文摘
背景。神经退行性疾病,包括阿尔茨海默病、帕金森氏症、亨廷顿氏舞蹈症,主要特点是进步的发动机,感觉,或认知功能障碍的患者。这些疾病大多发生在中年和老年人,也没有有效的治疗方法。研究表明,神经退行性疾病都伴随着神经炎症。进一步损害神经元和促炎介质产生神经炎症加重神经退行性疾病的进程。因此,抑制神经炎症可能是一个有效的方法缓解神经退行性疾病。Pomiferin从水果中提取的橙色桑有广泛的抗氧化和抗炎作用外围组织。然而,目前尚不清楚是否在神经炎症扮演了一个角色。方法。在我们的实验中,我们研究了影响Pomiferin BV2细胞炎症及其与cck-8机制,LDH、定量PCR和ELISA方法。然后我们调查了Pomiferin对经典的炎症通路的影响通过免疫印迹的方法。结果。结果表明,Pomiferin抑制ROS的产生,不,和促炎介质(il - 6、TNF -α,进气阀打开,COX2) BV2细胞。进一步的机制研究表明,Pomiferin Nrf2 / Akt通路激活和抑制NF -κB通路。结论。我们的研究表明,Pomiferin施加antineuroinflammatory影响通过激活Nrf2 / Akt通路和抑制NF -κB通路。
1。介绍
退行性疾病疾病中神经元的结构和功能逐渐丢失,包括死亡,导致功能障碍,如帕金森病(PD)、阿尔茨海默氏症(老年痴呆症)和亨廷顿氏病(HD)。这些疾病主要表现为神经退行性变的一个或多个地区的中枢神经系统,有一个漫长而复杂的发病机理(1- - - - - -3]。目前,它只能在早期临床缓解,也没有有效的治疗方法。因此,它具有重要意义研究神经退行性疾病的发病机制,寻找有效的治疗药物。
神经炎症免疫反应激活小胶质细胞和星形胶质细胞在中枢神经系统(CNS)。研究表明,小胶质细胞被激活由多个因素,如中枢神经系统损伤,脑部感染、毒素刺激和自身免疫性疾病。尸检报告显示,神经退行性疾病患者的大脑有大量聚集的小胶质细胞(4- - - - - -6]。研究还表明,neuroimmunity和炎症反应参与神经退行性疾病的过程(7- - - - - -9]。在发生疾病,免疫细胞被激活在大量涌向受伤的网站移除有害因素和修复受损组织。然而,持续的炎症反应会导致过度激活当地的免疫细胞在中枢神经系统和积累大量的有毒介质如il - 6、TNF -α,不,和PEG2,进而损害周围神经元和加剧神经退行性疾病的发展10,11]。神经元细胞的功能障碍在特定区域引起的氧化应激是一个重要的神经退行性疾病的发病机理,ROS的过度生产的一个重要病理(12]。因此,对抑制免疫细胞的overactivation具有重要意义和神经炎症反应引起的神经性疾病的缓解。
Pomiferin是一种从水果中提取黄酮类化合物的橙色的桑树。研究表明,Pomiferin有抗氧化和抗炎作用。在氧化损伤模型中,Pomiferin造成的DNA损伤有保护作用梓葡萄糖苷,表现出很强的抗氧化活性(13,14]。在巨噬细胞,Pomiferin激活核因子红外两个相关因子2 (Nrf2),触发抗氧化基因的转录,发挥抗氧化作用和退化的我κBα,具有抗炎作用15,16]。在人类皮肤成纤维细胞(NHDF)和正常人体皮肤角质细胞,Pomiferin可以上调抗氧化基因如ac, AQP3和COX1 [17,18]。鉴于其广泛的抗氧化和抗炎活性,我们假设Pomiferin可能影响神经炎症。因此,本研究的目的是探索Pomiferin在神经炎症的效果和机理。
2。材料和方法
2.1。试剂
有限合伙人(从大肠杆菌,O55: B55)从σ(奥尔德里奇,密苏里州的圣路易斯,美国)。胎牛血清(的边后卫)、胰蛋白酶和DMEM high-glucose媒介购买来自(美国纽约Gibco,大岛)。青霉素和链霉素从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。Pomiferin(纯度> 98%;Pufei德生物科技,中国成都)溶解在DMSO(西格玛奥德里奇圣路易斯,密苏里州,美国)。MK2206 (Akt抑制剂)和brusatol (BT, Nrf2抑制剂)买来塞莱克(上海蓝木化工有限公司,中国)。ROS, LDH,没有检测设备,和CCK-8试剂购自Beyotime生物技术(上海,中国)。
2.2。细胞培养
我们孵化BV2细胞(购自上海Binsui生物(中国上海))在完全培养基(高葡萄糖,10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素)在5%的二氧化碳细胞培养箱37°C。细胞培养基是每日更换。当密度达到80%左右时,细胞与0.05%胰蛋白酶消化和亚文化进入新的细胞培养瓶。
2.3。CCK-8化验
当BV2细胞接种的密度在96 -孔板达到约50%,不同浓度的细胞治疗Pomiferin (0.25μ0.5米,μM, 1μ米)和有限合伙人(500 ng / mL) 24 h。然后,我们将CCK-8稀释剂添加到每个在细胞孵化器和孵化2 h。之后,细胞的存活率测定吸光度的450海里。
2.4。LDH测定
当BV2细胞接种的密度在96 -孔板达到约80%,完整的培养基是不完全培养基。然后,不同浓度的细胞治疗Pomiferin (0.25μ0.5米,μM, 1μ米)和有限合伙人(500 ng / mL) 24 h。之后,根据指令的LDH检测装备,LDH工作液添加到96孔板,和LDH的释放检测LDH制造商的指示。
2.5。ROS测量
当BV2细胞接种的密度在96 -孔板达到约80%,我们添加了Pomiferin (1μ米)和有限合伙人(500 ng / mL)治疗细胞12 h。然后,与活性氧ROS水平测量检测设备根据制造商的指示。
2.6。没有测量
当BV2细胞接种的密度在96 -孔板达到约80%,我们添加了Pomiferin (1μ米)和有限合伙人(500 ng / mL)治疗12 h和获得细胞的细胞上清液。然后,没有在上层清液的浓度测量使用没有检测设备根据制造商的指示。
2.7。定量聚合酶链反应
当BV2细胞接种的密度在96 -孔板达到约80%,完整的培养基是不完全培养基。我们添加了Pomiferin (1μ米)和有限合伙人(100 ng / mL)治疗细胞12 h和使用试剂盒提取RNA试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。RNA是reverse-transcribed cDNA使用'脚本®1 ststrand互补脱氧核糖核酸合成装备(罗氏、南旧金山、钙、美国)。在那之后,mRNA水平的il - 6、TNF -α测量,进气阀打开,cox - 2与Quanti Tect SYBR绿色rt - pcr试剂盒(豆类生物技术有限公司,日本京都)根据ELISA制造商的指示。引物序列参考先前的研究[19,20.]。
2.8。ELISA
当BV2细胞接种的密度在96 -孔板达到约80%,完整的培养基是不完全培养基。我们添加了Pomiferin (1μ米)和有限合伙人(500 ng / mL)治疗细胞24 h,并获得细胞上清液。il - 6和TNF -的蛋白质浓度α在上层清液根据ELISA测定制造商的指示。
2.9。免疫印迹
使用蛋白质提取细胞总蛋白提取设备根据制造商的指示(Beyotime生物科技、上海、中国)。共有50个μg蛋白的添加到对电泳。蛋白质电泳后,被转移到纤维PVDF膜(美国微孔,Billerica的)。然后,膜放置在5%脱脂奶粉和密封4 h。之后,膜在4°C主要抗体孵育12 h和二级抗体室温2 h。清洗后膜清洗液,细胞膜是彩色的ECL发光的解决方案,以及蛋白质与蛋白质成像仪成像。所有主要抗体购自Abcam(英国剑桥)和二级抗体购自生物科技(武汉)。
2.10。数据分析
所有数据被提出了 形式和分析使用SPSS 19.1软件。单向方差分析被用来比较不同群体。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。Pomiferin对BV2细胞的生长的影响
Pomiferin是一种黄酮类化合物提取Maclura pomifera (Raf)。施耐德(图曼1)。
为了研究Pomiferin是否有毒性作用,BV2细胞接受有限合伙人(100 ng / mL)和不同浓度的Pomiferin (0.25μ0.5米,μM, 1μ米),然后,Pomiferin在BV2细胞的生长的影响被CCK-8(图2(一个))和LDH(图2 (b))实验。结果表明,有限合伙人和Pomiferin BV2细胞没有毒性作用。
(一)
(b)
3.2。Pomiferin对表达的影响在BV2细胞ROS也没有
氧化应激过程中,活性氧,没有生产,在大量积累和破坏周围的组织。为了研究Pomiferin的影响,我们对待BV2细胞与有限合伙人(100 ng / mL)和Pomiferin (1μ米)12 h,然后发现Pomiferin对ROS的产生的影响(图3(一个)并没有(图3 (b)在BV2细胞)。结果表明,Pomiferin抑制ROS的产生,也没有。
(一)
(b)
3.3。Pomiferin效应在BV2 Nrf2 / Akt通路细胞
一种蛋白激酶信号通路参与基本的细胞过程。核因子erythroid2-related因子2 (Nrf2)是一种重要的转录因子,保护普遍存在于各种生物体和小房。研究表明,一种蛋白激酶/ Nrf2参与氧化应激的规定(21,22]。为了调查Pomiferin的作用机制,我们研究了影响Pomiferin Nrf2和Akt通路。结果表明,Pomiferin促进了一种蛋白激酶的磷酸化和Nrf2的核转位(数字4(一)- - - - - -4 (c))。然后,我们对待BV2细胞MK2206 (Akt抑制剂,10μ米)和BT (Nrf2抑制剂,200海里)6 h和研究的影响Pomiferin ROS和没有阻止Akt后或Nrf2通路。结果表明,MK2206或BT治疗削弱了抑制ROS和Pomiferin(数字4 (d)和4 (e))。这些结果证明Pomiferin抑制ROS的产生,也没有通过一种蛋白激酶/ Nrf2途径。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。Pomiferin效应在BV2细胞促炎因子的表达式
继续氧化应激通常会导致炎症反应,和异常炎症反应产生大量的促炎因子(il - 6和TNF -α),导致神经元损伤。因此,我们对待BV2细胞与有限合伙人(100 ng / mL)和Pomiferin (1μM) 12 h (mRNA)和24 h(蛋白质),然后发现Pomiferin的影响生产的促炎因子(il - 6和TNF -α)在BV2细胞通过定量PCR和ELISA方法。结果表明,Pomiferin抑制mRNA(数据5(一个)和5 (b))和蛋白质(数据5 (c)和5 (d))的表达促炎因子(il - 6和TNF -α)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。Pomiferin对促炎BV2细胞酶的表达
为了进一步研究Pomiferin对炎症的影响,我们对待BV2细胞与有限合伙人(100 ng / mL)和Pomiferin (1μM) 12 h (mRNA)和24 h(蛋白质),然后发现的影响Pomiferin促炎蛋白酶的生产(伊诺和COX2) BV2细胞通过定量聚合酶链反应和免疫印迹的方法。结果表明,Pomiferin抑制mRNA(数据6(一)和6 (b))和蛋白质(数据5 (c)- - - - - -5(e)的表达促炎蛋白酶(伊诺和COX2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.6。Pomiferin对NF -κB和BV2细胞MAPK通路
NF -κB和MAPK通路是古典炎症通路的激活调节转录的炎症介质23,24]。调查Pomiferin的抗炎机制,我们对待BV2细胞Pomiferin (1μ米)和有限合伙人(100 ng / mL),然后检查Pomiferin激活NF -的影响κB和MAPK通路。结果表明,橙色桑树黄铜抑制NF -的激活κB(数据7(一)和7 (c)- - - - - -7 (e))和MAPK(数字7 (b)和7 (f)- - - - - -7 (h))在BV2细胞通路。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
在我们的研究中,我们报道了Pomiferin发挥抗炎作用通过抑制ROS的产生,不,和促炎介质(il - 6、TNF -α,进气阀打开,COX2)在小胶质细胞激活Nrf2 / Akt通路和抑制NF -κB通路(图8)。
从水果中提取黄酮的桑科,Pomiferin报道调节氧化应激(25- - - - - -27]。ROS是氧化应激的一个重要指标,它已经在文献中报道,Pomiferin调节活性氧的释放(28,29日]。在我们的实验中,我们检查了Pomiferin对ROS的产生的影响,也没有在BV2细胞。结果表明,Pomiferin抑制ROS的产生,也没有。Akt通路或PI3K-Akt通路相对应的信号转导通路细胞外生存和增长。激活Akt介导下游一系列胞内蛋白磷酸化的反应调节细胞生存、生长、增殖,细胞迁移和血管生成(30.- - - - - -32]。在我们的研究中,我们调查了Pomiferin对一种蛋白激酶磷酸化的影响,结果表明,Pomiferin治疗促进了一种蛋白激酶的磷酸化。Nrf2调节氧化应激是一个关键因素,及其激活可以调节多种基因与氧化应激有关。在正常情况下,Nrf2位于细胞质中,不发挥作用。激活后,Nrf2把核,与氧化剂反应元素结合形成Nrf2-ARE信号通路,从而调节基因和蛋白质表达一系列下游的抗氧化和抗氧化作用33- - - - - -35]。在我们的实验中,我们调查了Pomiferin对Nrf2活化的影响,发现Pomiferin提升Nrf2的核易位。进一步的研究表明,一种蛋白激酶的抑制剂,Nrf2可能会削弱Pomiferin抑制ROS也没有。建议在BV2 Pomiferin抑制ROS的产生和细胞通过激活一种蛋白激酶,Nrf2通路。
在体内氧化和抗氧化反应的不平衡将导致氧化应激。持续而复杂的氧化应激可以触发体内的炎症反应。炎症会导致体内氧化和抗氧化反应的不平衡(36- - - - - -38]。因此,调节氧化应激抑制炎症反应中起着重要的作用。神经退行性疾病的主要病理特征是神经元的退行性损失。炎症在这一过程中起着重要的作用。在神经退行性疾病,调节炎症反应小胶质细胞被激活,产生促炎介质(il - 6、TNF -α,进气阀打开,COX2)和破坏神经元39- - - - - -41]。因此,抑制炎性反应在神经退行性疾病的治疗具有重要意义。在我们的实验中,我们检查的影响Pomiferin BV2细胞促炎介质的生产,发现Pomiferin BV2细胞抑制促炎介质的生产。
NF -κB(增强κ光核因子B)是一种蛋白质链复杂,在调节免疫应答中发挥着关键作用,感染。其目标基因是参与免疫反应,炎症反应、细胞增殖,antiapoptosis,等。当这些细胞被刺激,我κBα细胞质中的激酶被激活,我的一部分κBα磷酸化,我的一部分吗κBα被泛素化降解,p65亚基与分离和磷酸化(42- - - - - -44]。在我们的实验中,我们调查了在NF Pomiferin——的影响κB激活,发现Pomiferin抑制我的磷酸化κBα我和p65泛素化降解κBα。MAPK(增殖蛋白激酶)是一组重要的发射器,可以由不同的细胞外刺激激活,使信号从细胞表面原子核。它由ERK、物和P38 [45,46]。在我们的实验中,我们发现的影响Pomiferin MAPK途径的激活,和结果表明,Pomiferin没有影响MAPK通路的激活。
5。结论
我们的研究发现,Pomiferin抑制小胶质炎症通过激活Nrf2 / Akt通路和抑制NF -κB通路。此外,独特的药理特性和容易获得Pomiferin表明它可能是antineuroinflammation的候选药物。我们的实验的进一步研究奠定了一定的基础Pomiferin的效果。
缩写
| ROS: | 活性氧 |
| 没有: | 一氧化氮 |
| NF -κB: | 增强κ轻链核因子B |
| MAPK: | 增殖蛋白激酶 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子α |
| 一种蛋白激酶: | Serine-threonine蛋白激酶 |
| Nrf2: | 核因子erythroid-2-related因子2 |
| 兵: | 细胞外signal-regulated激酶。 |
数据可用性
使用的数据集或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
附加分
作者的注意。在研究广场预印本曾被发表10.21203 / rs.3.rs - 718549 / v1)[47]。
伦理批准
伦理批准并不是必要的。
同意
书面知情同意出版了从所有参与者。
的利益冲突
所有作者声称,没有利益冲突。
作者的贡献
Y.Z. J.W.构思概念和实验。YX.S。设计部分的实验。屈服强度进行实验,收集数据。Y.Z.写的手稿,作者回顾和评论的手稿。
确认
这是在内存中Ga孙先生的鼓励和坚定的支持持续我通过挫折和沮丧。这项工作得到了诺尔曼白求恩生物医学工程中心的科研资助项目(批准号BQEGCZX2019025)和吉林省科技发展计划(没有。20200404148 yy)。