文摘

牙周炎是成年人牙齿脱落的主要原因,和心理因素在牙周炎的发展起着重要的作用。阐明心理压力的负面影响牙周炎组织的炎症过程和氧化还原状态,五十个男性Sprague-Dawley老鼠分为控制、实验性牙周炎,心理压力,实验性牙周炎+心理压力,实验性牙周炎+心理压力+氟西汀组。慢性不可预知的轻微的压力(和)被用来建立心理压力,和丝绸结扎诱导实验性牙周炎。4周后,强调老鼠显示改变行为,血清激素水平,和蔗糖的偏好。更明显的牙槽骨丢失和附件损失和更高的蛋白质的表达观察炎性细胞因子在实验性牙周炎+心理压力集团。和和牙周炎的组合协同对提高低氧诱导因子- 1的影响α(HIF-1α)蛋白表达和活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶活动减少而压力或牙周炎组。此外,心理压力进一步增加导出κBα和p-NF -κ我p65蛋白水平和减少κBα在牙周炎大鼠蛋白质含量。氟西汀政府缓解心理压力的负面影响在大鼠牙周炎的发展。这些结果提示我们,心理压力会加重牙周炎的炎症组织,这可能是部分原因是局部恶化的氧化损伤,进一步激活核因子kappa-B (NF -κB)信号通路。

1。介绍

慢性炎症性疾病,牙周炎牙表皮脱落的主要原因是由于严重的炎症反应和牙周组织的破坏1]。虽然目前普遍认为细菌是牙周病的主要aetiologic因素(2),它不容忽视的地方,系统性,和行为的主机环境影响宿主的抗感染牙周微生物可以修改牙周炎的发病和进展3,4]。

心理状态,尤其是心理压力,在日常生活中起着重要的作用,可以引起的各种各样的压力,有可能威胁到个人的体内平衡,幸福,健康,或生存5]。心理压力之间的关系和牙周炎最近在很大程度上证明6,7,8),已被确认为牙周疾病的潜在风险因素在一些观察性研究[9,10]。同时,研究人员建立了一个条件性恐惧压力模型和物理约束模型大鼠诱发心理压力和证实,压力与牙槽骨丧失的发展改变了排名和RANKL表达以及牙槽骨的质量(11,12]。一些研究甚至表明,心理社会应激有更大的影响力比病原菌牙周炎症的严重程度(13]。我们以前观察到的现象延迟牙周炎治疗过程中心理压力引起的大鼠慢性不可预知的轻微压力(和)14]。和程序已广泛应用于啮齿动物和很可能模仿人类经验在日常生活中各种压力(15,16]。因此,阐明在牙周炎的发展其重要作用将进一步丰富我们知识的牙周疾病的病理过程。

长期的压力会降低血氧饱和度和增加耗氧量,从而揭露组织缺氧(17]。微循环障碍涉及交通拥堵的静脉床和当地出血引起的牙周组织心理压力还表明,牙周组织可能会经历一个从normoxia转向缺氧时炎症启动和进展18]。氧化还原内稳态扰动在厌氧条件下,导致氧化剂之间的失衡和抗氧化防御系统。这导致氧化应激,这已经证明破坏牙周健康(12,19,20.]。核转录因子(NF -κBκB)是一个转录因子,无数的生物功能,包括调节各种促炎因子的表达参与炎症(21]。在各种各样的NF -κB受体激动剂,自由基发挥重要作用导致NF -的激活κB (22),这是与牙周炎(hyperinflammatory响应和inflammation-induced损伤有关23]。然而,当地的氧化还原状态和NF -κB表达牙周炎大鼠暴露于心理压力仍不清楚,这可能限制我们对潜在的心理机制的了解牙周炎的病因学。

因此,在本研究中,我们诱导及模型研究心理压力的影响在现有牙周损害。此外,当地的氧化还原状态和NF -κB表达在牙周组织以及他们的潜在角色压力条件进行了探讨。此外,氟西汀的拮抗效应减轻心理压力引起的牙周破坏的加剧是验证。

2。材料和方法

2.1。动物和分组

五十岁男性Sprague-Dawley老鼠(8周大,210 - 230 g)从我们的大学了。他们是10大鼠随机分为5组,即。C组,由控制老鼠;EP组,由大鼠实验性牙周炎;PS集团由大鼠暴露于心理压力;EP + PS组,由大鼠实验性牙周炎暴露于心理压力;博士和EP + p +集团组成和实验性牙周炎大鼠暴露于心理压力与氟西汀治疗。所有的老鼠被安置在一个温控房间 °C和12小时光/暗周期(灯从喂饲20:00)和食物和水可以随意。在实验开始之前,动物适应实验室条件1周。本研究进行了严格按照美国国立卫生研究院的建议指导实验室动物保健和使用的8023号(NIH出版物,1978年修订)。动物研究伦理委员会批准的协议是我们的大学口腔学院的(2015048)。是尽一切努力防止动物痛苦的在每个阶段的实验。在图所示的实验方案1。

2.2。建立动物模型和药物管理局

EP组的大鼠,EP + PS组和EP博士+ p +组是由腹腔内注射1%戊巴比妥钠麻醉(3.5毫克/公斤)准备在无菌生理盐水,和一个4 - 0丝结扎的子宫颈周围放置正确的第二个上颌磨牙诱导实验性牙周炎如前所述[14]。结扎保留口腔微生物和保持固定,直到实验结束。和协议是改编自崔等描述的过程。24]。老鼠在PS组,EP + PS组,和EP + p +七博士集团受到不同的压力,即。,food deprivation (12 h), water deprivation (12 h), damp sawdust (24 h), restraint stress (1 h), immersion in cold (4°C) water (5 min), immersion in hot (45°C) water (5 min), and inversion of the light/dark cycle. Each day, a random stressor was applied, and the same stressor was used only once per week to avoid stress habituation in the rats. Fluoxetine (5 mg/kg, Eli Lilly, Indianapolis, IN, USA) was dissolved in saline and administered to the rats in the EP+PS+DR group by gavage every day. The dose of fluoxetine was determined based on a report by Bonilla-Jaime et al. [25]。实验持续了4周,行为测试,蔗糖偏好测试,进行了血清学、形态学观察、生化检测的所有动物在每组实验的最后。

2.3。开放的现场试验

开放领域室(RD1412-OF,上海移动数据信息技术有限公司,上海,中国)组成的 有机玻璃框在这个测试。本室放置在一个温度控制的房间,是被一个荧光室暂停。每个老鼠被一个数码摄像机监控15分钟量化中心的时间和总行驶距离。每次测试后,迷宫是用20%的乙醇清洗消除之前的实验老鼠的气味和其他痕迹(24]。

2.4。蔗糖偏好测验

开放的现场试验后,蔗糖偏好测验进行如前所述[26最后本研究。测试前,动物被安置在单独的笼子里,剥夺了24小时的食物和水。然后,每个老鼠收到1瓶水和1瓶1%蔗糖。蔗糖溶液的体积和水的消耗记录在24小时内。蔗糖的偏好,这表明快感缺乏,被定义为蔗糖消耗的体积比蔗糖和水消耗的总量。

2.5。样品制备

24小时蔗糖偏好测验后,老鼠被戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(50毫克/公斤体重)。从视网膜静脉获得血液样本立即离心(4°C, 4000 rpm, 15分钟)当老鼠完全麻醉,然后储存在-80°C到血清进行了检测。血液样本集合后,老鼠被颈椎脱位牺牲。对周围的牙龈组织第二个上颌磨牙是仔细立即删除并保存在-80°C为进一步生化分析和免疫印迹。正确的上颌骨立即删除并固定在10%福尔马林> 48小时。随后,脱钙作用在15% EDTA溶液在室温下进行6周。Five-micron-thick paraffinized组织获得的部分沿着mesial-distal轴被苏木精和伊红染色histomorphometric分析())。

2.6。血清学试验

吸气血清整除被用来测量皮质酮(CORT)和促肾上腺皮质激素(ACTH)内容使用老鼠ELISA试剂盒(上海Westang生物有限公司,上海,中国)根据制造商的指示。

2.7。Histomorphometric分析

Histomorphometric分析在100 x光显微镜放大。牙槽骨丢失和附件损失进行评估通过测量cement-enamel结之间的距离和牙槽骨嵴之间的距离cement-enamel结和交界上皮附件,分别为(8、14)。

2.8。测定氧化应激标志物水平

活性氧(ROS)的水平(特别是H₂O₂)和丙二醛(MDA)和抗氧化剂的活动(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT),以及谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶))牙龈组织中检测到相应的分析工具(南京建成生物工程研究所、南京、中国)根据制造商的指示。光密度值(OD)与一个微型板块读者阅读(美国BioTek Winooski, VT)。

2.9。西方墨点法

牙龈组织细胞溶解使用NP40裂解缓冲(Elpis生物技术,Seo-gu、大田、韩国)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国Sigma-Aldrich)。蛋白质浓度的溶菌产物由布拉德福德评估分析(美国加州Bio-Rad)。等量的蛋白质(20μg)受到10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物膜(Bio-Rad大力神,CA)、原发性il - 1抗体孵化β、il - 6、TNF -α干扰素-γ,HIF-1α磷酸化,我κBα(导出κBα),我κBα磷酸化NF -κB p65 (p-NF -κB p65)(1: 1000年,圣克鲁斯生物。Inc .)、美国),和β肌动蛋白(1:1000,细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)一夜之间在4°C。膜被洗Tris-buffered盐水含0.1%渐变20,对待特有辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:5000年,圣克鲁斯生物。美国Inc .)在室温下1 h。膜清洗一次,可视化使用增强化学发光试剂盒(美国微孔)。光密度分析蛋白质的乐队使用Bio-Rad数量执行一个软件(美国Bio-Rad)。所有样品都是在重复运行在不同的凝胶,和蛋白质表达水平相对的β肌动蛋白在任意单位。

2.10。统计分析

所有数据用SPSS 17.0软件进行分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。数据的正态分布进行了测试,qq的情节。当统一的方差被Bartlett的测试发现,每个测量之间的显著差异由单向方差分析(方差分析)和Bonferroni事后测试。数据表示为 。统计学意义是 。

3所示。结果

3.1。行为的改变

如图2PS老鼠和EP + PS老鼠的时间显著短中心( ,图2(一个))和旅行明显更短的距离比控制老鼠和实验性牙周炎大鼠( ,数据2(一个)和2 (b))。然而,氟西汀有效地逆转这一行为的改变( )。

3.2。蔗糖的偏好改变

如图3蔗糖偏好的老鼠在PS组和EP + PS组低于C组的老鼠和EP组( ),这变化是逆转后氟西汀管理局( )。

3.3。CORT和血清ACTH水平

CORT和ELISA表明心理压力明显增加血清ACTH水平在老鼠PS组和EP + p组与C组和EP组( ,图4)。这些与压力相关的激素水平升高的压力抵消(后恢复正常 ,图4)。

3.4。牙槽骨丧失和附件损耗测量

如图5,牙槽骨丧失和附件损失增加的牙周炎大鼠相比,控制大鼠( ),和这些现象进一步加剧了心理压力的EP + PS组大鼠相比,EP组大鼠( )。然而,并没有改变在牙槽骨丢失或附件只老鼠暴露在心理压力损失( )。氟西汀histomorphometry消除压力的影响( )。

3.5。炎性细胞因子蛋白表达

如图6,没有明显的il - 1蛋白表达的变化β、il - 6、TNF -α或干扰素-γ观察大鼠暴露于心理压力较C组大鼠( ),而这些炎性细胞因子的蛋白质含量在牙周组织中显著增加大鼠EP组相比,C组大鼠( )。增加更明显在大鼠实验性牙周炎和心理压力同时相比其他实验大鼠( )。缓解心理压力逆转细胞因子蛋白表达的增加相比,老鼠在EP + PS组,虽然仍有老鼠在C组之间的差异和EP + p +博士集团( )。

3.6。HIF-1α蛋白表达

图7(一)显示了HIF-1α蛋白质的乐队。我们发现牙周炎HIF-1增加α在牙龈组织蛋白表达( ,图7 (b)),也观察到类似的结果在PS组大鼠( ,图7 (b))。两者的结合增加HIF-1刺激有协同效应α蛋白表达与EP组和PS组( )。EP组之间的差异,PS组和EP + p +博士组取消删除(心理压力时 ,图7 (b))。

3.7。氧化应激指标

如图8控制的老鼠相比,增加ROS、MDA生成的牙周炎大鼠和老鼠(强调 ,数据8(一个)和8 (b))。心理压力进一步增加上述两个指标在牙周炎组织( ,数据8(一个)和8 (b))。同时,SOD、猫和氧化酶活动是减少在EP组和PS组和EP + PS组降低更明显比EP组或PS组( ,数据8 (d)- - - - - -8(f))。氟西汀发现发挥治疗作用,纠正异常牙龈氧化还原状态通过逆转ROS、MDA含量的增加和减少抗氧化酶活动( ,图8)。

3.8。表达式的NF -κB Signalling-Related蛋白质

如图9,没有发现显著差异》的蛋白表达κBα,我κBα或p-NF -κB p65之间控制老鼠和老鼠强调( ,数据9 (b)- - - - - -9 (d))。然而,有增加导出κBα和p-NF -κB p65蛋白水平和减少κBα蛋白质含量在牙周炎大鼠相比,控制大鼠( ,数据9 (b)- - - - - -9 (d))。上述参数的变化更明显在EP + PS老鼠和老鼠EP ( ,数据9 (b)- - - - - -9 (d))。氟西汀逆转的不利影响心理压力的表达式NF -κB signalling-related蛋白质在一定程度上( ,数据9 (b)- - - - - -9 (d))。

4所示。讨论

本研究表明,心理压力改变了激素和老鼠的行为。更严重的牙周损伤和炎症观察大鼠牙周炎时收到了心理压力。此外,压力和牙周炎的组合对牙周HIF-1协同的不利影响α蛋白表达、当地的氧化还原状态和NF -κB激活。可以缓解上述观察氟西汀。

经济和社会的快速发展,人们从心理压力不可避免地遭受由于竞争日益激烈和多样化的社会价值观。理解心理压力的重要作用的口腔健康吸引了大量关注近年来研究者和临床医生,包括牙周炎被视为成人牙齿脱落的主要原因。临床研究表明,强调患者表现出更斑块积累,更高的牙龈指数,增加的il - 6水平观察牙龈沟液内细胞激素和皮质醇(GCF) [27]。牙周治疗的治疗效果差是由于心理压力(9]。牙槽骨量的丧失在牙周炎症组织中可以通过治疗干预措施缓解动物作战压力(11]。所有这些事实表明心理压力的重要作用在牙周炎的发展。

和过程用于本研究利用七压力,其中每个应用随机老鼠(14,24]。这个过程被认为是不仅提供一个现实的模拟日常生活的压力,也能够有效地防止习惯重复的压力(15,16]。在最近的研究中,总距离的减少和中央区域持续开放的现场试验表明,好奇心和倾向于强调老鼠的自发活动减少(28]。附带的结果增加CORT、ACTH含量以及降低蔗糖偏好,在这项研究中我们证实和协议诱导类似抑郁状态的PS和EP + PS的动物。此外,因为它导致菌斑滞留,在这项研究中使用的方法:把一个结扎在牙齿被广泛用于建立牙周疾病在动物8,11,12,14]。虽然我们没有发现任何变化在牙槽骨丢失,附件丢失,或细胞因子蛋白表达强调齿龈的老鼠,我们确认这些参数恶化等多重压力的老鼠用丝绸ligature-induced牙周炎。这些结果表明,压力还不足以破坏牙周形态或影响当地的牙周炎症状态但可能促进现有的破坏和炎症。炎症过程诱导单核细胞和巨噬细胞释放细胞因子的反应细菌产品负责的牙周膜在牙周炎29日,30.]。最近的报告也表明,应激激素增加革兰氏阴性细菌生长(31日]。因此,加速牙周破坏后心理压力可能会通过增加细胞因子生产后续牙周病原体的生长。

有趣的是,在目前的研究中,我们发现,和类似的效应为牙周炎的HIF-1增加α在牙周组织蛋白表达和ROS生成。此外,减少活动的SOD、氧化酶和猫,这是典型的抗氧化剂防御酶和MDA含量增加,这表明脂质氧化(32),观察大鼠的EP组和PS组。以前的动物研究表明微循环障碍发生在牙周组织由于心理压力(18]。此外,HIF-1α厌氧状态的指标(33反应,氧化应激是一个次要的缺氧微环境(34]。的激活HIF-1α和NF -κB在PDL细胞和牙周疾病缺氧情况下显示伴有脂多糖刺激(35]。因此,它是合理的假设缺氧发生在牙周组织(36当老鼠经历长期的压力。Lopes卡斯特罗et al。12]报道氧化不平衡的血液样本,并考虑氧化和抗氧化作用可以使具有潜力的不平衡或生成牙槽骨损伤长期强调老鼠。在当前的研究中,我们第一次观察到当地异常氧化还原的趋势是在心理压力后的齿龈发炎。这些发现表明,健康的牙周膜容易受到氧化应激,导致炎症反应,和牙周组织中氧化还原系统的干扰可能导致释放更多的ROS、MDA以及抗氧化活动持续下降的心理压力。身体上,形成氧化剂和抗氧化剂之间存在一种微妙的平衡在生物防御。然而,缺氧扰乱这种平衡,导致氧化应激,已与许多疾病的发病机制,包括牙周炎(34]。结扎引起的牙斑港口大量的细菌病原体刺激宿主细胞释放多种促炎细胞因子可以吸引polymorphonucleocytes(中性粒细胞)感染的网站(37]。中性粒细胞面对这种细菌挑战通过生产蛋白水解酶和O₂通过氧化破裂。人体的抗氧化系统功能少解毒和修改ROS活性物种。抗氧化系统的破坏造成并发炎症和心理压力诱发严重的氧化损伤牙周组织。我们的研究结果支持最近的一份报告表明,应激激素促进毒性和氧化应激基因的表达Porphyromonas gingivalis(38]。

NF -的激活κB已被证明会诱发许多炎性细胞因子的表达和参与许多炎症性疾病21,23,39]。基底upregulation NF -κB和其目标基因在患病的牙周韧带成纤维细胞(PDLFs)相比,健康PDLFs [23的差别),而对这些NF -κB可能会降低细胞因子的水平和TRAP-positive多核细胞的数量ligature-induced牙周疾病大鼠(39]。我的水平κBα导出,κBα,p-NFκB p65通常检测来确定NF -κB信号通路被激活(40]。在最近的研究中,增加导出的蛋白表达κBα和p-NF -κB p65蛋白表达减少κBα观察在EP组大鼠牙周炎组织,表明NF -κB激活。一些研究显示精神压力引起的NF -调制κB在某些器官和激活细胞(41,42]。我们观察到类似的蛋白质过度和underexpression趋势》κBαp-NF -κB p65,和我κBαPS组大鼠,但显著差异并没有证实。然而,激活NF -的促进作用κB被发现的证据表明,上述变化更明显比较EP + PS老鼠和老鼠EP。我们所知,这是第一个研究来评估在NF -心理压力的影响κB信号在一个实验性牙周炎大鼠模型。贾et al。43]表明,持续激活NF -κB由活性氧参与胃损伤大鼠应激的发病机理。事实上,促炎因子和活性氧都知道刺激转录因子NF -κB (44,45]。有人可能会因此推测,NF -进一步激活κB信号发生在牙周炎的齿龈强调老鼠,严重的炎症反应和氧化损伤。牙槽骨内稳态取决于功能之间的平衡成骨细胞和破骨细胞(46]。展品与牙周炎的发展,齿槽骨骨吸收由于不正常的骨重建。先前的研究已经报道,促炎细胞因子NF -驱动κB是强大的信号,调节成骨细胞和破骨细胞活动(47),和NF -κB信号激活破骨细胞的分化和激活是至关重要的这些细胞(48]。

氟西汀是一种经典的抗抑郁剂。我们使用氟西汀作为拮抗剂CUMS-induced抑郁症的大鼠血清激素水平异常,发现其政府逆转,蔗糖偏好的变化,以及行为改变。此外,氟西汀缓解心理压力引起的牙周破坏的加剧,尽管其影响局部炎症,氧化损伤,NF -κB超表达没有阐明。我们的研究结果表明,抗抑郁药物治疗能够调节brain-neuroendocrine-immune系统可以作为佐剂对牙周疾病管理(49]。此外,治疗,抑制氧化应激和激活NF -κB信号可能是重要的代理治疗牙周疾病的炎症反应。

心理压力是参与HPA轴的激活产生一致的监管影响周围炎症(50,51]。基于目前发现的加重牙周损伤和炎性细胞因子的表达增加压力状态,有趣的是讨论HPA轴的潜在作用在未来的研究。同时,除了萧条(great depression)在这项研究中,焦虑是在日常生活中另一个常见的紧张情绪。因此,进一步的研究也应该确定焦虑对牙周炎的病理过程的影响,这将有利于我们进一步理解心理学在牙周炎的病因学中的作用。

5。结论

总之,心理压力就不会引起牙槽骨丢失或附件损失但可以加剧现有的牙周炎,这可能与当地的参与氧化损伤和NF -κB信号激活。因此,为了达到更好的结果,牙医时应考虑心理因素治疗牙周病患者在诊所。

数据可用性

数据请求从羌族Li博士((电子邮件保护))。

信息披露

资金来源没有参与研究的任何部分,写的手稿,或决定提交出版的手稿。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

羌族和李Yajuan赵同样都贡献给了工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(82071136号,81701002,和81500851)和独立项目的军事口腔学国家重点实验室(2020号za03)。