文摘
几项研究已经表明,神经炎症是围手术期的关键神经认知障碍(PND);然而,具体机制和麻醉时间均尚未完全阐明。本研究旨在探索P2X4的影响/ NLRP3信号通路在神经炎症和手术后认知障碍。12-14-month-old雄性C57BL / 6小鼠接受开放性胫骨骨折手术,七氟醚麻醉管理P2X4R抑制剂5-BDBD或生理盐水腹腔手术后连续3天。然后,动物受到莫里斯水迷宫测试或牺牲收集海马体。P2X4R和NLRP3估计通过免疫印迹,小胶质细胞的激活是通过免疫组织化学检测,和TNF的表达α,il - 1β通过酶联免疫吸附试验,il - 6是量化的。这些结果表明,胫骨手术引起的认知障碍,增加P2X4R的表达和NLRP3,加重神经炎症和小胶质细胞的激活。然而,腹腔内注射5-BDBD减弱这些影响。总之,这些发现表明,P2X4 / NLRP3途径可能参与患产后抑郁症的病理生理学。
1。介绍
围手术期神经认知障碍(PND)是一种常见的术后并发症,表现为围手术期记忆、注意、执行能力、语言能力等认知功能下降(1]。它不仅延误病人的恢复过程,延长住院时间,还会增加患者的经济负担和社会2]。尽管患产后抑郁症的机制尚未阐明,越来越多的证据表明存在患产后抑郁症(密切相关3]。
以前的研究已经表明purinergic ionotropic (P2X)受体和神经炎症密切相关4]。过程中炎症,刺激细胞释放ATP,而移植purinergic受体的表达(P2X1-7),进而产生大量炎症因子和调节神经兴奋(5]。在众多P2X受体,P2X4最丰富,广泛分布在中枢神经系统(CNS) [6]。重要的是,P2X4主要表达在小胶质细胞(7]。一些研究发现,调节P2X4受体激活小胶质细胞,产生多种促炎细胞因子,促进神经炎症,最终导致神经毒性和神经细胞受损8]。此外,P2X4受体也参与多种神经炎症疾病,如癫痫(9),缺血性中风(10),和神经性疼痛11]。然而,P2X4的影响和在患产后抑郁症的底层机制尚未研究。
nod样受体蛋白3 (NLRP3) inflammasome(一种细胞内蛋白质复杂,加剧神经炎症12]。几项研究已经证明,NLRP3小胶质细胞中高度表达,参与的合成inflammasomes通过招募apoptosis-related点的蛋白质含有半胱天冬酶招聘领域(ASC)和caspase-1前体(13,14]。越来越多的证据表明促炎细胞因子诱导NLRP3与患产后抑郁症,和防止NLRP3-induced神经炎症减少认知功能障碍(15,16]。值得注意的是,促炎细胞因子的释放和NLRP3 P2X4激活炎症期间的一个重要下游事件(17,18]。因此,我们调查是否P2X4-NLRP3途径导致患产后抑郁症的发病机制。
在此,我们旨在确定P2X4受体参与由加重患产后抑郁症的神经炎症,也检查了NLRP3 inflammasome对下游P2X4的机制障碍。
2。材料和方法
2.1。动物
12-14-month-old雄性C57BL / 6小鼠(30克)购买实验动物中心的浙江省,中国。批准的实验动物保健和使用委员会宁波大学,和随后的过程指导的护理和使用实验动物的国家机构。老鼠保持在22 - 24°C和合适的环境光/暗周期12 h。
2.2。麻醉和手术
麻醉和手术的过程进行了描述(前19]。简单地说,麻醉诱导与3%七氟烷和2%七氟醚用于维持麻醉使用设备(R500SE、RWD生命科学、深圳、中国)。随后,鼠标的左下肢剃,消毒,然后进行开放性胫骨骨折操作。首先,正中切口是左边的后爪的老鼠。胫骨钻了一个洞,和一个0.38毫米针插入髓内管。接下来,我们的肌肉分离,执行一个低三分之一的胫骨截骨术,并与4/0缝线缝合皮肤缝合。Ropivacaine注射局部止痛,红霉素软膏局部使用,防止感染。老鼠从麻醉中恢复过来后,他们被关在笼子里。
2.3。实验小组
理解P2X4-NLRP3通路在患产后抑郁症的影响,我们对待动物P2X4R-selective对手5 - (3-bromophenyl) 1, 3-dihydro-2H-be-nzofuro(3双电子)1,4-diazepin-2-one (5-BDBD)(美国Sigma-Aldrich)(28毫克/公斤,i.p。)或生理盐水手术后连续3天(18]。所有的动物被随机分为四组:(1)对照组(CON);(2) 集团( );(3)手术小组(SUR);和(4) 集团( )。避免行为测试的假定的干扰炎症标记物,有些动物在每组牺牲3天后手术对脑组织生化,而其他人则受到行为测试。实验流程如图1。
2.4。行为测试
复苏的两天后,老鼠接受了莫里斯水迷宫测试评估认知功能(微波加工)3天时间均。实验过程是前面描述的19]。短暂的,测试是在一个循环水箱直径120厘米,30厘米的深度。水箱里的水是白色的,和温度保持在26°C。坦克被划分为四个象限。10厘米的圆形平台0.5厘米低于水面在第三象限。实验分为5天采集过程和探针测试6天。在实验开始收购,老鼠被放置在每个象限的边缘(不含第三象限),和时间来寻找平台被记录。如果鼠标没有找到这个平台在60年代,录音时间是60年代;然后,鼠标是引导平台,在那里呆了15秒。平台被检测测试期间,老鼠被放置在第一象限的边缘。 The number of times the mice crossed the platform, the distance, and time in the target quadrant in 90 s was recorded. A video tracking system (EthoVision XT, Noldus Instruments, Wageningen, Holland) was used to record the trajectory and related parameters of the mice.
2.5。免疫印迹(WB)分析
老鼠牺牲七氟醚,在手术后3小时,然后从脑组织海马切除。我们之前描述的实验研究[20.]。简而言之,海马体是均质里帕缓冲区,和溶菌产物被离心澄清12000×g, 4°C 25分钟。上层清液中的蛋白质浓度测定,分离的一个等价的8 - 12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。然后,膜被60分钟和探测主要抗体在4°C:山羊多克隆anti-P2X4 (nbp2 - 27567, 1: 1000;表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国),兔单克隆anti-NLRP3 (ab263899, 1: 1000;美国马Abcam)和反β肌动蛋白(A3853 1: 2000;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。随后,膜被孵化与相应的二次抗体:兔抗体免疫球蛋白(S0001, 1: 10000;亲和力生物科学,辛辛那提,哦,美国)和山羊anti-rabbit免疫球蛋白(A16110, 1: 10000;英杰公司)。随后,一种增强化学发光检测工具是用来观察免疫反应性的乐队和确定带的强度通过光密度分析。相对蛋白质含量标准化beta-actin。
2.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)
七氟醚麻醉下的小鼠安乐死,然后海马组织很快就被收集在一个冰箱。肿瘤坏死因子-α(TNF -的浓度α;ab208348 Abcam) interleukin-1β(il - 1β;ab197742 Abcam,马、美国)和il - 6 (ab222503 Abcam)在海马体是量化,根据制造商的说明使用酶联免疫试剂盒。炎症介质的浓度在pg / mg表示。
2.7。免疫组织化学
免疫组织化学的方法是如前所述21]。麻醉后,老鼠连续灌注生理盐水和4%多聚甲醛(PFA)的心。然后,脑组织切除,固定在4% PFA 24 h,沉浸在15%和30%蔗糖溶液24 h,分别切成25μ米厚片。随后,在4°C孵化的部分在0.1 PBS缓冲含有0.5% tritonx - 100和山羊anti-ionic钙结合适配器分子1 (Iba-1, 1: 500;Abcam),其次是孵化与二级抗体,Alexa 488 -共轭驴抗体抗体(1:500;Abcam)。共焦激光扫描显微镜(SP8、徕卡、法兰克福,德国)被用来拍照的片,和ImageJ软件(美国国家卫生研究院)被用来分析荧光强度。量化的Iba-1阳性细胞是由ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。简而言之,我们通过ImageJ移除图像背景并设置阈值,和相关的海马区域是手动概述区域(ROI)的兴趣。然后,Iba-1积极的面积和总荧光强度ImageJ ROI计算。相对Iba-1积极的区域和荧光强度的褶皱变化与对照组相比。图像采集和量化由盲实验。
2.8。统计分析
使用SPSS 22.0统计分析(美国芝加哥,IL)。所有的数据表示为 (SEM)。单向方差分析(方差分析),其次是Bonferroni事后测试,是利用。 显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。5-BDBD减毒的手术后认知障碍
来评估小鼠的认知功能,在手术后3天我们进行了微波加工。在收购过程中,延迟逃跑苏尔组显著长于天4和5,欺诈小组和延迟逃跑 组短于的苏尔组5天( ,图2(一个))。没有发现显著差异之间的游泳速度组( ,图2 (b))。在调查测试中,穿越平台的次数在组之间没有显著性差异( ,图2 (c))。然而,苏尔组相比,居住时间和距离目标象限中的欺诈和明显减少 组( ,数据2 (d)和2 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。5-BDBD抑制过度P2X4R和NLRP3手术后在海马体
检测功能的手术和5-BDBD P2X4和NLRP3在海马体中,我们检查P2X4和NLRP3世行的状态。P2X4的水平和NLRP3苏尔组显著增加比CON组( ;数据3(一个)和3 (b))。P2X4R和NLRP3的水平显著下降 组相比,苏尔组( ,数据3(一个)- - - - - -3 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。5-BDBD减轻手术后小胶质激活海马
鉴于小胶质细胞的神经炎症的关键影响患产后抑郁症的期间,我们评估Iba-1标记手术后3天通过免疫染色检测海马小胶质激活。CON组相比,Iba-1阳性细胞面积和荧光强度明显高于在苏尔集团( ,数据4(一)- - - - - -4 (c))。苏尔组相比,Iba-1阳性细胞面积和荧光强度都显著降低 集团( ,数据4(一)- - - - - -4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。5-BDBD减少了术后海马的神经炎症
为了进一步评估术后炎症在海马体中,我们使用ELISA检测il - 1的浓度β、il - 6和TNF -α在海马区手术后3天。这些细胞因子的水平的海马体苏尔组相比显著增加诈骗集团( ,数据5(一个)- - - - - -5 (c)),而水平明显下降 组比苏尔组( ,数据5(一个)- - - - - -5 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
ionotropic受体家族,P2X4受体已被确定为一个潜在的目标为中枢神经系统疾病在过去的十年里(6]。尽管P2X4受体在各种病理是有益的和有害的,他们在病理生理学中的作用尚不清楚。目前的研究表明,在老年小鼠胫骨手术后认知功能障碍和神经炎症,伴随着P2X4受体的过度表达。因此,我们推测P2X4受体可能参与患产后抑郁症的病理生理学胫骨手术造成的。
越来越多的证据表明,手术和麻醉导致严重的神经损失通过炎症,主要由白细胞、小胶质细胞、巨噬细胞(3,22]。尤其是小胶质细胞的主要参与者是大脑的免疫反应。此外,小胶质细胞功能障碍发生的麻醉和手术后可能会扰乱神经功能和诱导患产后抑郁症(23]。P2X4主要表达在小胶质细胞在中枢神经系统,这个受体参与各种功能在生理条件下(6,8]。重要的是,P2X4调节在许多模型涉及小胶质激活,如神经性和炎性疼痛(24],偏头痛[18),缺血(10癫痫],[9),阿尔茨海默病(25),和肌萎缩性脊髓侧索硬化症26),这与我们的研究结果是一致的。因此,我们假设抑制P2X4R期间患产后抑郁症的发病机制达到神经保护作用,防止小胶质激活和神经炎症。为了验证这个理论,我们应用一个特定P2X4R抑制剂5-BDBD手术后在老年小鼠和相关行为生化分析结果。
5-BDBD特定P2X4R拮抗剂(27),其饱和浓度没有影响P2X2a受体和P2X2b受体和不影响P2X7R的闸门。此外,它对P2X1受体P2X3受体的影响是可以忽略不计28]。因此,5-BDBD作为特定拮抗剂在病理生理学研究P2X4的角色。苯二氮衍生物,渗透5-BDBD血脑屏障的类似于其他类似的化合物(29日]。因此,在这项研究中,我们通过腹腔内注射5-BDBD管理。虽然没有研究尚未测试5-BDBD进入脑组织的渗透,在缺血性中风模型中,腹腔内注射5-BDBD显著降低激活的小胶质细胞和表面表达P2X4的脑梗死面积,以及浓度在血浆和脑组织实现神经保护30.]。此外,在脑出血模型,5-BDBD由口腔填喂法抑制脑组织P2X4的表达和激活的小胶质细胞(31日]。这些研究证明5-BDBD可以通过血脑屏障,说明高的不利影响表达式P2X4的脑组织。在当前的研究中,5-BDBD减少术后海马P2X4的表情,小胶质激活和炎症和扭转认知障碍。这些发现与之前的研究相一致,为患产后抑郁症的临床治疗提供了科学依据。
P2X4的机制激活术后患产后抑郁症的原因还不清楚。最近的研究表明激活P2X4-mediated NLRP3 inflammasome信号在多个模型32),包括大鼠的海马慢性疼痛和抑郁的并发症(33]。证据表明,NLRP3 inflammasome术后认知功能障碍的神经炎症密切相关(34]。研究已经证明,异氟烷引起的认知障碍与海马NLRP3的高表达,而这可以逆转的损害抑制NLRP3-caspase-1通路(15]。此外,NLRP3 inflammasome抑制剂MCC950抑制ASC齐聚,il - 1β高表达,[NLRP3-induced神经炎症16,35]。因此,NLRP3可能患产后抑郁症的预防和治疗的目标。目前的研究结果表明,5-BDBD抑制NLRP3 surgery-activated表达式,表明NLRP3可能下游P2X4R患产后抑郁症的发病机制。
5。结论
总之,当前的结果表明,神经炎症和手术后认知障碍相关的激活P2X4 / NLRP3信号通路在海马体中,和抑制这一途径可能是一个有前途的方法来预防和治疗患产后抑郁症。
数据可用性
最初的贡献提出了研究中都包含在这篇文章/补充材料;进一步调查可以直接到通讯作者/ s。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
回族陆元,薄熙来的贡献同样这项工作。
确认
这项研究是由浙江省自然科学基金资助(批准号Q21H090036),浙江省,中国的医学科学研究基金会(批准号2020 ky850 2021 ky276, 2021 ky288),和中国宁波自然科学基金(批准号202003 n4242)。