文摘

的干燥根当归(答:中国)已广泛应用于中药的各种疾病,如炎症、骨关节炎、感染、轻度贫血、疲劳、和高血压。寻找的次生代谢物答:中国主要进行。然而,生物活性的香豆素类植物仍然是未知的。因此,本研究旨在评估glabralactone抗炎活性的香豆素化合物答:中国,使用在体外和在活的有机体内模型,阐明行动的内在的分子机制。Glabralactone有效抑制一氧化氮产量脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞巨噬细胞。LPS-induced mRNA和蛋白表达的差别,对这些伊诺,TNF -α,il - 1βglabralactone, mir - 155被发现。NF -的激活κB和TRIF-dependent IRF-3通路也有效地抑制了glabralactone LPS-stimulated巨噬细胞。Glabralactone(5和10毫克/公斤)表现出一个在活的有机体内抗炎活性的减少爪子水肿体积在carrageenan-induced鼠模型中,伊诺和il - 1的表达β蛋白质被glabralactone抑制动物的爪子软组织模型。综上所述,glabralactone抗炎活动展出在体外和在活的有机体内模型。这些发现表明,glabralactone可能的潜在的抗炎活性成分之一答:中国并可能被优先发展的化学治疗剂治疗炎症性疾病。

1。介绍

对有害刺激炎症作为保护性反应。因此,急性炎症过程被认为是一个关键响应主机来维持体内平衡。然而,病理条件是当炎症加剧和长时间的开发,并负责许多病理生理的疾病,如风湿性关节炎、老年痴呆症、哮喘和癌症(1,2]。巨噬细胞在炎症中发挥核心作用,宿主防御机制,产生一些促炎介质,包括一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子等多种促炎细胞因子-α(肿瘤坏死因子-α),干扰素-γ(IFN -γ)和白细胞介素(3]。当脂多糖(LPS)与化学活性受体相互作用,骨髓分化protein-2 (MD-2)和toll样受体4 (TLR4),炎症反应是通过激活巨噬细胞(4]。以下信号转导取决于不同的适配器和大致分为骨髓分化因子88 - (MyD88)依赖途径和TIR-domain-containing适配器蛋白质诱导干扰素-β(TRIF)相关的通路。

核因子-κB (NF -κB)是一个关键的转录因子调节诱导一氧化氮合酶基因表达(间接宾语)。如果细胞,NF -κB存在不活跃的形成(p65和p50)绑定到我κB -α抑制蛋白质的NF -κB细胞溶质。当刺激促炎的信号,我κB激酶(IKK)磷酸化κB -α然后通过ubiquitin-mediated退化灭活。这些事件导致NF的易位κB核,随后调节目标基因转录(5]。一般来说,MyD88-dependent通路包括早期反应导致NF -κB激活。相比之下,TRIF-dependent通路激活NF -后期结果κB和干扰素(IFN)调节因子3 (IRF3) [6,7]。

这两个信号通路导致炎症相关细胞因子的诱导,趋化因子和其他转录因子(7]。在MyD88-dependent信号通路,增殖蛋白激酶(MAPKs)被激活,最终,AP-1,转录因子调节炎症相关的基因表达,是激活。在TRIF-dependent信号通路、信号传感器和转录激活1 (STAT1)和干扰素调节因子(IRF)蛋白被激活,这是与干扰素的表达β。也知道STAT1的激活有限合伙人在表达中扮演关键角色的一个子集炎症等因素没有和前列腺素8]。

各种天然product-derived化合物显示抗炎作用与抑制活动LPS-activated一氧化氮合酶(间接宾语)诱导的巨噬细胞细胞(9- - - - - -11]。当归(摘要)。一昼夜的(伞形科)是一种药用植物普遍存在于朝鲜和中国大陆。传统上用于妇科疾病,疲劳、贫血、高血压、炎症、骨关节炎、偏头痛(12]。尽管几个化合物的生物活性答:中国很好发现,生物活性的香豆素类仍然是相对未知的。

在我们的不断努力发现抗炎剂从自然资源,我们将我们的研究扩展到评估的影响glabralactone(图1补充材料(可用在这里)),香豆素化合物答:中国炎症反应。这里,glabralactone的抗炎活性和其潜在的分子机制研究在体外和在活的有机体内动物模型。

2。材料和方法

2.1。化学物质

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),胎牛血清(的边后卫)、丙酮酸钠、谷酰胺,抗生素−抗真菌的解决方案,和trypsin-EDTA从英杰公司有限公司购买(美国纽约大岛)。山羊antirabbit IgG-HRP,山羊anti-mouse IgG-horseradish过氧化物酶(合),小鼠抗体IgG-HRP,进气阀打开,我κB -α导出,κB -αp50 p65, il - 1β、ERK1/2 p-ERK1/2,β肌动蛋白小鼠单克隆抗体购自圣克鲁斯生物技术,Inc .(圣克鲁斯、钙、美国)。抗体对肿瘤坏死因子-α,PTEN SHIP1 p38、p-p38 SAPK /物,p-SAPK /物,IRF3, p-IRF3, STAT1, p-STAT1, p-JAK1兔单克隆抗体,和JAK1鼠单克隆抗体购自细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。lamv逆转录酶核苷酸混合物,随机引物,RNasin, Taq从Promega购买(WI麦迪逊,美国)。大肠杆菌脂多糖(O111: B4), polyinosinic-polycytidylic酸(聚(我:C)), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)、二甲亚砜(DMSO),和其他化学物质从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有指示。Glabralactone ( %通过高效液相色谱分析)是隔绝的根的提取当归(见补充材料)的信息。

2.2。细胞培养

264.7生小鼠巨噬细胞细胞系得到来自美国类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国)。细胞在DMEM培养补充10% heat-inactivated的边后卫,青霉素100单位/毫升,100年μ0.25 g / mL链霉素,μg / mL两性霉素b细胞在湿润孵化室在37°C公司为5%₂的气氛。

2.3。亚硝酸盐的检测

测试化合物的影响在生产中一氧化氮(NO)的培养基决心像前面描述的那样10]。

2.4。MTT细胞生存能力分析

没有评估后,MTT的解决方案是添加到每个做出最后500的浓度μ克/毫升。4 h孵化后37°C,介质被丢弃,1毫升的二甲亚砜加入溶解剩余的甲瓒。100年μL的溶解样品转移到96孔板,在570 nm和吸光度测定。百分比生存的决心与对照组相比。

2.5。西方墨点法

培养细胞收集在裂解缓冲包含50 mM Tris-HCl (pH值7.4),150毫米氯化钠,10毫米EDTA, NP-40 0.5%,完成™蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏应用科学,潘茨堡,德国)和PhosSTOP™磷酸酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。经过十分钟的离心(15000 rpm),包含蛋白质收集的上清液。bicinchoninic酸蛋白质浓度测定的方法和使用标准协议进行免疫印迹。这些墨迹可视化使用增强化学发光(ECL)解决方案(基因内区、大田、韩国)las - 4000成像仪(通用电气医疗集团,小都,英国)13]。

2.6。RNA提取和实时反向Transcriptase-Polymerase连锁反应(实时rt - pcr)

264.7原始细胞与LPS刺激(最终浓度1μg / mL)存在与否的测试化合物5 h。细胞总RNA提取使用三试剂(Sigma-Aldrich)。从每个样本,1μ克总RNA reverse-transcribed使用逆转录系统(Promega)根据制造商的指示。以下引物被用于实时rt - pcr:鼠标干扰素-βF5 - - - - - -CATTTCCGAATGTTCGTCCT-3 ;鼠标干扰素-βR5 - - - - - -CACAGCCCTCTCCATCAACTA-3 ;小鼠肿瘤坏死因子-αF5 - - - - - -TTGAGATCCATGCCGTTG-3 ;小鼠肿瘤坏死因子-αR5 - - - - - -CTGTAGCCCACGTCGTAGC-3 ;小鼠il - 1βF5 ——AGCTGGATGCTCTCATCAGG-3 ;小鼠il - 1βR5 - - - - - -AGTTGACGGACCCCAAAAG-3 ;鼠标β肌动蛋白F5 - - - - - -ACCAGAGGCATACAGGGACA-3 ;和鼠标β肌动蛋白R5 - - - - - -CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3 。Gene-specific引物合成了Bioneer(大田、韩国)。实时PCR进行了如前所述[10]。

2.7。报告基因(SEAP胚胎分泌碱性磷酸酶)测定

确定的影响glabralactone激活的NF -κB,记者进行基因分析与一些修改(如前所述10,14]。人类HaCaT转染子建立了稳定转染pNF-kB-binding site-SEAP-NPT质粒(14]。细胞在DMEM培养补充10% heat-inactivated的边后卫,青霉素100单位/毫升,100年μ0.25 g / mL链霉素,μg / mL两性霉素B和孵化湿润室在37°C公司为5%₂的气氛。

细胞治疗与测试化合物2 h,然后进一步与LPS刺激额外的16 h。上层清液被加热在65°C 5分钟和反应SEAP分析缓冲区(2 M二乙醇胺,1毫米MgCl₂,500μM 4-methylumbelliferyl磷酸(中)1 h。96孔板中的荧光测量荧光计和规范化与蛋白质浓度。数据表示为vehicle-treated比例控制细胞没有有限合伙人。

2.8。制备的核提取物

核提取进行了使用核提取工具包(活动主题北美、钙、美国)根据制造商的指示。

2.9。NF -κB dna结合活性

trans am NF -κB转录因子分析工具包(活动主题、东京、日本)被用来测量NF -κB dna结合活性根据制造商的指示10]。

2.10。微rna - 155测定

定量rt - pcr分析微- 155进行了如前所述[10]。

2.11。动物

斯普拉格−Dawley (SD)大鼠(150−170 g)被用于在活的有机体内研究(韩国首尔的中心实验室动物,Inc .)。所有动物实验的指导方针首尔国立大学制度动物保健和使用委员会(IACUC;许可数量:snu - 130809 - 4)。

2.12。Carrageenan-Induced爪子水肿

评估测试化合物的抗炎活性,使用carrageenan-induced后爪水肿模型大鼠(10,15]。Glabralactone CMC-Na溶解在0.5%。30分钟后腹腔内注射的测试化合物,爪子水肿是subplantar注入1%角叉菜胶诱导的悬挂在生理盐水(100μL)。表示时间的爪子体积测量角叉菜胶注射后使用plethysmometer(尤格Basile、Comerio、意大利)。

2.13。确定生产的促炎介质发炎组织

全细胞提取物发炎组织获得了使用核提取工具包(活动主题,卡尔斯巴德、钙、美国)根据制造商的指示。蛋白质水平的促炎介质是由西方墨点法。

2.14。统计分析

每个实验进行了一式三份。给出的结果 。统计学意义是由单向变异分析(方差分析)加上Dunnett - - - - - -测试;值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Glabralactone对亚硝酸盐的形成的影响在LPS-Induced生264.7细胞

评估的影响glabralactone抑制没有生产,小鼠巨噬细胞264.7原始细胞与LPS刺激,和亚硝酸盐的量,一个稳定的代谢物的没有,在中测量。如图2(一个)由有限合伙人(1,没有生产μg / mL)治疗显著诱导的基础水平 μM μ米20 h孵化。当细胞被使用glabralactone (0-20μ为30米)分钟前LPS刺激,没有生产集成电路抑制浓度依赖性₅₀值为11.6μ最高浓度(20 mμglabralactone M),没有生产被大约80%。Nω-monomethyl-L-arginine醋酸(L-NMMA)号的非选择性抑制剂,被用作积极控制和表现出没有生产(大约60%的抑制抑制在50岁μ米)。glabralactone对细胞活力的影响时使用MTT试验确定,没有观察到明显的细胞毒性测试20的浓度μ细胞生存)M glabralactone (> 89%。这些数据表明,glabralactone有效抑制没有细胞毒性,生产活动(图2 (b))。

进一步调查的作用机制glabralactone,伊诺的蛋白表达是决定使用西方墨点法。当原始264.7细胞处理有限合伙人(1μg / mL),进气阀打开蛋白质水平显著调节,但glabralactone的存在有效地抑制伊诺蛋白质浓度的方式表达(图2 (c))。这些数据表明,glabralactone的抑制活性没有生产与伊诺的抑制蛋白表达在LPS-stimulated RAW264.7细胞。

3.2。Glabralactone LPS-Induced NF -的影响κB激活

进一步调查是否转录因子NF -κB是一个至关重要的目标的影响glabralactone LPS-stimulated生264.7细胞,NF -报告基因分析κB转录活动(SEAP试验)。当细胞与LPS刺激(1μ16 h g / mL), NF -κB转录活动增加了4.7倍。然而,治疗glabralactone有效抑制NF -κB浓度的方式转录活动LPS-stimulated RAW264.7细胞(图3(一个))。

的影响进一步研究旨在阐明glabralactone激活的NF -κB在LPS-stimulated RAW264.7细胞。有限合伙人的治疗(1μg / mL) 30分钟以上的我差别明显对这些展出κB -α和upregulation》κB -α(我的退化形式κB -α)。然而,glabralactone 30分钟前的预处理抑制LPS刺激我的退化κB -α胞质和易位的NF -κB亚基(p65和p50)在核(图3 (b))。

确定的影响glabralactone NF - DNA结合活性κB在细胞核,RAW264.7细胞处理有限合伙人(1μg / mL)的glabralactone 1.5 h,然后,分析了核提取物trans am NF -κB结合试验(活动主题)。增强的dna结合活性NF -κB亚基(p50和p65) LPS刺激的原子核是由glabralactone有效抑制浓度的方式。竞争实验的多余的无标号野生型(WT)和突变(MT)寡核苷酸(p50或p65)证实,只有添加WT NF - dna结合活性的寡核苷酸完全块κB在细胞核中。这些数据表明,dna结合活性的抑制NF -κ由glabralactone B是特定于细胞核的子单元。

3.3。Glabralactone对促炎细胞因子的影响和microrna - 155的表达

进一步阐明glabralactone的抗炎效果是否与促炎细胞因子表达的规定,首先,TNF的表达α和il - 1β确定在LPS-stimulated RAW264.7细胞。肿瘤坏死因子-调节表达式α和il - 1β有限合伙人治疗4 h被有效地抑制治疗glabralactone蛋白质(图4(一)(图)和mRNA水平4 (b))LPS-stimulated RAW264.7细胞。

众所周知,microrna - 155 (mir - 155)在炎症反应中扮演着重要的角色。它也表明,促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α和il - 1β积极,受mir - 155 (16]。在这条线上,glabralactone的影响在mir - 155的表达决心LPS-stimulated RAW264.7细胞。当细胞与LPS刺激(1μg / mL) 8 h, mir - 155的表达增加了43.0倍高于如果细胞。然而,mir - 155的调节表达显著抑制浓度的方式通过glabralactone LPS-stimulated RAW264.7细胞(图4 (c))。另一个研究显示,SHIP1和PTEN的表达,mir - 155的负调控目标蛋白质,是治疗glabralactone(图的影响4 (d)),这表明glabralactone部分相关的抗炎活性的差别,对这些mir - 155在RAW264.7细胞表达。

3.4。Glabralactone对TRIF-Dependent TLR通路的影响

调查是否能够影响MyD88-dependent glabralactone TLR信号通路,MAPK家族的表达式,如物,兵,和p38被免疫印迹检测。如图5(一个),激活(ERK的磷酸化形式),p38和物并不太受glabralactone治疗LPS-stimulated RAW264.7细胞。

接下来,进一步调查glabralactone是否能够调节TRIF-dependent TLR信号通路,影响glabralactone IRF3决心的激活LPS-stimulated RAW264.7细胞。如图5 (b)有限合伙人治疗(1μg / mL) 3 h的表达显著增强p-IRF3(激活IRF3形式),但glabralactone 30分钟前的预处理LPS刺激有效浓度的方式表达下调p-IRF3的表达。随后的研究旨在评估的影响glabralactone IRF3转录目标基因表达的。干扰素的mRNA的表达βIRF3转录目标基因,由有限合伙人显著调节治疗(1μ为4 h g / mL),但glabralactone的预处理前30分钟LPS刺激也有效地抑制干扰素的mRNA的表达β在LPS-stimulated RAW264.7细胞(图5 (c))。此外,由于JAK-STAT通路下游的干扰素β的影响glabralactone JAK1和STAT1的激活了免疫印迹在LPS-stimulated RAW264.7细胞。结果,增强激活STAT1和JAK1(磷酸化形式)蛋白表达LPS有效治疗3 h glabralactone的存在(图中表达下调5 (d))。进一步确认伊诺表达的抑制glabralactone由TRIF-dependent通路介导,polyinosinic-polycytidylic酸(聚(我:C))被用来诱导伊诺RAW264.7细胞中表达。保利(我:C)的治疗12 h显著诱导伊诺蛋白表达,和glabralactone 30分钟前的预处理LPS刺激有效浓度的方式表达下调伊诺表达式(图5 (e))。这些发现表明,伊诺表达式部分的抑制效果与TRIF-dependent TLR途径的调节有关。

3.5。在活的有机体内抗炎活性Glabralactone

carrageenan-induced鼠爪子水肿模型被用来评估在活的有机体内glabralactone的抗炎活性。爪子水肿是100年注射引起的μL蒸馏水subplantarly 1%卡拉胶溶液的体积的爪子水肿监测6 h。爪子水肿的体积不断增加,达到峰值后4 h角叉菜胶治疗。如图6(一),当glabralactone口服治疗,爪子水肿体积vehicle-treated对照组相比明显减少。抑制率为39.58%和52.24%剂量的5到20毫克/公斤,分别在4 h glabralactone待遇。吲哚美辛(20毫克/公斤)作为参考化合物,并在相同的实验条件下,抑制率为56.41%。

治疗后生产的促炎介质的glabralactone发炎爪子组织也是由西方墨点法评估(图6 (b))。治疗后6 h的卡拉胶,促炎介质的蛋白质表达,伊诺和il - 1β在爪子组织调节vehicle-treated对照组相比。然而,这些促炎介质的表达显著抑制治疗glabralactone(20毫克/公斤)。这些发现表明,glabralactone展品在活的有机体内在急性炎症动物模型抗炎活动。

4所示。讨论

天然产物一直扮演着重要的角色在药物发现和开发计划。事实上,超过50%的小分子药物批准是基于不同天然product-originated化合物(17]。当归(答:中国),药用植物,主要分布在韩国和中国大陆,一直是传统上用于各种人类健康包括炎症性疾病。答:中国也通常被称为女人参因为有利于女性健康12]。不同种类的化合物如精油、香豆素、苯酞、多糖、聚乙炔隔绝答:中国(18]。虽然分离的生物活性化合物,如阿魏酸,Z-ligustilide, n-butylidenephthalide答:中国已报告(19),从孤立的香豆素化合物的抗炎活性答:中国还有待探索。在我们的不断努力,寻找抗炎剂从自然资源和基于炎症疾病的植物的使用,本研究进行了评估的抗炎活性glabralactone,香豆素化合物答:中国在炎症反应。

生产过剩的一氧化氮(NO)和一氧化氮合酶(间接宾语)诱导激活的巨噬细胞与炎症反应密切相关(20.]。因此,生产的规定没有和伊诺的表达很大程度上被认为是一个有用的目标筛选的抗炎剂。在目前的研究中,我们使用了在体外分析系统与脂多糖(LPS)刺激老鼠巨噬细胞RAW264.7细胞激活的巨噬细胞。有限合伙人,革兰氏阴性细菌的内毒素,是一个著名的激活巨噬细胞的炎症反应(21]。Glabralactone被发现显著抑制生产没有LPS-stimulated巨噬细胞细胞无细胞毒性。由于生产过剩的部分与伊诺的过度激活巨噬细胞,底层的分子机制由glabralactone阐明在LPS-stimulated巨噬细胞细胞。免疫印迹分析表明glabralactone也抑制LPS-stimulated伊诺的过度激活巨噬细胞细胞中蛋白质含量。这些发现表明,没有生产的抑制glabralactone伊诺的抑制蛋白表达有关。进一步研究旨在阐明的参与NF -κB的关键转录因子调节进气阀打开glabralactone表达式。增强的NF -κB转录活动,有效地抑制了LPS-stimulation的治疗glabralactone SEAP化验分析,随后,这些影响与退化的抑制有关κB -α在胞质和NF -的易位κB亚基(p50和p65)进入细胞核。的抑制NF -κB移位入核glabralactone也证实了NF -分析κB-DNA绑定活动随着竞争实验使用野生型或突变类型的寡核苷酸的NF -κB亚基LPS-stimulated巨噬细胞细胞。这些数据表明,抗炎活性glabralactone部分与激活的抑制NF -κB在激活巨噬细胞。

积累的证据表明,促炎细胞因子如TNF -α和il - 1β在炎症反应中,和NF -κB中起关键作用的表达这些促炎介质(22]。自从glabralactone有效抑制NF -κ激活,促炎细胞因子的表达式在LPS-stimulated测定巨噬细胞细胞。Glabralactone下调肿瘤坏死因子的表达式α和il - 1β在转录和翻译水平,表明抗炎活性glabralactone也与抑制促炎细胞因子激活巨噬细胞的细胞。

信号转导通路在炎症反应通常分为Myd88-dependent和TRIF-dependent信号通路。在Myd88-dependent信号,激活MAPKs通常发现,但在TRIF-dependent信号,激活干扰素(IFN)的调节因子3 (IRF3)及其下游信号分子介导的炎症反应(6]。在目前的研究中,发现glabralactone更有效地抑制激活TRIF-dependent IRF3 MyD88-dependent通路的信号通路相比LPS-stimulated巨噬细胞细胞。Glabralactone显著抑制激活(磷酸化)IRF3蛋白质和干扰素β随后mRNA表达和抑制的激活下游信号分子如JAK1和STAT1的磷酸化。协会TRIF-mediated信号通路的抗炎活性glabralactone进一步证实了使用保利(我:C)。保利(我:C),双链RNA的合成模拟(极),众所周知,诱导干扰素等细胞因子的产生β。保利(我:C)能够激活TRL3精确调节TRIF-dependent通路。因此,TLR3-TRIF通路的激活炎性细胞因子和趋化因子的产生原因23]。Glabralactone被发现有效地抑制全身的保利(我:C)进气阀打开蛋白质的表达。这些发现表明,伊诺表达式部分的抑制效果与TRIF-dependent TLR通路的调控。综上所述,这些数据表明glabralactone可能影响TRIF-mediated信号通路。

的在活的有机体内抗炎活性glabralactone也是评估使用carrageenan-induced老鼠爪子水肿模型。Glabralactone显著减少的体积carrageenan-induced爪子水肿。组织分析还表明,glabralactone部分相关的抗炎活性的抑制促炎介质的生产,伊诺和il - 1β模型大鼠爪子水肿组织发炎。

handelin等多种天然product-derived化合物,姜黄素,isoliquiritigenin,金诺芬,木樨草素、(-)-epigallocatechin-3-gallate, 6-shogaol, pinosylvin表现出各种抗炎活性分子机制(9,10,24- - - - - -29日]。本研究也被认为是有意义的,因为它给出了一个科学相关的说明基于传统使用孤立的化合物答:中国在炎性疾病。

5。结论

目前的研究提供了glabralactone的抗炎活性在体外细胞培养和在活的有机体内急性爪子水肿鼠模型。一个可信的基础分子的作用机制的抗炎活性glabralactone包括抑制促炎介质和细胞因子的生产通过调制TRIF-dependent通路。这些发现表明,glabralactone可以作为一种很有前途的候选人从天然产物抗炎剂的进一步发展。

数据可用性

数据请求。

的利益冲突

作者宣称他们没有竞争的经济利益或个人关系可能出现影响工作报告。

作者的贡献

TJC和JS设计这一研究中,执行所有的实验,起草了手稿。HJP管理这个项目。构造论提供了化合物,glabralactone。SKL监督学习。所有作者都批准了最终版本的手稿。Tae崔俊和Jayoung歌同样这项工作。

确认

这项工作是由韩国国家研究基金会(NRF)授予由韩国政府(NRF - 2019 r1a2c2086476和联盟- 2020 r1i1a1a01072290)。

补充材料

可以在补充材料lol滚球 雷竞技 ,包括隔离glabralactone、核磁共振光谱的副本,和高效液相色谱法跟踪(PDF)。(补充材料)