基因和immunoregulator [1,2]。嗜中性粒细胞浸润,上皮损伤特征是微生物易位,和炎症条件是加州大学的重要特征3]。然而,加州大学的发病机制仍需要进一步探讨。

证明了线粒体变化是细胞生理学在加州大学发展的关键枢纽(4]。例如,减少线粒体超微结构破坏和复制显示病变的加州大学(5,6]。线粒体电子传递链复杂的活动也在UC患者或改变小鼠模型(7,8]。此外,越来越多的证据表明上皮屏障功能障碍可能归因于线粒体异常结肠炎(9]。何鸿燊等人证明凋亡导致线粒体损伤和损失增加的mro生产导致结肠炎上皮屏障功能障碍(10]。众所周知,proliferator-activated受体-γ共激活剂1 -α(PGC-1α)是线粒体生物起源的关键调节器和功能(11]。减少PGC-1α肠上皮的加州大学重要的线粒体损伤引起,上皮屏障损伤和炎症12]。因此,有必要在结肠炎发展说明线粒体功能的作用。

Atractylenolide III (III)的一个主要从根提取物的生物活性化合物白术macrocephalaKoidz,抗炎、神经保护和gastroprotective属性(13- - - - - -15]。几项研究表明,在三世抑制TNF -的生产α,进气阀打开,il - 6 (16,17]。歌等人证明在三世保持骨骼肌细胞的能量代谢,防止肥胖和2型糖尿病(18]。此外,在三世也抑制小胶质线粒体分裂在缺血性损伤19]。然而,无论是在三世防止UC进展尚不清楚。

葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠被认为是一个理想的模型由于其相似人类UC的生理学、解剖学、和免疫系统20.]。脂多糖(LPS)是一个已知的诱导肠上皮屏障功能障碍(21,22]。因此,本研究旨在探索在实验性结肠炎III的潜在影响和潜在机制使用DSS-induced老鼠在活的有机体内和LPS-stimulated IEC-6细胞在体外。

2。材料和方法

2.1。动物

所有动物都关心按照指南的护理和使用实验动物。道德的动物实验伦理委员会批准了第一附属医院,黑龙江中医药大学。

八周大C57BL / 6 j雄性老鼠(20 g)是购自北京HFK生物科学有限公司有限公司(中国,北京)和保持在标准实验室条件下12 h光/暗周期 45 - 55%湿度。所有的老鼠可以免费获得获得标准鼠食物饮食和无菌水。启动的实验中,五个每个笼子里的老鼠被安置和美联储自适应了一个星期。

2.2。溃疡性结肠炎动物模型的感应

小鼠随机分为5组:对照组,DSS集团DSS + SASP组,DSS + III (L)集团,DSS + III (H)集团。总之,老鼠收到3% DSS (160110 MP生化药剂,圣安娜、钙、美国)饮用水中连续7天建立UC模型。药品监督管理局、DSS老鼠注射5毫克/公斤或10毫克/公斤III (A2987 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)通过尾静脉7天每天一次。此外,老鼠在DSS + SASP组管理着200毫克/公斤/天柳氮磺胺吡啶(SASP;S129986,阿拉丁,中国上海)口服连续7天。SASP被用作积极控制药物。控制老鼠收到相同数量的水没有DSS。

在实验中,所有笼子的铺垫材料同时改变环境因素的影响降到最低。所有的动物体重和健康监测每天的迹象。同时,粪便一致性和直肠出血记录来评估疾病活动指数(DAI)得分如前所述[23]。最后,老鼠( 每组)被使用150毫克/公斤牺牲戊巴比妥钠腹腔内,冒号和收获作进一步调查。

2.3。Hematoxylin-Eosin(圆))染色

冒号的老鼠在4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡,然后切成5μ米厚的部分。与苏木精染色的部分(H8070 Solarbio,中国北京)5分钟,伊红(A600190 Sangon,中国上海)3分钟。图像在显微镜下观察(BX53、奥林巴斯、东京、日本)100 x放大。盲目组织学评估分数评估水平的结肠炎被Banerjee et al。(24]。

2.4。免疫组织化学

与石蜡切片进行免疫组织化学分析如上所述。deparaffinized部分患者在乙醇和加热抗原检索柠檬酸缓冲了10分钟。阻塞后山羊血清(SL038 Solarbio)在室温下15分钟,部分是探索与主抗体髓过氧化酶(MPO;1:50,A1374 ABclonal,武汉,中国在4°C)一夜之间,其次是二级抗体(1:500,# 31460,热费舍尔,匹兹堡,PA,美国)孵化为60分钟37°C。片在民建联培养试剂,用苏木精复染色。最后,组织部分被认为在400倍显微镜放大。

2.5。MDA测定谷胱甘肽含量和SOD活性

蛋白质从均质结肠组织量化使用BCA蛋白质分析工具包(P0009 Beyotime,中国上海),准备确定浓度的丙二醛(MDA);A003-1、南京建成生物工程研究所、中国南京)、谷胱甘肽(谷胱甘肽;A006-2、南京建成生物工程研究所),以及活动的超氧化物歧化酶(SOD;A001-1、南京建成生物工程研究所)。

2.6。细胞培养和治疗

大鼠肠上皮细胞株IEC-6细胞(钟山周巧鑫生物技术有限公司,上海,中国)在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM;美国SH30027 HyClone,洛根,UT)包含10μ胎牛血清(g / ml胰岛素和10%的边后卫;04 - 011 - 1 - a, BI,基布兹Beit-Haemek,以色列)与5%孵化器有限公司₂在37°C。细胞治疗50μg / ml有限合伙人(L2630 Sigma-Aldrich) 12 h在加州大学模拟肠道上皮细胞损伤。此外,IEC-6细胞治疗在三世(80μ米)仅为24小时或III(40或80μ米)有限合伙人治疗前12 h。

2.7。肠道通透性测定

为在体外渗透率测定,细胞被播种在参议院的密度 每口井。治疗后,IEC-6单层细胞培养在1毫克/毫升FITC-dextran 20 (FD20, TdB实验室,乌普萨拉,瑞典)。解决方案(100μl)收集从基底室在60,120,180,或240分钟,分别和荧光强度测量。

2.8。JC-1化验

IEC-6细胞的线粒体膜电位(MMP)确定使用JC-1 (5, 5 ,6、6 - - - - - -Tetrachloro-1 1 ,3,3 - - - - - -tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine碘)测定。总之,IEC-6细胞孵化为0.5毫升JC-1染色工作方案(C2006 Beyotime) 37°C为20分钟。洗后JC-1缓冲区(1×)细胞收集使用流式细胞分析仪测定MMP (NoyoCyte Aceabio,圣地亚哥,美国)。

2.9。测定复杂我第四和复杂的活动

结肠组织或IEC-6细胞被用来评估复杂的活动我和复杂的IV。蛋白质样品提取量化,然后准备评估线粒体电子传递酶的活动使用的复杂活动分析工具包(BC0510 Solarbio)和复杂的第四活动分析工具包(BC0940 Solarbio)。

2.10。免疫荧光

免疫荧光分析,组织部分准备正如上面提到的,和细胞幻灯片被封锁在山羊血清。随后,结肠部分或细胞幻灯片是孵化主要抗体occludin (1: 100;A2601 ABclonal) ZO-1 (1: 100;AF5145、亲和力、常州、中国)或Tom20 (1: 50;一夜之间A18047 ABclonal)在4°C。然后,一个FITC-labeled山羊anti-rabbit IgG抗体(1:200;A0562 Beyotime)或Cy3-labeled山羊anti-rabbit IgG抗体(1:200;A0516 Beyotime)用于标签组织部分或细胞在室温下幻灯片。与DAPI染色后(D106471阿拉丁),组织部分或细胞幻灯片使用显微镜观察。

2.11。定量实时聚合酶链反应

总RNA在细胞或结肠组织中分离使用RNA简单总RNA工具包(RP1201 BioTeke,中国北京)和量化2000纳米(热费希尔)。然后,超级M-MLV逆转录酶(2641 a,豆类,北京)准备转录rna相对地的互补。实时定量PCR (qPCR)进行分析Exicycler™96仪器(BIONEER、大田、韩国)使用SYBR绿色试剂(EP1602 BioTeke)。相对mRNA的表达是计算使用方法和衡量mRNA的比率β肌动蛋白。引物序列表中列出1。

2.12。mtDNA量化

线粒体DNA (mtDNA)结肠组织或IEC-6细胞提取线粒体DNA隔离设备(K280-50 BioVision,苗必达,CA,美国)。表列出特定的引物1。相对量化mtDNA被mtDNA比测量β球蛋白使用qPCR分析。

2.13。免疫印迹

完整的细胞溶解产物提取使用里帕溶解产物(P0013B Beyotime)和量化BCA蛋白质化验设备。等量的蛋白质样本通过sds - page和转移到PVDF膜分离。在5% BSA阻塞后,膜与初级孵化抗体在一夜之间在4°C。随后,免疫印迹和二次孵化的抗体为40分钟37°C和可视化使用西方ECL衬底(E003 7海洋生物技术,上海,中国。

所有抗体都是如下:Occludin (1: 1000;A2601 ABclonal) ZO-1 (1: 1000;PGC-1 A0659 ABclonal)α(1:1000;A17089 ABclonal) NRF-1 (1: 1000;A5547 ABclonal) NRF-2 (1: 1000;A0674 ABclonal) Tfam (1: 1000;A13552 ABclonal), AMPK (1: 1000;AF6423亲和力),p-AMPK (1: 1000;AF3423亲和力),SIRT1 (1: 1000;A11267 ABclonal),β肌动蛋白(1:2000;60008 - 1 - ig Proteintech,武汉,中国),山羊anti-mouse IgG抗体(1:10000;SA00001-1 Proteintech),和山羊anti-rabbit IgG抗体(1:10000;SA00001-2 Proteintech)。

2.14。免疫沉淀反应试验

提取的蛋白质与1孵化μg PGC-1α美国圣克鲁斯抗体(sc - 518025)在一夜之间在4°C,然后孵化与琼脂糖珠蛋白在4°C 2 h。之后,免疫沉淀物收集并进行sds - page进一步免疫印迹分析特定的抗体:乙酰赖氨酸抗体(1:1000;)和PGC-1 DF7729,亲和力α抗体(1:1000;A17089 ABclonal)。

2.15。统计分析

数据表示为 (SD)和分析利用GraphPad Prism 8.0。单向或双向重复方差分析(方差分析)其次是Bonferroni多重比较测试是用来评估多个组之间的统计学意义。组织学评分各组之间的差别是决定利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验以下邓恩的多重比较检验。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。在老鼠的三世防止DSS-Induced加州大学

DSS-induced小鼠建立探索三世在加州大学的影响。如图1(一)戴,被质疑DSS老鼠表现出显著增加分数从3^{理查德·道金斯}在第三天,恢复了或SASP治疗。管理在III或SASP也逆转减少体重和结肠长度引起的DSS(数字1 (b)- - - - - -1 (d))。减轻直肠出血的观察在UC小鼠治疗III或从宏观SASP冒号(图的图像1 (c))。这些结果表明三世在加州大学发展的有益作用。

3.2。第三,改善DSS-Induced炎症和氧化应激

炎症和氧化应激是加州大学的主要病理变化。组织学结果显示在III或SASP治疗显著缓解地穴损伤,炎症细胞浸润,和杯状细胞损失冒号DSS-treated小鼠(数据2(一个)和2 (b))。UC小鼠的结肠组织MPO水平也减少了在III或SASP,如图2 (c)。此外,我们注意到在III或SASP治疗显著地抑制促炎因子的upregulation UC小鼠的冒号,包括TNF -α、il - 6、cox - 2和伊诺(数据2 (d)- - - - - -2 (g))。MDA含量的增加,谷胱甘肽浓度的降低,失活冒号的SOD活性也显著逆转DSS-treated鼠III或SASP(数据2 (h)- - - - - -2 (j))。因此,数据表明,第三可能减弱炎症和氧化应激在加州大学的发展。

3.3。第三在抑制DSS-Induced肠道屏障损伤

考虑到上皮屏障损伤是一个重要的事件在加州大学的发展过程中,我们专注于研究三世在肠道上皮细胞的影响。免疫印迹结果表明occludin的蛋白质含量下降和ZO-1在UC小鼠逆转的冒号III或SASP(数据3(一个)和3 (b))。相似的变化occludin和ZO-1冒号也证明了免疫荧光染色分析(数据3 (c)- - - - - -3 (f))。它表明在三世的保护作用在加州大学的肠道屏障的破坏。

3.4。在第三变弱DSS-Induced线粒体功能障碍通过AMPK / SIRT1-Mediated PGC-1脱乙酰作用α

线粒体功能障碍是一个关键因素炎症,氧化应激,屏障的破坏。因此,在加州大学三世在线粒体功能障碍的影响主要集中在这项研究中。结果表明,三世治疗显著调节的数量mtDNA第四册,复杂的我和复杂的活动在UC小鼠的冒号(数字4(一)- - - - - -4 (c))。线粒体外膜蛋白Tom20也增加了三世(数据4 (d)和4 (e))。另外,我们观察到在三世显著逆转mitochondrial-related蛋白质的表达下降在UC小鼠的冒号,包括PGC-1α、NRF-1 NRF-2, Tfam(数字4 (f)和4 (g))。

AMPK / SIRT1信号通路被发现是PGC-1的上游α,SIRT1激活PGC-1α通过NAD⁺端依赖脱乙酰作用。然而,AMPK是否/ SIRT1信号通路介导在三世对线粒体功能的影响尚不清楚。我们证明了降低p-AMPK SIRT1蛋白质含量在冒号DSS-treated逆转了小鼠III(数字4 (h)和4(我))。此外,在三世抑制DSS-induced PGC-1乙酰化作用α在冒号(数据4 (j)和4 (k))。这些结果表明,在三世变弱的线粒体功能障碍通过激活AMPK / SIRT1-mediated PGC-1脱乙酰作用α对加州大学保护。

3.5。在三世废除在IEC-6 LPS-Induced肠道屏障损伤细胞

进一步探索在三世上皮屏障功能的影响,LPS-treated IEC-6细胞作为一个工作在体外模型。如图5(一个)第三,有效地恢复的高细胞渗透性LPS-stimulated IEC-6细胞。occludin的水平和ZO-1蛋白质在三世LPS-treated细胞增加了治疗,免疫印迹分析(数据就是明证5 (b)和5 (c)(数据)和免疫荧光染色结果5 (d)- - - - - -5 (g))。这些在体外实验证实,在三世减轻肠上皮屏障LPS诱导的损害。

3.6。在第三变弱LPS-Induced IEC-6细胞线粒体功能障碍通过AMPK / SIRT1-Mediated PGC-1脱乙酰作用α

评估的潜在机制在三世上皮屏障功能的规定,线粒体功能进一步调查在体外。类似于改变在活的有机体内,减少mtDNA拷贝数在LPS-treated细胞逆转了三世(图6(一))。JC-1染色试验表明,在三世逆转LPS-induced降低MMP IEC-6细胞(图6 (b))。电子传递链复杂活动的减少和降低线粒体蛋白质的表达LPS-treated IEC-6细胞也调节了三世(数字6 (c)- - - - - -6 (f))。此外,我们建议在三世显著激活p-AMPK SIRT1蛋白质水平和脱去乙酰基PGC-1α在LPS-treated细胞(数字6 (g)- - - - - -6 (j))。因此,这些数据暗示三世可能激活AMPK / SIRT1-mediated PGC-1脱乙酰作用α减弱肠上皮细胞的线粒体功能障碍,总结在图7。

4所示。讨论

尽管许多疗法可用于临床治疗炎症性肠病,明显的副作用是沉重负担的生活质量。因此,本研究旨在探索潜在的药物治疗UC的。我们的结果表明,三世减轻结肠炎症状,抑制炎症和氧化应激反应,和恢复上皮屏障破坏小鼠UC的冒号。实验在活的有机体内和在体外建议在三世防止肠道上皮细胞的线粒体功能异常激活AMPK / SIRT1 / PGC-1α。

炎症反应和氧化应激是UC发病机理被认为是重要的特性(25,26]。促炎细胞因子(如TNF -α,il - 1β和il - 6)和蛋白质(如伊诺和cox - 2)是加州大学(炎症过程的重要介质27,28]。MPO生产是一个关键的生物标志物的激活中性粒细胞炎症性肠病,与氧化应激有关29日]。一些报告显示,在三世抑制促炎因子(TNF的表达水平α、il - 6和il - 1β)和氧化应激因素(SOD和MDA)在活的有机体内和在体外(19,30.]。与这些研究结果一致,第三我们的研究结果表明,在抑制炎症和氧化应激在加州大学的冒号,暗示在实验性结肠炎III的保护作用。

上皮屏障的结构和功能完整性受损加重肠道炎症反应,发现与紧密连接蛋白的表达(包括ZO-1和occludin) [31日- - - - - -33]。在DSS-induced结肠炎小鼠,重要的肠道屏障的破坏和粘膜观察研究进展(34,35]。拜因等人也报告说,有限合伙人是一个常用的刺激导致研究进展和屏障破坏在肠道炎症性疾病36]。在这项研究中,我们发现在三世增加紧密连接蛋白的低水平,减少研究进展在活的有机体内和在体外。因此,它表明在结肠炎III的保护作用可能是由于维护肠道上皮细胞的屏障功能。

线粒体是细胞内double-membrane-bound细胞器,扮演一个关键的角色在炎性疾病如风湿性关节炎和加州大学(37,38]。线粒体功能的维护可能会抵消炎症,氧化应激,上皮屏障损害在结肠炎39,40]。的在体外实验表明,有限合伙人可能导致重要的肠道损伤,线粒体功能障碍(22]。然而,线粒体功能是否受三世在肠上皮屏障的保护尚不清楚。我们的研究结果表明,在冒号三世减毒的线粒体功能障碍的DSS-induced老鼠,结果类似于LPS-treated IEC-6细胞。这些发现符合发现在第三周报告的抑制小胶质细胞的线粒体功能障碍et al。19]。有趣的是,Boyapati等人发现增加mtDNA在UC患者的血浆水平41),这是与我们的结果相反在活的有机体内和在体外。一个可能的解释可能是,在组织或细胞损伤严重,大量mtDNAs释放到循环等离子体和加剧了炎性疾病。尽管在三世已经证明通过维持线粒体功能减弱上皮屏障破坏,其潜在通路仍需要更多的调查。

PGC-1α线粒体生物起源的重要调节器和功能,已被证明与核呼吸因子(NRF-1和NRF-2)激活Tfam mtDNA复制/转录(42,43]。此外,PGC-1α可能是激活AMPK, SIRT1在NAD SIRT1,脱去乙酰基⁺端依赖的方式(44,45]。在实验性结肠炎,增强PGC-1α脱乙酰作用被证明修复受损线粒体和维持肠道屏障功能12]。我们的在活的有机体内和在体外结果表明,在三世PGC-1增加α表达和提升其脱乙酰作用通过激活AMPK / SIRT1,这是符合报告骨骼肌细胞的歌曲等。18]。完全,它表明,AMPK / SIRT1 / PGC-1α可能是一个潜在通路介导的保护作用在第三实验结肠炎肠上皮细胞的线粒体功能障碍。

探索的作用机理为加州大学预防或治疗药物或天然产品,许多化学物质被广泛接受诱导UC模型,如DSS, 2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic酸(TNBS)和oxazolone (OXA) [46]。特别是DSS是加州大学的最常见的化学感应由于其可用性、实践性、再现性,这是最接近人类UC在临床方面,组织学和immunophysiological方面(47]。由于加州的复杂病因,本研究的局限之一就是DSS-induced实验性结肠炎并未完全覆盖人类UC的病理。更多的实验模型将用于未来的调查在UC III的影响及其机制。

总之,现在的工作表明,在三世预防线粒体功能障碍和改善结肠炎发展的激活AMPK / SIRT1 / PGC-1α信号通路,总结在图7。它强调了一个重要的角色在第三UC的治疗。

数据可用性

原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订,任何合格的研究人员。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

Jieru汉和李朱文昊贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金的资助(81704055)。