文摘
本研究的目的是评估的组织病理学变化的哥伦比亚菌株引起的感染鲁兹锥体(t . cruzi)在急性和慢性实验阶段。C57Bl / 6小鼠感染1000 trypomastigote哥伦比亚应变的形式t . cruzi。后30天(急性期)和90天(早期慢性阶段)的感染,动物安乐死,结肠收集和分成两部分:近端和远端。远端部分是用于组织病理学分析,而赞成的近端部分用于量化和抗炎细胞因子。此外,动物的体重和寄生虫血症进行评估。动物感染诱导体重慢慢下降。此外,感染诱导干扰素(IFN的增加γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)在小肠急性阶段,这种增加直到早期慢性阶段。同样的观察与肠道炎性浸润的存在。与白介素(IL) -10年,有一个增长只有在早期慢性阶段。哥伦比亚菌株感染也能够诱导神经元损失的肌间神经丛和胶原纤维沉积在急性期。哥伦比亚的t . cruzi能够导致受感染小鼠的肠组织病理学变化,特别是在诱导神经破坏。因此,这一毒株还可以用来研究肠道形成恰加斯病的实验模型。
1。介绍
100多年后的发现恰加斯病(CD)的病原体,鲁兹锥体,这种疾病仍有一个伟大的社会经济影响。据估计,这种疾病每年花费大约6.27亿美元全球公共卫生(1]。此外,主要是因为失去生产力和过早死亡的感染,全世界大约每年花费12亿美元(2]。主要病理症状包括心脏、消化系统和chagasic巨结肠,占10 - 20%的情况下,进化消化形式(3]。对发展的机制,因此,实验模型是用来协助寻找答案。
的压力t . cruzi最常用的实验模型鼠(4,5),大鼠(6,7),或狗8)模拟肠道的CD形式是Y的压力。因此,大部分的发现与肠组织病理学和免疫学变化有关t . cruzi感染相关的压力。小鼠C57BL / 6株感染了Y的压力,例如,显示结肠的宽度和厚度的变化的肌肉层,增加肠道的炎性浸润,以及组织寄生、肌炎、神经节炎,periganglionitis在急性实验阶段(9]。在慢性阶段,有一个的胶原纤维沉积增加肠,有关器官的纤维化(10]。同样的过程也被报道在人类chagasic巨结肠(11]。此外,这一毒株感染会导致神经元减少实验模型在急性和慢性阶段(5,12),这也是一个里程碑巨结肠的发展在人类13,14]。
有一个菌株的多样性t . cruzi有不同的生物学行为,主要是有关分子生物学、组织趋向性,和发达的特区的形式15,16]。在实验感染模型等菌株Y (5,10]和MORC-1 [17]引起肠道神经破坏,菌株Ninoa等地方(18)和巴西(19),诱导肠道变化,没有评估肠神经元丛的数量。
此外,哥伦比亚应变是广泛用于研究基于实验恰加斯心脏病都因为myotropism,主要是心脏和骨骼,这一毒株(20.,21]。寄生虫的存在和肠道的变化已经报道,虽然较少,与这一毒株感染(4,22]。然而,在这些研究中,肠神经元数目之间的关系,细胞因子的行为,fibrose沉积尚未评估在老鼠身上。因此,本研究的目的是评估是否哥伦比亚免疫病理变化和应变与肠神经的破坏,在实验感染的急性和慢性阶段。
2。材料和方法
2.1。动物、感染和安乐死
这项研究是经伦理委员会批准使用动物的联邦大学的戈亚斯(协议编号:051/19)。因此,所有条件处理、维护和安乐死的动物之后表示。
本研究中使用的动物饲养和捐赠Bioterium热带研究所的病理学和戈亚斯联邦大学的公共卫生。雄性C57Bl / 6小鼠(27 g)被感染,皮下注射,或不与1000 trypomastigote形式的t . cruzi哥伦比亚应变从BALB / c小鼠在寄生虫血症的高峰期。天的感染,这些动物之后30天( )和90天( )分别在急性和慢性阶段。控制动物没有感染也跟着30天( )或90天( )。安乐死的时候(颈椎脱位后确认的麻醉状态,由50毫克/公斤的甲苯噻嗪盐酸腹腔内),结肠的最后部分是收集,和近端部分被用于测量细胞因子,而远端部分是用于组织病理学分析。
2.2。寄生虫血症和动物体重
寄生虫血症受感染的老鼠进行每隔三天直到血trypomastigotes全部消失。为此,5μL尾静脉的血液收集的动物,然后放置在幻灯片和盖玻片。然后,50个随机领域进行评估在普通光学显微镜下计数循环trypomastigotes。动物的重量收集当天的感染(0)和随后的日子安乐死(30 - 90天)。
2.3。组织病理学评价
动物的远端结肠的一部分被×1磷酸缓冲盐(PBS)转移到一个滤纸,在48 h和4%多聚甲醛固定。固定材料处理根据一项研究[18]。
炎性浸润的分析,三个连环削减(100μm)与hematoxylin-eosin染色。然后,每个削减10的照片( ),在×400放大,使用普通光学显微镜捕获附加到相机。首先,炎性浸润的强度定性在黏膜下层和肌肉,成立后的分类1轻微,2为温和,3强调。这种分类后,平均30照片获得了和分类根据以下得分:0 - 0.3,正常;0.4 - -1.0,离散;1.1 - -2.0,温和;-3.0和2.1,强调[4]。
幻灯片沾吉姆沙染色剂被用来量化肠道神经中枢。四个连续切片,与100年μ米每片之间,进行了评估标准的光学显微镜下×400放大。整个片段的神经中枢是计算每个系列,和意思。幻灯片使用常见的打印机进行扫描来测量每个片段。使用ImageJ软件,平均削减的四个标准化1厘米,和获得的结果是肠神经节的数量/厘米。
幻灯片picrosirius和苏木精染色形态学评估用于沉积结缔组织的黏膜,黏膜下层,肠道肌肉层。对于每个肠道片段,20个领域进行了分析×400后放大方法建立在之前的研究(18]。结果表示为胶原蛋白的百分比/动物。
2.4。免疫学评估
结肠近端片段(约1厘米)被转移到一个包含×1埃普多夫管磷酸缓冲盐溶液和完整™蛋白酶抑制剂(σ,美国)。上钻碎片被均质均质器(小孔,欧洲大学协会)。获得的匀浆在12000 g×30分钟,离心机和上层清液储存在-80°C的量化因子和总蛋白。干扰素(IFN -的量化γ)(研发系统)、肿瘤坏死因子-α(TNF -α)(研发系统)和白介素- 10 (IL) (BD OptEIA™)进行匀浆的近端结肠部分使用一个immunoenzymatic试验(ELISA)根据制造商的指示。Tetramethylbenzidine(三甲)(3,3,5,5-tetramethylbenzidine)是用于比色反应、光密度是衡量使用标(Bio-Rad 2550读者环评,美国)。正常细胞因子的浓度,它们被用作总蛋白质的现代肠匀浆nanodrop(美国热费希尔科学)。结果表示在pg /毫克。
2.5。统计分析
统计分析使用GraphPad棱镜8.0.1(美国GraphPad软件)。定量变量的分布的正常使用Shapiro-Wilk测试验证。两组比较,Mann-Whitney使用测试数据与非正态的分布。结果分析了如动物体重使用双向方差分析(方差分析)测试。相关性,斯皮尔曼的测试使用。结果被认为是具有统计学意义 。
3所示。结果
传播寄生虫的计数显示缓慢的交通寄生虫血症(图1(一))。它开始在9天后感染和拒绝完全60天。峰值观察感染后33天。在30天的感染(图1 (b)),有一个重量显著降低培养液的日子相比,( ),持续不断,直到90天( )。动物没有感染逐渐体重(0天到30天相比, ,90天, )。
(一)
(b)
分析影响在急性和慢性感染,早期进行组织学评估。关于炎性浸润的存在(图2(一个)),在急性期,100%的动物显示中度炎性浸润(1.30 - -2.06)(图3(一个))。在早期慢性阶段,50%的动物具有轻度炎性浸润在小肠(0.75 - 1),另一半作为温和的(1.15 - -1.46)(图3 (b))。虽然有减少,实验时间(没有区别 )(图2(一个))。虽然无鞭毛体巢穴的量化是不执行,只有一个无鞭毛体巢中发现了一只老鼠在感染的急性期(图3 (c))。
(一)
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(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
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(我)
对于肠肌神经节神经,降低急性期是一个行列式的结构,这是证明了相比明显降低各自的未感染组( )(图2 (b))。相同的观察比较早期慢性阶段和其各自的控制( )。然而,90天的感染并不足以继续破坏ganglia相比,发现在急性期( )。在对照组,观察肌间神经丛结构保存(图3 (d)),在急性和慢性阶段。混乱和入侵的炎症细胞接近观察神经元的结构(数据3 (e)和3 (f)分别)。
胶原蛋白沉积过程在急性期开始,一直持续到早期慢性阶段,这是证明了相应的控件(之间的区别 和 ,)(图2 (c))。然而,90天的感染已不再足以增加胶原蛋白沉积相比,30天( )。虽然未受感染的小鼠肠道胶原蛋白(图3 (g)),是一个伟大的优势的胶原纤维沉积在受感染的小鼠肠道黏膜下层两次实验(数字3 (h)和3(我))。然而,沉积在粘膜和肌肉也被观察到。
使用细胞因子在两个时间点来分析肠道免疫反应。干扰素-γ(图2 (d))和肿瘤坏死因子-α(图2 (e)),促炎细胞因子,调节在急性期与相应的控件(相比 和 ,分别)。此外,肿瘤坏死因子的水平α和干扰素-γ在早期慢性阶段仍然很高,没有区别急性水平( 和 ,),但相比差异各自的控制( 和 ,分别)。il - 10(图2 (f)),只在早期抗炎细胞因子,调节慢性阶段相比,急性期( )显示趋势和相应的控制( ),这意味着试图控制免疫反应。
观察后,在急性和慢性阶段,早期有组织学变化(增加炎性浸润、神经破坏和胶原沉积)和维护(IFN -促炎的概要文件γ和肿瘤坏死因子-α),试图规范(il - 10),和下一个目标是评估这些因素之间的关系经过90天的感染。因此,它是观察到的增加干扰素-γ(图4(一))和肿瘤坏死因子-α(图4 (b))表现出显著的负相关,减少肌间神经丛神经中枢( 和 和 和 ,分别)。然而,il - 10(图4 (c))没有与这个下降( 和 )。此外,只有增加干扰素-γ(图4 (d))显著相关并积极与肠道胶原沉积的增加( 和 ),而肿瘤坏死因子-α(图4 (e))和il - 10(图4 (f))没有显著相关性( 和 和 和 ,分别)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
本研究的重点是评估哥伦比亚菌株是否能诱导C57Bl / 6小鼠肠道免疫病理变化在急性和慢性实验性早期阶段。我们的结果表明,在急性期,有肠道的变化,如增加炎性浸润,神经的破坏,和胶原沉积,以及维护与促炎细胞因子在炎症过程的早期慢性阶段。
参与系统我和代表biodema三世,哥伦比亚,被定义为其增殖能力较低,最大峰值接近30天,myotropism [22,23]。此外,t . cruzi感染的特点是过度减肥在实验模型中,主要是在老鼠身上。这些发现证实了我们的模型。这个减肥可能与炎症过程,尤其是循环促炎细胞因子的存在,比如TNF -α和干扰素-γ在实验模型中,这可能是与恶病质(24,25]。
和其他菌株的感染哥伦比亚的压力t . cruzi诱发炎性肠渗透的外观(4,22,26,27),这也印证了我们的模型的结果。然而,渗透在小肠的强度可能取决于使用的应变和培养液浓度感染(4,9,28]。据报道,感染菌株Y,例如,不维护炎症过程,直到慢性阶段,与观察是什么在哥伦比亚应变4]。这表明感染哥伦比亚应变更为严重和停留更长时间。
表型,炎性浸润在人类chagasic巨结肠呈现大量的单核细胞、CD3尤其如此+淋巴细胞(29日]。此外,嗜酸性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞(CD68+)、自然杀伤细胞(CD57+)和细胞毒性T淋巴细胞(TIA-1+)也报告发生了这些人的器官30.,31日]。这些细胞和炎症过程的维护与神经破坏,肠道重建和发展chagasic巨结肠和巨食管32]。此外,细胞出现在肠神经系统,如肠胶质细胞,也与CD的发展(31日]。然而,这些细胞的作用需要更好的理解。从这个不同的细胞微环境,促炎细胞因子和监管,和杀微生物剂组件,如一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)可以由不同的细胞类型和引起神经元死亡32]。虽然这些细胞的描述并不在我们的研究中,证明了炎性浸润和促炎细胞因子在急性与慢性持续阶段,这是与神经的破坏。
此外,维护肠道炎性浸润的强度发现在我们的研究中,这可能与促炎细胞因子(干扰素的生产γ和肿瘤坏死因子-α)也保持直到早期慢性阶段。干扰素-γ是一种细胞因子最密切参与抵抗t . cruzi感染(33- - - - - -35),参与细胞内复制的抑制寄生虫的35),激活和维护的T辅助(Th) 1响应,和生产的抗体(36]。在感染小鼠的抑制细胞因子,例如,影响寄生虫血症的增加,生存,减少和降低生产34]。干扰素-协同γ肿瘤坏死因子-α激活巨噬细胞与杀菌剂的概要文件和结果的破坏细胞内寄生虫的形式;因此,它的作用在感染的控制37]。
调节细胞因子il - 10的情况下,只有在早期慢性阶段,增加肠。微分生产il - 10的一个参数,允许分化菌株感染后(38]。哥伦比亚的研究,使用克隆菌株,坳cl1.7,表明il - 10的应变诱发更大的生产相比,建立的感染菌株Y在单核细胞在体外38]。在长期的实验模型阶段,它也表明,Y应变不诱导细胞因子的生产变化在动物的肠10]。因此,建议增加肠道中观察到我们的研究与控制组织损伤的代偿机制由于强烈的哥伦比亚应变引起的炎症过程,也被建议在实验chagasic心脏病(20.]。
然而,激烈的炎症过程建立在肠道也与组织损伤有关,尤其是神经破坏(12,39]。Arantes et al。(2004),使用C57Bl / 6基因敲除小鼠伊诺和干扰素-γ血液感染100 trypomastigote形式的应变Y,证明没有没有是神经元生存的行列式的感染后10天。未能通过干扰素-诱导没有生产γ避免去神经通过氧化应激在模型实验急性期(12]。这一发现或许可以解释TNF -之间的负相关α和干扰素-γ和神经中枢的肌间神经丛发现在我们的研究中。因此,促炎细胞因子,更多的是,更少的是结肠的神经元。
除了肿瘤坏死因子的参与α干扰素-γ,没有其他机制相关的神经破坏CD。物质 ,神经肽,已被证明是提高扩张的部分患者chagasic巨结肠,这增加已被证明是相关的感应/维护肠道炎症和白细胞趋化作用,这可能与神经损伤(40,41]。此外,肥大细胞产生的蛋白酶,如类胰蛋白酶,与神经元死亡患者chagasic巨结肠,主要通过减少免疫反应性的PAR2神经元(42]。我们组表明2型骨形态形成蛋白与神经破坏和维护的肠促炎在急性期实验模型Y病毒感染(10]。
因此,干扰素的正相关γ与胶原蛋白沉积也可能是相关的,因为纤维化组织的破坏。相反之前发现了Y应变,它只包括增加结缔组织实验感染在慢性阶段(5,10),我们的研究表明,胶原纤维沉积的过程甚至开始在哥伦比亚菌株感染的急性期。什么也可以连接建立的事件相关的炎症过程,促炎细胞因子的生产,破坏神经元,胶原纤维沉积。
从这些结果,很明显,哥伦比亚应变也可以用于实验模型研究肠道的CD形式。这项研究的结果有助于理解相关的机制的形成和发展恰加斯巨结肠。
数据可用性
所有的数据用于支持本研究的结果都包含在这篇文章中,人物,和引用。
伦理批准
所有程序涉及动物是符合伦理委员会的使用动物戈亚斯的联邦大学,和伦理批准获得同样的委员会(协议号:051/19)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
何塞•罗德里格斯做否决权和阿瑟·威尔逊Florencio da Costa同样对本文亦有贡献。
确认
我们感谢联邦大学的Triangulo米内罗和戈亚斯的联邦大学。此外,我们要感谢Triangulo米内罗的联邦大学的员工:Alberto Borba Crislaine席尔瓦,埃德森桑托斯Liliane Araujo)和Vandair Goncalves一般病理学科的一部分。作者欣赏慰问的金融支持Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq)和Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩)。