文摘
的目标。本研究的目的是评估使用curcumin-loaded polylactic-co-glycolic酸纳米颗粒(CUR-loaded PLGA NPs)作为治疗碘乙酸味精——(MIA)诱导膝OA。材料和方法。十八大鼠被分配到三组( ),即正常对照组接受内注射生理盐水(iai),一个OA对照组收到公司的米娅(2毫克/ 50μL)和治疗组(MIA + CUR-loaded PLGA NPs)接受iai CUR-loaded PLGA的NPs(200毫克/公斤b.wt)。结果。治疗膝OA的坏蛋NP减轻射线交替组织病理学变化,抑制血清中的upregulation interleukin-1水平β肿瘤坏死因子-α、白细胞介素- 6和转化生长因子和白细胞介素- 10”的差别,对这些基因。坏蛋NP-treated关节也减少了核factor-kappa B的mRNA表达和诱导一氧化氮合酶蛋白表达矩阵metalloproteinase-13 caspase-3。最后,CUR-loaded PLGA NP治疗减轻II型胶原蛋白的丧失,导致显著减少丙二醛水平和增加谷胱甘肽含量和超氧化物歧化酶活性相比与OA组。结论。这项研究表明,坏蛋NPs管理可以提供有效的防止MIA-induced OA和膝关节组织学变化恶化由于其抗炎,抗氧化,抗凋亡的属性。
1。介绍
骨关节炎(OA)是一种进步和退行性疾病,发生在整个关节,可以导致关节软骨变性,软骨下骨增厚,滑膜炎症、骨赘形成、和半月板变性1]。治疗OA主要分为三类:非药物治疗、药物治疗限于止痛剂和/或非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)和手术治疗2]。当前可用药物治疗OA,除了关节置换手术,本质上是缓和并不能阻碍关节软骨退化(3]。此外,长期使用非甾体抗炎药可能导致胃肠道的不良,肾和心血管效应(4]。这要求开发结构OA疾病的药物是安全的,提供缓解症状,阻碍软骨退变的进展。
姜黄素(坏蛋)(diferuloylmethane),从姜黄、获得的一种多酚化合物是一种自然可用分子anticatabolic强劲,抗氧化,抗炎,治疗风湿病的属性5- - - - - -7]。因此,坏蛋在OA治疗似乎是一种很有前途的方法。然而,坏蛋是被严格限制的治疗效率由于其低水溶性和有限的口服生物利用度(8]。然而,有研究报道,坏蛋的生物活性可以有效地增强使用纳米药物输送[9,10]。各种研究探索CUR纳米颗粒(NPs)和坏蛋封装各种物质,如脂质体和聚合物来克服其固有的缺点11,12]。Polylactic-co-glycolic酸(PLGA)被认为是一个有效的生物可降解聚合物NPs是美国食品和药物管理局批准用于药物输送系统由于其低毒性,控制和缓释特性,并与组织生物相容性和细胞(13,14]。
另一方面,药物输送的关节内的路线有很大的力量和更少的系统性副作用比口服交货(15]。因此,本研究旨在探讨可能的可行性的关节内注射(iai) CUR-loaded PLGA NPs将味精碘乙酸- (MIA)诱发膝OA在老鼠模型中。
2。材料和方法
2.1。动物
本研究使用成熟的雄性Wistar鼠体重130 - 150克,这是保存在一个标准12:12光/暗周期在通风良好的房间里。前一周启动实验中,大鼠被安置在消毒的笼子里适应了实验室的免费水和颗粒。所有方法处理、使用和安乐死的动物在这个研究中被实验动物伦理委员会认证的教师科学、Beni-Suef大学埃及和伦理授权号码是BSU / FS / 2018/15。
2.2。OA的感应
米娅从Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)和分散在无菌生理盐水。在乙醚麻醉,所有老鼠,除正常对照组,收到一个关节内注射50μL(盐水含米娅(2毫克)左侧膝关节,正如前面所描述的Ragab et al。16]。
2.3。CUR-Loaded PLGA NPs的准备
PLGA,聚丙交酯(D, L-lactide-co-glycolide):乙交酯50:50,分子量(24000),特性黏度(1.13 dL / g)和公式(C3H4O2]x[C2H2O2从Sigma-Aldrich] y,得到(圣路易斯,密苏里州,美国)。此外,姜黄素,氯仿,聚乙烯醇(PVA);MW, 30000 - 70000年),和乙醇都是购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。
利用溶剂法合成了CUR-loaded PLGA NPs solid-in-oil-in-water乳液(s / o / w)蒸发基于Niazvand发布的方法等。17]。PLGA /氯仿溶液(油相)是由溶解60毫克的PLGA 1毫升氯仿。然后,6毫克的坏蛋是添加到解决方案和用,导致固体/油乳剂。此后,乙醇和2% PVA(1: 1)被加入到乳液,用10分钟生产固体/石油/重量(s / o / w)乳液。s / o / w乳液进一步用电磁搅拌器和激动了5 - 6 h蒸发溶剂(三氯甲烷)。样品随后离心10分钟前15000克用蒸馏水冲洗3次。样品被允许冻干24 h干粉。获得的NPs是保持在4°C。
2.4。CUR-Loaded PLGA NPs的表征
CUR-loaded PLGA NPs的表面形态是研究用扫描电子显微镜(蔡司500 VP分析FE-SEMσ,德国卡尔蔡司)和x射线衍射(XRD)分析(模型没有:202964年,Pananlytical苍天公司)。此外,他们的电动电势和大小被莫尔文(莫尔文仪器有限公司)方法后Moaty et al。18]。
2.5。实验设计
图中描述1,老鼠被随机分配到三组( )。(0)14、18、22、26天,正常对照组50 iai公司了μL盐水进入左侧膝关节,而其他两组收到iai公司的米娅(2毫克)左边膝盖关节在0天。然后,老鼠在OA对照组给予生理盐水注射IA在天14日18日22日和26日,而治疗组(MIA + CUR-loaded PLGA NPs)收到CUR-loaded PLGA NPs关节内注射的剂量200毫克/公斤。米娅和CUR-loaded PLGA NPs注入剂量被Ragab基于以前的研究et al。16)和Niazvand et al。17),分别。
2.6。膝盖直径测量(肿胀)
手动钳是用来评估的变化前后直径值膝关节在所有组(19]。测量得到的天0、7、14、21、28米娅注射后。
2.7。x光检查
在30天post-MIA注入,从所有组动物使用乙醚麻醉,后肢被扩展和固定在桌子上用胶带。左膝盖的射线照片(前后位置)被抓获使用x射线设备有60厘米焦距离55 kV和3 mA的电影。
2.8。ELISA评价
炎症状态评估在所有组通过测量血清炎性因子、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)(猫# MBS697379)、转化生长因子(TGF -β)(猫# MBS8819920)、白介素- 6 (IL)(猫# MBS7727039)和IL - 1β(猫# MBS697409)和抗炎细胞因子il - 10(猫# MBS2707969)使用MyBioSource Inc .,圣地亚哥,CA,美国制造商的指示。
2.9。评价抗氧化剂标记和氧化应激
2.9.1。测定脂质过氧化水平
通过分解生成丙二醛(MDA)的多不饱和脂肪酸被用作索引对血清脂质过氧化的程度的评估方法后就et al。20.]。
2.9.2。测定谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性
血清谷胱甘肽含量是化验后,布鲁斯等程序。21),检测血清SOD依赖酶的能力防止吩嗪methosulphate-mediated减少氮蓝四唑染色根据Nishikimi et al。22]。
2.10。定量逆转录聚合酶链反应(存在)的测定
的mRNA水平核factor-kappa (NF - BκB), II型胶原蛋白,诱导一氧化氮合酶(间接宾语)是由实时存在,试剂盒的组织提取工具(美国试剂盒)申请总RNA隔离。然后,0.5 - 2μg总RNA申请利用Fermentas工具包(美国)互补脱氧核糖核酸的合成。美国应用生物系统软件版本3.1 (StepOne)是用于实时qPCR扩增和分析。存在试验是用底漆集优化的退火温度。引物的序列表中列出1。
2.11。免疫印迹分析
CUR-loaded PLGA NPs的影响在NF -蛋白表达水平κB50和NF -κB65和裂解caspase-3研究使用膝盖样品保持在80°C。短暂,所有样本均质radio-immunoprecipitation(里帕)缓冲蛋白酶抑制剂和离心机,补充蛋白质浓度与布拉德福德化验分析中获得清晰的浮层。蛋白(30毫克)在sds - page分离,搬到硝化纤维膜,阻止三用3%牛血清白蛋白和渐变20 (TBST)缓冲区在环境温度为1小时。随后,膜与初级抗体NF的孵化器κBp50(猫# 14-6732-81;eBioscience), NF -κBp65(猫# 14-6731-81,eBioscience)和裂解caspase-3(猫# pa5 - 114687热费希尔科学)。与TBST洗涤后,准备膜与相应的二次抗体的孵化器,后化学发光工具包(美国BIORAD)应用。发达的屁股被扫描,图像分析软件是用来测量目标蛋白质的乐队获得强度对归一化后的控制样品beta-actin化学Doc议员成像仪。
2.12。组织病理学分析
左膝关节被组装从所有组,其次是10%中性缓冲福尔马林固定48小时,然后用20% EDTA脱钙两周。关节是切除矢状和加工4 - 6μ石蜡包埋的部分。获得部分然后用苏木精和伊红染色(圆))在光学显微镜下检查。
2.13。免疫组织化学分析
后的部分是彩色streptavidin-biotin-peroxidase染色法(23]。石蜡组织切片(4 - 6μ米)在乙醇在二甲苯deparaffinized然后水化。内源性过氧化物酶和抗体非特异性结合位点被治疗10分钟的部分抑制过氧化氢(0.3%)和20分钟5%正常牛血清(1:5三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释盐[三])在环境温度,分别。获得部分与PBS冲洗,然后,10%正常山羊血清申请30分钟以减少非特异性结合。获得部分被孵化在反MMP13主要抗体(猫没有:GB11247;Servicebio,中国)1 h,其次是孵化的链霉亲和素辣根过氧化物酶(Dako-K0690)和生物素化的二次抗体(Dako普遍LSAB工具包)15分钟,然后孵化3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Sigma-D5905;Sigma-Aldrich有限公司、吉林厄姆英国)衬底工具包实现immunolabelling 10分钟。之后,细胞核染色使用哈利的苏木精染色剂,乙醇脱水,二甲苯清除,然后安装在DPX。抗体绑定与大功率光学显微镜观察。
2.14。统计分析
使用SPSS统计分析软件版本25.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。所有的结果了 错误方式(sem) 这意味着统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。CUR-Loaded PLGA NPs的表征
在这项研究中,准备CUR-loaded PLGA NPs是使用扫描电子显微镜显微照片(图所示2),球的形状。与此同时,XRD CUR-loaded PLGA NPs(图的模式3)显示一个没有标志着CUR-loaded PLGA NPs晶体领域,这意味着这些NPs disordered-crystalline阶段或无定形或固态聚合物基质中可溶性形式。此外,平均大小(图4(一))和电动电势(图4 (b))CUR-loaded PLGA NPs 265.2 nm和−6.86 mV,分别。
(一)
(b)
(一)
(b)
3.2。CUR-Loaded PLGA NPs对肿胀的影响(膝盖直径测量)
如图5米娅诱导增加膝关节OA的直径控制和治疗组相比,注射前的测量。然而,两周的CUR-loaded PLGA NP iai明显减少了左膝关节肿胀。
3.3。CUR-Loaded PLGA NPs利用x射线成像的影响
射线照相检测进行了观察变化后的膝关节CUR-loaded PLGA NP治疗。与正常对照组相比(图6(一)),膝关节OA组(图6 (b))有一个狭窄的关节空间和畸形的关节面。与此同时,CUR-loaded PLGA NP处理大大阻碍了MIA-induced膝OA进展和减毒关节破坏,关节的治疗组(图6 (c))显示一个小程度的缩小,没有发现明显的硬化和骨赘的形成。
(一)
(b)
(c)
3.4。CUR-Loaded PLGA NPs对血清TNF水平ɑ,il - 1βil - 6, TGF -β,il - 10
MIA-treated组(表2)有显著提高血清TNF -ɑ、il - 6、il - 1β,TGF -β水平和降低il - 10水平与正常对照组相比 )。与此同时,OA的膝关节治疗组显示显著降低TNF -ɑ、il - 6、il - 1β,TGF -β水平,随着海拔的il - 10水平相比的OA组。
3.5。CUR-Loaded PLGA NPs对脂质过氧化和抗氧化状态
增强的血清脂质过氧化水平产品(MDA) MIA-treated膝关节伴随着大量减少谷胱甘肽水平和SOD活性。与此同时,CUR-loaded PLGA NP iai显著降低MDA的水平和提高谷胱甘肽含量和SOD活性(表3)。
3.6。CUR-Loaded PLGA NPs对NF -κB,伊诺和II型胶原蛋白mRNA的表达
OA膝关节显示标记( )海拔的信使rna表达水平NF -κB和进气阀打开,连同II型胶原蛋白相比大幅下降与正常组(表4)。此外,OA膝关节治疗CUR表现出显著( )downregulation NF -κB和伊诺水平,抑制了II型胶原蛋白mRNA表达水平的损失相比,在办公自动化控制老鼠。
3.7。CUR-Loaded PLGA NPs对NF -的蛋白质表达水平κp50和NF - BκB p65
免疫印迹分析表明NF -的蛋白质表达水平κp50和NF - BκB p65(数据7)升高post-MIA管理与正常相比控制。然而,CUR-loaded PLGA NP处理显著降低了蛋白表达的NF -κp50和NF - BκB在OA p65膝关节相比MIA组。
3.8。CUR-Loaded PLGA NPs对裂解Caspase-3蛋白表达
蛋白质水平的裂解caspase-3(图8在膝关节与西方墨点法估计。OA的老鼠表现出显著增加裂解caspase-3水平相对于正常对照组,而OA老鼠注射CUR-loaded PLGA NPs透露的差别明显对这些裂解caspase-3与OA相比对照组水平。
3.9。CUR-Loaded PLGA NPs在组织病理学的影响评估
关节软骨的)部分显示软骨细胞在正常对照组放置整齐,染色是统一的(图9(一个))。OA组,获得部分有无数病理交替如裂缝、颤动,无序排列的细胞,减少空裂陷,细胞核浓染,华丽的软骨细胞的数量(数字9 (b)- - - - - -9 (d))。相比之下,米娅+ CUR-loaded PLGA NP组(数字9 (e)显示软骨退化的严重程度显著降低,随着CUR治疗对OA进展提供有效的保护。米娅+ CUR-loaded PLGA NP-treated软骨出现表面光滑,有序安排软骨细胞,减少损失的细胞,和完整的软骨下骨相比MIA-treated软骨没有治疗。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.10。效应的矩阵Metalloproteinase-13 CUR-Loaded PLGA NPs (MMP-13)表达式
MMP-13,分解代谢的关键酶,在关节软骨软骨细胞的免疫组织化学染色来评估其蛋白表达。与正常对照组相比,几乎没有为MMP13阳性染色(图10(一)),米娅诱导海拔MMP-13内容的关节软骨OA对照组(图10(b))。然而,部分(图10(c))显示MMP-13内容明显减少关节软骨的米娅+ CUR-loaded PLGA NP组相比,OA的对照组。
此外,我们的结果(图10)展示增加细胞染色阳性MMP-13在米娅注射后的关节软骨与正常对照组相比 vs。 , ,分别)。然而,骨关节炎的老鼠接受CUR-loaded PLGA NPs表现出显著减少MMP-13-positive软骨细胞与MIA-treated集团没有任何治疗( vs。 , )。
4所示。讨论
目前,证据显示之间存在显著相关性OA的发病和进展和炎症,氧化应激,过度异化的活动(24]。
在当前的工作中,我们利用米娅产生关节软骨组织学和生化变化,类似人体的办公条件(25]。此外,在寻找便宜的和有益的治疗OA,我们准备好的CUR-loaded PLGA NPs与炎症介质研究中药的药效,氧化应激,软骨细胞凋亡在MIA-induced OA在老鼠模型中(图11)。
CUR-loaded PLGA NP的尺寸在我们的研究中发现都小于300纳米,并且符合所报道的冈萨雷斯et al。26]。虽然XRD模式在我们的研究中没有显示典型的坏蛋山峰NPs卡住时,汗et al。27阐明,没有任何明显的晶体领域的坏蛋意味着CUR加载在PLGA NPs disordered-crystalline阶段或无定形或固态聚合物基质中可溶性形式。这disordered-crystalline阶段或坏蛋,在聚合物基体内部,允许从NPs封装药物的控制释放。
yaba的兴奋剂后et al。28),我们的影像学结果表明CUR NP关节内的政府明显减少MIA-induced影像学异常的膝关节治疗大鼠由正常关节空间和关节软骨表面光滑。
NF -κB信号通路是声称的主要信号通路,促进办公自动化的发展(29日]。尽管NF -κ细胞质中的B保持不活跃在正常情况下,在适当的刺激,例如,炎性细胞因子和炎性微环境,我κB我磷酸化激酶(IKK)活动κB蛋白,导致他们的退化,这允许免费NF -κB复合物可能促使从细胞质到细胞核,刺激多种炎症相关的基因。此外,它触发细胞外基质降解,软骨细胞凋亡,血管翳形成,最终,病态的软骨破坏(图11)[5,30.]。
另外,各种研究认为CUR阻碍OA-related炎症通过阻断NF -κB信号通路和防止软骨细胞凋亡(31日,32]。因此,OA-related炎症抑制和进程放缓11,33,34]。
随后,我们的研究讨论了CUR-loaded PLGA在NF - NP iai公司的影响κ和NF - B基因κB-regulated基因参与炎症,如肿瘤坏死因子-α、il - 6、il - 1β,TGF -β。我们的数据在和谐Alhusaini et al。30.)建议CUR政府封锁了NF -κ我激活通过抑制κB退化和磷酸化,抑制NF -的易位κB到细胞核,从而阻碍细胞的炎症反应。
此外,在协议(35],我们的数据显示,坏蛋大大提高血清il - 10的水平,一个健壮的抗炎免疫抑制和chondroprotective细胞因子,表明其强有力的抗炎能力。
此外,CUR-loaded PLGA NP治疗OA期间抑制伊诺的表达,这是一个inflammation-induced酶催化生产的促炎介质一氧化氮(NO),进一步证明其抗炎作用。几个在活的有机体内和在体外研究[36,37)表明,坏蛋治疗减少伊诺生产各种炎性疾病。最近,Cheragh-Birjandi et al。37]假定CUR政府可以调节水平通过抑制活化的氨基端激酶(物),p38和NF -κB通路。
NF -κB途径激活不仅移植促炎介质但此外介导引发的软骨细胞激活释放细胞外基质(ECM)的产品,例如,纤连蛋白片段,进而促进各种基质降解酶的表达,包括金属蛋白酶(mmp) [38- - - - - -40]。OA的早期阶段,高upregulation MMP-13表达式,一位著名的分解酶,导致严重恶化的软骨诱导II型胶原蛋白,这是一个原因ECM的近90%。II型胶原蛋白的丧失是一个关键阶段,决定了不可逆转的进展的OA(图11)[41]。因此,本研究探讨MMP-13和II型胶原表达水平的指标anticatabolic CUR NPs在膝关节OA的活性。
的坏蛋,iai NPs预防OA恶化通过减少MMP-13表达式(42)和II型胶原蛋白的降解6]。Kumar et al。43]提出CUR具有抑制基质金属蛋白酶和变量影响细胞信号通路,例如,Janus激酶统计和NF -κB /增殖蛋白激酶/磷酸肌醇3-kinase,最终改善营运和防止进一步损害软骨。
此外,坏蛋治疗的效果在膝关节OA的细胞死亡也被阐明。尽管细胞凋亡是一个至关重要的过程保持体内平衡的几个组织,软骨细胞死亡的高速率是一个著名的OA的病理特征(44]。MIA-induced TNF -α激活肿瘤坏死因子受体(TNFR)或死亡受体,最终引发细胞凋亡的外在途径(图11)。而丁等。45假定MIA-induced电脑耗材,可以引发细胞凋亡的内在途径活性氧(ROS)。活性氧积累会引起氧化应激,从而改变线粒体功能和促进细胞色素c的排泄和激活proapoptotic因素,例如,caspase-3 [44,46]。此外,线粒体损伤显示增强的响应炎症细胞因子诱导的软骨细胞通过产生活性氧和激活NF -κB (47]。
相反,坏蛋已经证明恢复线粒体功能,清除自由基和活性氧(48,49),和抑制脂质过氧化作用50]。坏蛋也提高SOD等抗氧化剂的活性,过氧化氢酶、谷胱甘肽,谷胱甘肽过氧化物酶在各种疾病30.,51]。基于这些研究,我们审查的角色CUR-loaded PLGA NPs抑制激活细胞凋亡相关介质的OA。我们的数据证实了抗氧化功效的坏蛋NPS大大避免了MDA脂质过氧化产物的增加和增强抗氧化状态(谷胱甘肽浓度和SOD活性)。此外,一致的结果Buhrman et al。52),我们的结果显示凋亡CUR NPS的功效,特别是caspase-3 upregulation受阻时的水平。anticatabolic,抗氧化和抗凋亡能力可以主要归因于羟基、甲氧基、α,β不饱和羰基,或二酮组在坏蛋53]。
MIA-induced膝OA炎症导致严重的组织病理学改变关节软骨的结构,如结晶、无序排列的细胞,深染,和软骨细胞数量显著减少31日]。而CUR-loaded PLGA NP处理并不影响细胞的再生,它停止了OA进展通过减少炎症和软骨细胞凋亡所描述的温和组织缺陷和明显的关节软骨和软骨下骨的完整性。我们的研究结果是一致的yaba的兴奋剂et al。28),这表明CUR减少OA严重程度通过恢复膝关节的架构。王等人。54]假定CUR适度增强关节软骨的完整性通过阻断NF -κB /低氧诱导因子2α信号通路。
因此,目前的研究结果表明,OA-related恶化和发展停止由于CUR-loaded PLGA NPs的调节能力等各种介质NF -κB MMP-13和氧化应激。
5。结论
总的来说,这项研究表明关节内的治疗CUR-loaded PLGA纳米粒是一个令人信服的候选人在膝关节OA改善关节健康因其抗炎、anticatabolic和抗氧化特性。然而,对于临床应用,进一步研究延长治疗期和大样本量应探索其潜在机制。
缩写
| 坏蛋: | 姜黄素 |
| CUR-loaded PLGA NPs: | Curcumin-loaded polylactic-co-glycolic酸纳米颗粒 |
| ECM: | 细胞外基质 |
| 谷胱甘肽: | 减少谷胱甘肽 |
| 公司: | 关节内注射 |
| 干扰素-γ: | 干扰素-γ |
| IL: | 白介素 |
| 伊诺: | 诱导一氧化氮合酶 |
| MDA: | 丙二醛 |
| 米娅: | 谷氨酸钠碘乙酸 |
| MMP-13: | 矩阵metalloproteinase-1 |
| NF -κB: | 核factor-kappa B |
| 没有: | 一氧化氮 |
| NPs: | 纳米粒子 |
| 非甾体抗炎药: | 非甾体类抗炎药 |
| 办公自动化: | 骨关节炎 |
| PLGA: | Polylactic-co-glycolic酸 |
| PVA: | 聚乙烯醇 |
| 里帕: | Radio-immunoprecipitation化验 |
| ROS: | 活性氧 |
| sds - page: | 钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳 |
| 统计: | Janus激酶信号转导和转录激活 |
| 稍后通知: | 硫代巴比土酸 |
| TGF -β: | 转化生长因子 |
| TNFR: | 肿瘤坏死因子受体 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α。 |
数据可用性
作者证实本研究期间所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。
同意
知情同意是获得所有受试者参与这项研究。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
基本分析,马英九的构思和设计实验。HMH进行实验和分析数据。伊恩,BSA和OMA提供实验技术支持和协助完成在不同阶段学习。HMH起草了手稿。基本分析,完成论文。所有作者都同意手稿的内容。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
本研究工作是由机构基金项目批准号(IFPDP-14-22)。因此,作者欣然承认的技术和财政支持教育和科研院长职(域),阿卜杜拉国王大学,吉达,沙特阿拉伯。