文摘
背景。乳腺癌相关抑郁(BCRD)严重抑制乳腺癌患者的生活质量。队的Kangai Jieyu公式抑制抑郁症的进展。然而,队的详细功能Kangai Jieyu公式BCRD仍不清楚。方法。网络药理学的下游目标构建了评估队Kangai Jieyu BCRD公式。此外,尾巴暂停测试,蔗糖偏好测试,和强迫游泳测试被用来测试抑郁症状的老鼠。Fluoro-Jade B染色进行观察神经元的结构。RT-qPCR和免疫印迹mRNA和蛋白水平进行评估。此外,ELISA测试执行炎症反应和免疫与响应相关的细胞因子。结果。槲皮素的关键组件被确认为逍遥Kangai Jieyu公式。槲皮素显著抑制神经元BCRD-induced pyroptosis PYD的差别,通过对这些基因和卡域包含(ASC) NLR家庭pyrin域包含3 (NLRP3)和caspase-1,槲皮素可以反向BCRD-caused抑制神经元生存能力。槲皮素显著减毒的症状BCRD在老鼠中,而且可能逆转5 -羟色胺(5 -)的内容,多巴胺(DA)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)在老鼠身上。此外,槲皮素可以促进免疫反应在异种移植小鼠通过upregulation白介素- 2 (IL)、干扰素-γ(IFN -γ)和il - 10。结论。的活性成分槲皮素,逍遥Kangai Jieyu配方,有效地减轻BCRD通过抑制pyroptosis的进展,促进免疫反应,提高血清代谢。
1。介绍
乳腺癌患者常常会表现出显著的情绪不稳定,尤其是抑郁症,伴有抑郁症的概率达到40%1,2]。同时,抑郁症是严重影响患者的生活质量,甚至降低乳腺癌患者的生存时间10% - -20% (3]。因此,研究发病机制具有重要意义的BCRD BCRD的预防和治疗。目前,BCRD临床治疗的主要方法是给辅助抗抑郁治疗后诊断(4]。但是,结果仍然仍然有限的机制发展成乳腺癌BCRD在很大程度上仍是个未知数。
中医辩证治疗为基础,具有显著的治疗效果在乳腺癌和耐药性的发展5,6]。此外,中医通常在治疗抑郁症(有独特的优势7,8]。队的Kangai Jieyu公式是一种中国传统草药化合物之前,我们已经发现是非常有效的治疗BCRD [9]。因此,制定处方和制定药物(从传统中药)病因和发病机理的基础上BCRD有更广阔的前景和应用价值。
先前的研究表明,BCRD的发病机制主要集中在自主neuroimmunity神经内分泌免疫,炎症和氧化应激损伤相关(10,11]。此外,细胞pyroptosis是一种新颖的细胞死亡(编程)发现近年来,它被认为是最密切相关的细胞损伤炎症(12]。记录,经典的乳沟通路是由aspartate-specific caspase-1(又名caspase-1),可诱导炎症调节的囊泡(13]。我们的初步数据显示,炎症囊泡(NLRP3)经常在进展BCRD小鼠神经元的激活。因此,假设,海马神经元pyroptosis可能参与BCRD的发生和发展。
基于上述背景,我们的研究旨在调查的功能队Kangai Jieyu公式在炎症反应BCRD的进展。我们希望这项工作能够产生新颖的见解对BCRD发现新方法。
2。材料和方法
2.1。网络药理学的数据源
队的有效成分Kangai Jieyu公式得到3步骤如前所述[14]。
目标蛋白质预测使用TCMSP数据库和DrugBank (https://www.drugbank.ca/)和TCMSP数据库。其他活性成分(目标蛋白质不能被预测在这两个数据库)进行了分析通过使用SwissTargetPrediction,和最高目标预测结果显示被选中。每个活性组分和逍遥Kangai Jieyu公式活跃constituent-target蛋白质网络编码应用Cytoscape (v3.7.1)软件为探索有效成分之间的关系和目标蛋白。此外,网络分析仪(Cytoscape插件)应用于调查的中间性中心网络和程度。
2.2。潜在的积极目标蛋白(病人)
队的目标之间的交集Kangai Jieyu公式和蛋白质(BCRD相关)作为病人进行以下分析。
2.3。蛋白质相互作用(PPI)的调查
为了澄清病人之间的关联,字符串数据库应用建立的PPI网络。此外,物种只有适应智人,信心得分为0.95(< 0.4被认为是信心不足,≤0.7作为媒介,和> 0.7考虑高)被选在这个分析。进一步的实验使用PPI数据。然后,CytoNCA (Cytoscape插件)是应用于评估PPI的网络,和网络建立了顶级蛋白( )。
2.4。基因本体论(去)分析
队的分子机制Kangai Jieyu公式确定使用去分析。MCODE (Cytoscape插件)是应用于生物过程分析。详细,数据过滤的PPI Cytoscape应用MCODE在这个过程。0.05被认为是显著性水平。
2.5。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)
KEGG分析应用于探索潜在通路和生物功能的工作。此外,KEGG分析应用的ClusterProfiler包R语言。0.05被认为是显著性水平。
2.6。诸多代谢组学
样本放在干冰,重。冻结组织磨床应用于同质化的组织。组织匀浆(200μL)与800年感动和混合μL甲醇/乙腈(1:1、 )。样本涡30年代和离心机(14500 rpm, 15分钟,4°C)。浮在表面的蒸发干燥,氮吹,然后用100年重组μL乙腈/水(1:1, )。最后,解决方案是用0.22过滤μ膜,分析了UHPLC-QTOF-MS(安捷伦1290 UHPLC 6545 MS)。反应条件如下:水域高速钢T3列应用于单独的样品溶液(2μL)在40°C和0.1%甲酸(洗脱液)和乙腈(洗脱液B)(流量为0.3毫升/分钟)。总共20分钟梯度程序设置如下:0.01分钟,1% B;1.5分钟,1% B;13分钟,99% B;16.5分钟,99% B;和平衡时间16.6分钟为1%。
2.7。细胞培养
乳腺癌细胞(4 t1)从中国科学院购买。纳什等人表明4 t1促进小鼠类似抑郁状态的感应(15];因此,4 t1细胞被选为研究乳腺癌相关抑郁在这项研究。此外,主要源自神经元表达载体(项目编号:A15585,沃尔瑟姆,妈,美国)。细胞在DMEM(英杰公司)与10%的边后卫(Gibco)和青霉素(100 U /毫升)37°C和5%条件下有限公司2。
2.8。药物
从昌都的逍遥Kangai Jieyu公式得到振兴。Ctd。中国(湖南)。队的Kangai Jieyu公式由柴胡、当归、白牡丹、云苓、白术、扁桃体脓肿寻常的,人参、姜黄、贯叶连翘、烤甘草。
2.9。细胞治疗
4 t1细胞暴露于有限合伙人(σ,10μg / mL) 6 h。然后,细胞离心,收集上清液。细胞上清液被添加到主要神经元6 h。索集团主要神经元被暴露于200年μCORT 6 M h。4 t1细胞暴露于有限合伙人(σ,10μg / mL) 6 h模拟BCRD体外。然后,细胞离心,收集上清液。细胞上清液和200年μCORT被添加到主要神经元6 M h (16]。
2.10。体内模型
裸小鼠(BALB / c, ;年龄在6 - 8周)起源于北京重要的河流。老鼠被放置在SPF的状况。4 t1细胞(107/毫升)注入小鼠(皮下注射)。每周肿瘤体积测量。然后,老鼠(除了对照组)CORT悬挂皮下注射30毫克/公斤。
老鼠BCRD + Pac组腹腔注射每周紫杉醇脂质体(20毫克/公斤)。老鼠BCRD +流感组与盐酸氟西汀管理每天(7.8毫克/公斤)。槲皮素组小鼠腹腔注射同等剂量的槲皮素。此外,老鼠在控制、抑郁、BCRD,乳腺癌组管理相同数量的蒸馏水。经过3周的治疗,每组的老鼠进行了分析(根据多个指标16]。
机构的动物保健和使用委员会湘雅医学院附属肿瘤医院,中南大学,批准协议的工作(2021 - 056)。治疗期间动物实验符合的标准“指导意见善待实验动物”科技部颁发的2006年。
2.11。蔗糖偏好测验
减少蔗糖的偏好被认为是同源快感缺乏,无法感受愉悦,模仿萧条。水瓶( )在每个笼子里为目的的评估动物习惯的影响。老鼠缺乏水和禁食一天前的实验。简而言之,蔗糖溶液(2%)和饮用水被放在一个笼子里6小时。最后,测量液体内容和使用以下公式计算蔗糖偏好(如前所述)(17]。
2.12。强迫游泳测试
强迫游泳测试(置)是用来测量抑郁行为的变化。浮置板轨道,老鼠收到符合最近的工作(18]。把动物放在一个玻璃瓶子的高度21厘米,直径16.5厘米。瓶子和水添加(13厘米深)6分钟。强迫小鼠游泳6分钟,并观察他们在最后4分钟不动多久。当老鼠的头的水和没有明显运动四肢,老鼠被定义为静态的。休息时间的结果记录下来。
2.13。尾巴暂停测试
老鼠分别暂停开发和彼此分离。然后,磁带被1厘米的尾巴尖。的状态观察小鼠6分钟,结果被记录。
2.14。CCK8化验
细胞( 每口井)治疗28 h。然后,细胞治疗CCK8试剂(10μL, Beyotime)在37°C 2 h。之后,发现吸光度(450海里)通过使用微型板块读者。
2.15。EthD-III染色
总之,EthD-III (2μ米)应用于培养细胞为45分钟,应用DAPI染色细胞。共焦显微镜(LSM710、卡尔蔡司、德国)应用到可视化细胞(522/593 nm)。
2.16。RT-qPCR
试剂盒(豆类、东京、日本)应用于分离组织或细胞总rna。PrimeScript RT试剂盒(豆类)应用于合成的互补。ABI7500系统中执行RT-qPCR执行SYBR绿色。RT-qPCR应用如下:94°C 2分钟,其次是35周期(94°C 30年代和55°C 45 s)。引物源自GenePharma(上海,中国)。的方法应用于量化。β肌动蛋白被认为是控制参考。序列如表所示1。
2.17。免疫印迹
里帕缓冲区用于分离蛋白质组织或细胞溶解产物。BCA(英杰公司)是应用于蛋白质量化。随后,sds - page(10%)用于分离蛋白质(40μg / lane),蛋白质被转移到PVDF(表达载体)。一夜之间,主要抗体被膜应用于孵化与脱脂牛奶膜被封锁后(3%)1 h。后来,二次抗体(anti-rabbit Abcam;1:5000)是应用于孵化膜1 h。《奥德赛》成像系统应用于扫描膜,和奥德赛v2.0软件(美国LICOR生物科学)是应用于分析这些墨迹。主要的抗体如下:anti-NLRP3 (1: 1000), anti-ASC (1: 1000), anti-caspase-1(1: 1000),和反β肌动蛋白(1:1000)。所有抗体起源于Abcam(美国)。β肌动蛋白是申请量化。
2.18。ELISA
酶联免疫试剂盒起源于建成,南京(中国)。5的水平(项目编号:H104-1-1), DA(项目编号:H170)、NE(项目编号:H344-1), 2(项目编号:H003)、干扰素-γ(项目编号:H025)和il - 10(项目编号:H009-1)在小鼠的海马/肿瘤匀浆测定。
2.19。流式细胞术
肿瘤是分离和暂停。CD8-APC和CD4-FITC随后被用于染色细胞在4°C 15分钟。之后,细胞被permeabilized Foxp3-PE (eBiosciences)染色。应用流式细胞仪(美国BD FACSAria)分析细胞后细胞。FlowJo (BD)应用于量化数据。
2.20。组织学检查
氯化钾(10%)应用于逮捕的组织,和佳能相机(东京)是用于捕获的图像组织。苏木精和伊红())应用于染色的部分(4μ米)。原子核的横截面测量水平切片细胞(纵向)。显微镜(日本奥林巴斯)被用来获取图像。美国国家卫生研究院Image-Pro(+ 6.0)应用于分析数据。
2.21。统计分析
数据分析应用通过使用SPSS v18.0(美国)。 用于表达数据。方差分析(其次是Tukey-Kramer事后测试)应用于实验群体之间的差异进行比较。 重大的改变。
3所示。结果
3.1。主动Ingredient-BCRD-Target网络
共有156个目标是通过综合分析有效成分的逍遥Kangai Jieyu公式,乳腺癌和抑郁(图1(一))。我们为这些156 PPI网络构造目标基因(图1 (b))。基因与学位分数大于平均分数被选为主要目标,和共有53个关键目标筛选出来。前20名的目标图所示1 (c)。
(一)
(b)
(c)
核心基因被MCODE筛选分析。四个基因簇和四个核心基因得到:应用,AKT1,分别IL10和运动(表2)。
基于包括活性成分、BCRD和目标,积极ingredient-disease-target网络构造(补充图1)。
3.2。去KEGG富集分析
接下来,去分析表明,化合物的活性成分主要是对脂多糖参与反应,药物反应,反应分子的细菌来源(图2(一个))。此外,KEGG分析表明,化合物的活性成分是以下途径:AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症,脂质和动脉粥样硬化,流体剪切应力和动脉粥样硬化(图2 (b))。我们建造了一个PPI网络基于潜在的目标和途径逍遥Kangai Jieyu公式的活性成分在BCRD(图2 (c))。此外,根据活性成分的程度,我们发现槲皮素是最重要的成分逍遥Kangai Jieyu公式(补充表2)。
(一)
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(c)
3.3。发生Pyroptosis BCRD诱导的神经元
模仿BCRD在体外的上层清液,神经元受到LPS-treated 4 t1细胞。在数据3(一个)和3 (b),在BCRD pyroptotic细胞明显升高。ASC的水平,与此同时,NLRP3, caspase-1神经元明显调节BCRD(数字3 (c)- - - - - -3 (f))。
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3.4。槲皮素显著逆转Pyroptosis BCRD-Induced细胞
由于槲皮素被确认为队的关键组成Kangai Jieyu公式,以下分析应用于分析槲皮素对BCRD进展的影响。数据证实,神经元显著减少的可行性的上层清液LPS-treated 4 t1细胞,由Pac +流感或显著逆转槲皮素(图4(一))。一贯的上层清液LPS-treated 4 t1细胞显著调节ASC, NLRP3,神经元和caspase-1水平,而这种现象被Pac +流感或槲皮素(部分恢复数据4 (b)- - - - - -4 (e))。与此同时,Pac +流感或槲皮素明显逆转LPS-treated 4 t1细胞上清液对细胞的影响pyroptosis(图4 (f))。
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3.5。槲皮素减轻神经元损伤和抑郁行为BCRD老鼠
评估在BCRD槲皮素的功能在活的有机体内,一个在活的有机体内BCRD模型构造。在数据显示5(一个)- - - - - -5 (c)抑郁症的症状,就可以显著降低小鼠BCRD和抑郁,由槲皮素显著逆转或Pac +流感。此外,BCRD和抑郁显著调节ASC, NLRP3,老鼠和caspase-1水平,而槲皮素或Pac +流感部分获救这种现象(数字5 (d)- - - - - -5 (j))。此外,5的内容、DA、NE在老鼠更高BCRD和抑郁组,获救的槲皮素或Pac +流感(人物的存在5 (k)- - - - - -5(米))。
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3.6。槲皮素促进BCRD小鼠的抗肿瘤免疫反应
异种移植小鼠模型构建评估BCRD老鼠槲皮素对免疫反应的影响。结果表明,BCRD进一步增加了老鼠在乳腺癌肿瘤大小和重量,而这种现象被槲皮素或Pac +流感(特别是修改数据6(一)- - - - - -6 (c))。此外,BCRD显著诱导组织损伤,以及BCRD明显抑制的影响中槲皮素的存在或Pac +流感(图6 (d))。同时,BCRD老鼠CA153的内容明显抑制了Pac +流感或槲皮素(图6 (e)),并降低BCRD-induced CD4 +和CD8 +也恢复了槲皮素或Pac +流感(补充图2,数据6 (f)和6 (g))。此外,BCRD大大降低干扰素-γ和水平,增加小鼠il - 10 - 2,特别是获救的槲皮素或Pac +流感(数字6 (h)- - - - - -6 (j))。
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3.7。槲皮素部分逆转BCRD小鼠血清代谢
在数据显示7(一)- - - - - -7 (c),不同实验的代谢物组分为不同的集群。火山情节表明,115种代谢物在三组(图之间存在着显著的差异7 (d))。我们注意到槲皮素有效逆转BCRD中的某些代谢产物的水平,比如argininosuccinic酸,L-asparagine,γ-氨基丁酸,琥珀酸和尿嘧啶(补充图3)。KEGG分析表明,这些差异代谢物主要是富含精氨酸生物合成,丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢,D-glutamine D-glutamate新陈代谢(图7 (e))。
(一)
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4所示。讨论
BCRD严重损害患者的生活质量。据报道,中药可以抑制癌症和抑郁症发展(7,19]。然而,在BCRD中药的功能需要进一步分析。在这个研究中,逍遥Kangai Jieyu公式可以抑制BCRD的进展。此外,槲皮素被确认为主要活性组分的逍遥Kangai Jieyu公式。此外,这项工作在BCRD发现槲皮素和血清代谢之间的关系。因此,我们研究了槲皮素的功能,逍遥的活性成分Kangai Jieyu公式,BCRD。我们的研究结果表明,槲皮素可以作为一种新的代理BCRD治疗。
本研究评估的机制逍遥Kangai Jieyu BCRD公式,和下游蛋白质和有效成分预测。队的Kangai Jieyu公式活跃constituent-target网络显示的药理基础逍遥Kangai Jieyu公式。目标和有效成分被假设在这一节中。类黄酮的主要活性成分是逍遥Kangai Jieyu公式。此外,槲皮素是一种多酚类黄酮具有抗肿瘤活性,而且对植物性食物的来源和多种中药(20.,21]。体内和体外研究积累注意chemopreventive活动和机制槲皮素BCRD的功能。
与此同时,槲皮素具有多种生物活性。例如,槲皮素变弱LPS-induced类似抑郁的行为和在大鼠学习记忆障碍,这可能与它的调制失衡的海马Copine 6和TREM1/2表达与脑源性神经营养因子(22]。槲皮素能抑制慢性不可预知的行为通过涉及核factor-E2-related轻度应激抑郁因子2 (23]。大量研究表明,槲皮素在各种癌症起到治疗的作用。例如,槲皮素能抑制宫颈癌细胞入侵通过减少UBE2S表达式在宫颈癌24]。槲皮素目标特定的信号通路,这被认为是一种很有前途的组件治疗多形性成胶质细胞瘤(25]。此外,槲皮素也已被证明能够有积极的抗癌效果在卵巢癌26]。这些研究表明,槲皮素是一种准候选人治疗抑郁和癌症。
最近的研究表明,pyroptosis细胞过程中起着至关重要的作用[27,28]。Caspase-1 NLRP3, ASC是已知的重要调节器在细胞pyroptosis [29日,30.]。与此同时,il - 1β也是一个pyroptosis-related细胞因子(31日,32]。Caspase-1经常调节神经元损伤的发病期间,建议推广pyroptosis可能与神经损伤(33,34]。我们的研究表明,槲皮素可以通过移植反向神经元pyroptosis caspase-1裂解,NLRP3, ASC。Isoglycyrrhizin,类似于槲皮素的类黄酮,最近被证明改善抑郁症通过抑制NLRP3-mediated细胞通过miRNA-27a pyroptosis麦克米兰/ NF -κB轴(35]。在这项工作中,我们首先发现槲皮素和pyroptosis BCRD之间的相关性,表明槲皮素逆转神经元损伤过程中通过促进pyroptosis BCRD。
据报道,破坏新陈代谢可能导致抑郁症的进展(36]。本研究发现argininosuccinic酸、L-asparagine、γ-氨基丁酸,琥珀酸,尿嘧啶的槲皮素可以抑制BCRD老鼠。L-Asparagine是已知的心血管疾病的关键标志(37]。γ-氨基丁酸过度增长可能导致代谢紊乱,进而导致糖尿病的发展(38]。琥珀酸发挥了关键作用的慢性病老人人39),尿嘧啶代谢循环中的关键标记(40]。因此,我们的发现显示,BCRD的发展可能与代谢紊乱密切相关,和槲皮素已被证明在BCRD部分调节相关代谢物的异常。
有一些限制在这个工作如下:(1)槲皮素调节的机制的发展BCRD之间的关系尚不清楚。(2)槲皮素和血清相关信号,需要进行分析。因此,在未来更多的分析是至关重要的。
5。结论
总之,槲皮素,逍遥的活性成分Kangai Jieyu公式,有效减轻BCRD通过抑制pyroptosis的进展,促进免疫反应,提高血清代谢。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
没有竞争的利益要申报的东西。
作者的贡献
清代朱了概念化、调查方法、可视化和写了初稿。Lei杨和回族杨了正式的分析,调查,验证和写了初稿。Yuanshan汉导致概念化,进行了研究,并分析了数据。Yun陈和应负责数据管理,资金收购,项目管理和监督审查和编辑。所有作者的文章和批准提交的版本。
确认
这项研究是由中国国家自然科学基金(82104846),支持中国湖南省自然科学基金(2019 jj80021),由湖南省卫生委员会的科学研究项目(202103101959),和支持的湖南省科技创新项目(批准号2019 sk20321)。
补充材料
补充1。补充表2:关键成分的信息。
补充2。补充图1:ingredient-disease-target网络活跃。
补充3。补充图2:在小鼠CD4 +和CD8 +比率。
补充4。补充图3:微分代谢物的热图等离子的老鼠。
补充5。补充图4:主老鼠神经细胞识别。(一)主要鼠皮质神经元的形象代表。如果识别的初级神经元(B)。