文摘

背景。肺炎克雷伯菌(k个轮胎)是一种革兰氏阴性肺炎的主要原因,这就需要有效的治疗方法。脂肪间充质干细胞(ADSC)派生exosomal小分子核糖核酸(microrna)提出了多种疾病的抑制作用。然而,的功能ADSC-derived exosomal micrornak个轮胎仍不清楚。目的。在这项研究中,我们旨在探索的影响ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - pk个轮胎侵染诱导肺损伤。方法。由感染C57BL / 6小鼠模型建立的k个轮胎。ADSCs提取液和体外特征。ADSC-derived液囊的易位骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)检测。mir - 181 a的水平- 5 - p被实时PCR检测。炎症因子的分泌由ELISA决定。之间的交互mir - 181 - 5 - p STAT3被确认。结果。我们成功地孤立ADSCs表达CD90和CD105而不是CD31阳性标记和CD45。exosomal mir - 181 - 5 - p分泌ADSCs被BMDM和内化k个轮胎感染刺激mir - 181 - 5 - p水平支气管肺泡灌洗液(BALF)和BMDM。ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p压抑的肺和传播的产物k个轮胎感染小鼠,压抑在肺组织细胞浸润,减毒inflammasome活动和il - 1的水平β和地震-肺。机械,mir - 181 - 5 - p能够抑制STAT3表达在转录后的水平和压抑Nlrp3 BMDM Asc表达式。结论。因此,我们得出结论,ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p缓解克雷伯氏菌针对STAT3信号肺炎侵染诱导肺损伤。ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p可以作为治疗的一个潜在的候选人克雷伯氏菌肺炎侵染诱导肺损伤。

1。介绍

肺炎克雷伯菌(K.pneu)是一种革兰氏阴性细菌封装,它导致大多数医院获得感染,其中超过10%是肺炎,是稳步增加社区获得性呼吸道感染的常见的情况(1]。K.pneu既是机会病原体和共生的细菌在胃肠道,可以传播到次要位置,因此能够引起广泛的感染,包括菌血症、肺炎、败血症、尿路感染(2- - - - - -5]。K.pneu使得感染通常发生的免疫细胞如巨噬细胞和中性粒细胞的聚集,以及高水平的促炎细胞因子(称为“细胞因子风暴”)由于特异表达的免疫反应,导致急性肺损伤(6- - - - - -8]。值得注意的,K.pneu正成为人类的致命威胁,因为大多数临床菌株对多种抗生素耐药,有的甚至显示抵抗所有可用抗生素(9,10]。因此,需要应对新疗法K.pneu感染是紧迫。

间充质干细胞(msc)正逐渐发展成为一个有前途的治疗疾病的工具由于多个优势,包括隔离过程相对简单,低免疫原性、自我更新的能力,和multipotency [11- - - - - -13]。此外,msc能分泌多种血管生成,抗炎,抗菌介质,参与免疫反应(11]。间充质干细胞(MSC)最近也被视为一个潜在的新方法的免疫调节治疗肺炎(14,15]。此外,脂肪间充质干细胞(ADSCs)也显示可靠和有前途的潜在临床应用(16,17]。建议ADSCs能够分化成各种细胞类型和分泌各种细胞因子参与调节血管生成,伤口愈合,免疫调节和组织再生17]。除了细胞因子,ADSCs也释放液,一种细胞外囊泡的信使rna,脂类,蛋白质,和小分子核糖核酸(microrna),因此促进了细胞通讯和参与细胞的各种功能(18- - - - - -20.]。

microrna是一种内源性短非编码rna的20到24个核苷酸长度,通过目标函数mrna的UTR区域,并在炎症等都进行了广泛的研究克雷伯氏菌肺炎(21- - - - - -23]。mir - 181家族一直表示,参与多种病理过程的发展包括癌症和神经退行性变的(24]。瞿等人建议液源自mir - 181 - 5 - p -修改ADSCs减毒纤维化,通过激活自噬25]。此外,mir - 181 - 5 - p也最近披露的调解IL22监管由针对STAT3免疫反应(26]。据报道,抑制STAT3表达压制K.pneu(27]。然而,mir - 181 - 5的监管作用- p克雷伯氏菌肺炎不澄清。在这项研究中,我们的目标是利用的功能ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p克雷伯氏菌肺炎和可能提供一个潜在的治疗方法治疗克雷伯氏菌肺炎。

2。方法

2.1。细菌和材料

脂多糖(LPS), PKH26荧光细胞链接器包(Sigma-Aldrich)和exosomal抑制剂GW4869从σ(美国)。mir - 181 - 5 p模仿,抑制剂,Cyc3-labeled pre-miRNA,玻璃纸和消极的控制- mir - 67设计并合成了GenePharma(中国)。2000年转染试剂Lipofectamine细胞裂解缓冲•瑞帕,以及试剂盒获得从英杰公司(美国)。主IgG1抗体,CD31、CD45 CD90、CD105, CD63, CD9, STAT3 CD68、β肌动蛋白被命令从Abcam(美国)。

的肺炎克雷伯菌(k个轮胎)从美国购买类型文化集合(写明ATCC),生长在Luria-Bertani介质(σ)轮流在200 rpm 37°C孵化器。细菌被resuspended PBS和连续稀释。的浓度k个轮胎以OD 600海里,稀释到适当的集落形成单位(CFU)浓度对后续实验。

2.2。脂肪间充质干细胞的分离和鉴定(ADSC)

脂肪tissue-derived间充质干细胞(ADSCs)健康老鼠的脂肪组织中分离培养在杜尔贝科的修改鹰(美国Gibco DMEM)中添加10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫),1%青霉素和链霉素(SolarBio,中国),和2毫米谷酰胺(σ)。ADSCs中使用三个段落。这些细胞被储存在液氮和解冻获得冻存细胞。

ADSCs IgG1标记的抗体,CD31、CD45、CD90、CD105和流式细胞仪探测到在流式细胞分析仪(BD生物科学)。ADSCs成骨细胞和脂肪细胞的分化是由茜素红S和油红O染色(Beyotime,中国)制造商的协议后,分别。

2.3。隔离骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)

BMDMs被孤立在经典协议之前发表(28]。简单地说,老鼠的股骨和胫骨收获和刷新PBS收集骨髓细胞。红细胞溶菌作用后,细胞被离心机,水洗,并设置T75瓶血压得到较好的控制,完成DMEM(补充10%的边后卫和青霉素和链霉素(100 U /毫升))。BMDMs培养L929 30% cell-conditioned介质在DMEM完全培养基前7天任何进一步的实验过程。L929细胞从写明ATCC购买(弗吉尼亚州马纳萨斯)。L929细胞在DMEM培养媒体与10%的边后卫和1%青霉素和链霉素37°C 5%二氧化碳培养箱。

2.4。的支气管肺泡灌洗液体(BALF)

老鼠被放血执行没有任何麻醉剂,身体被打开暴露气管。气管注入了1毫升PBS使用20克angiocatheter,和再灌注的PBS收集。5次重复这个过程,流体和BALF收集。

2.5。液的隔离和表征

ADSCs ( )在10厘米种子细胞培养盘并在DMEM培养提供10% exosome-free一夜之间的边后卫。第二天,ADSCs转染mir - 181 - 5 - p模仿(50 nmol / L)或移动电话通过4 - mir - 67模拟μL Lipofectamine 2000 48小时。随后,液分离得到的上层清液ADSCs通过使用总液隔离设备(美国英杰公司)按照制造商的协议。液resuspended在PBS和存储在一个冰箱-80°C。液的浓度是由纳米颗粒测量跟踪分析(NTA) NanoSight分析仪(英国莫尔文)。液通过免疫印迹检测CD63, CD9。透射电子显微镜(TEM),液悬浮在PBS和库珀网格由碳下降,水洗,通过醋酸双氧铀染色,空气干燥。图像被使用TEM(飞利浦、荷兰)。液(2μ悬浮在20 g)μL PBS被用于细胞治疗。

2.6。西方墨点法和ELISA

细胞或•瑞帕裂解缓冲液是均相的含蛋白酶抑制剂(热)的鸡尾酒。总蛋白(30μg)是解决在sds - page凝胶和转向了NC膜,其次是孵化主要抗体和相应后续二次抗体。的乐队被孵化可视化增强化学发光(ECL)试剂(美国微孔)。ELISA试剂盒被命令从热检测il - 1的分泌β和地震BALF根据制造商的指示。

2.7。实时PCR试验

mir - 181 - 5的水平- p在ADSCs液来自ADSC, exosome-treated BMDMs被实时PCR检测实验。总之,总RNA分离液使用试剂盒的解决方案,其次是逆转录的互补,一个简单的脚本工具(TransGen,中国)。的相对表达mir - 181 - 5 - p是衡量使用SYBR绿色SuperMix工具包(TransGen) 7900年ABI棱镜(美国应用生物系统公司)和内部控制U6规范化。引物如下:U6,意义上,5 - - - - - -CTCGCTTGGGCAGCACA-3 ,反义,5 - - - - - -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;mir - 181 - 5 - p,意义上,5 - - - - - -GCGCAACATTCAACGCTGTCG-3 ,反义,5 - - - - - -GTGCAGGGTCCGAGGT-3 。

2.8。荧光素酶报告基因分析

我们使用在线工具TargetScan预测潜在mir - 181 - 5 - p之间的结合位点和3STAT3 UTR区域。3UTR区域包含广泛的STAT3类型或突变结合位点和mir - 181 - 5 - p被克隆到pGL3向量获取pGL3-STAT-WT (STAT3-WT)和pGL3-STAT-Mut (STAT3-Mut)。293 t细胞和BMDM被播种在12-well盘子和cotransfected STAT3-WT或STAT3-Mut, mir - 181 - 5 - p模仿或数控和pRL-TK向量作为内部控制。转染24小时后,细胞细胞溶解和受到dual-luciferase记者系统(美国Promega)测量荧光素酶活动根据制造商的指示。

2.9。动物模型

C57BL / 6小鼠的两性(6)下令从查尔斯河实验室(美国),随机分为实验组和对照组。建立肺炎模型,小鼠麻醉和感染有限合伙人(1μg)或k个轮胎(10⁴通过气道CFU)。新培养或低温贮藏ADSCs静脉注入小鼠感染后k .肺炎6小时。老鼠被牺牲了16小时后48小时或接种肺炎。血液和主要器官(肺、肝脏和脾脏)收集确定的水平k个轮胎和下面的实验。确定定位液在肺组织巨噬细胞,PKH26-labeled液(70μg在100年μL PBS)气管内的受感染的老鼠。

2.10。免疫荧光染色和组织学检查())

对共焦实验,ADSCs转染了cyc3-labelled益生元获得液。然后,BMDM被处理液含有cyc3-labelled低聚糖和GW4869 (exosomal抑制剂)。细胞荧光显微镜下观察和拍摄(德国徕卡)。确定定位液的肺,肺部分与anti-CD86孵化抗体(巨噬细胞)的生物标志物和anti-Ly-6G抗体(中性粒细胞的生物标志物),其次是孵化Alexa 488二级抗体(热)和DAPI。荧光显微镜的图像拍摄(莱卡)。小鼠肺组织也通过苏木精和伊红染色(圆))染色观察组织损伤和被显微镜(莱卡)。

2.11。炎症和Caspase-1活动

检测炎症发生在肺,我们清点的数量由cytospin BALF中炎症细胞。简而言之,细胞悬液离心5分钟在300 rpm Cytospin机(热)。巨噬细胞和中性粒细胞的数量由血细胞计数器计数。inflammasome活动发现肺部通过使用半胱天冬酶1 inflammasome分析工具包(热)。

2.12。道德准则

动物保健和方法程序授权的动物伦理委员会无锡第五人民医院(批准号2020-0317-16)。程序符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版,第八版,2011)。

2.13。统计分析

数据在这个工作由SPSS 22.0软件进行了分析。两个或两个以上的团体之间的差异被双尾未配对学生的分析 - - - - - -测试或单向方差分析分析。参数数据显示为手段和标准偏差(SD)。

3所示。结果

3.1。人体脂肪间充质干细胞鉴定(ADSCs)

我们第一次成功地孤立和老鼠的ADSCs从脂肪组织特点。流式细胞术对细胞表面标记物的证明ADSCs CD90、CD105表达ADSCs的典型生物标记,而不是CD31和CD45(图1(一))。ADSC被显微镜的形态,如图1 (b)。ADSCs向脂肪细胞和成骨细胞的明显的分化是观察到油红O染色(图1 (c))和茜素红染色(图1 (d)),分别。

3.2。Exosomal mir - 181 - 5 - p脂肪间充质干细胞(ADSCs)之间的通信和BMDM

然后我们探索的转移miR-18a-5p ADSCs BMDM。液ADSCs隔绝了TEM,和外来体蛋白质标记CD63 CD9被免疫印迹分析(数据验证2(一个)和2 (b))。接下来,BMDM被处理液从ADSCs RNaseA有或没有Triton X100的管理。miR-18a-5p的表达降低的BMDM cotreated RNaseA和特里同X100,与单独BMDMs被RNaseA(图进行比较2 (c))。此外,ADSCs服用mir - 181 a - 5 - p或者mir - 181 - a - 3 p模仿和mir - 181 a的表达- 5 - p升高了mir - 181 - 5 - p模仿但不是mir - 181 - a - 3 - p模仿,ADSCs和液从ADSCs(图2 (d))。ADSCs液分离出来的病毒转染后mir - 181 a - 5 - p或者mir - 181 a - 3 - p BMDM管理。值得注意的是,mir - 181水平- 5 - p也增强BMDM处理液从mir - 181 - 5 - p mimic-treated ADSCs(图2 (e))。此外,转移和吸收mir - 181 - 5 - p从mir - 181 - 5 - p mimic-treated ADSCs BMDM是可视化在BMDM cyc3染色,和外来体抑制剂GW4869可以抑制吸收(图2 (f))。这些结果显示了潜在的ADSCs和BMDM通过液之间的通信。

3.3。克雷伯氏菌肺炎感染增强mir - 181 - 5 - p在BALF和BMDM表达式

我们进一步确定变更mir - 181 - 5 - p LPS-induced炎症反应。被实时PCR鉴定表明,mir - 181 a的表达- 5 - p高架在支气管肺泡灌洗液(BALF)小鼠接受有限合伙人(图3(一个))。始终如一,k个轮胎感染诱导mir - 181 - 5 - p表达式BALF的老鼠(图3 (b))。与此同时,mir - 181 a的表达- 5 - p是增加BMDM LPS处理(图3 (c))。类似地,k个轮胎感染刺激mir - 181 a的表达- 5 - p在BMDM(图3 (d))。

3.4。mir - 181 - 5 - p能够目标STAT3信号

接下来,我们发现了一个潜在的交互mir - 181 - 5 - p和STAT3 mRNA 3UTR生物信息学分析(图4(一))。治疗mir - 181 - 5 - p模仿显著增强mir - 181 - 5 - p 293 t细胞和表达BMDM(图4 (b))。与此同时,STAT3 mRNA 3的荧光素酶的活动UTR压抑了mir - 181 - 5 - p 293年模拟t细胞和BMDM(数字4 (c)和4 (d))。一致,STAT3的mRNA和蛋白表达减少mir - 181 a - 5 - p模仿293年t细胞和BMDM(数字4 (e)- - - - - -4 (g))。此外,治疗mir - 181 - 5 - p模仿抑制而mir - 181 - 5 - p模仿抑制剂增强表达Nlrp3和Asc的关键组件Nlrp3 inflammasome,在293 t细胞和BMDM(图4 (h))。这些数据表明mir - 181的抗炎效果通过调节STAT3信号- 5 - p。

3.5。ADSC-Derived Exosomal mir - 181 - 5 - p压制肺和传播的产物克雷伯氏菌肺炎感染

随后,我们评估的影响ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - pk个轮胎侵染诱导体内肺部炎症。接收到的老鼠k个轮胎其次是ADSCs治疗感染,从ADSCs或液液mir - 181 a - 5 - p - ADSCs治疗。我们的数据表明,治疗ADSCs CFU大量减少k个轮胎肺部感染、肝脏、血液、脾(数字5(一个)- - - - - -5 (d))。同时,治疗液从mir - 181 - 5 - p -治疗ADSCs减毒CFU加载的k个轮胎感染肺、肝、血和脾与液从ADSCs(数字5 (e)- - - - - -5 (h))。

3.6。ADSC-Derived Exosomal mir - 181 - a - 5 - p变弱克雷伯氏菌肺炎Macrophage-Related方式侵染诱导的肺部炎症

我们接下来研究了炎症反应期间exosomal mir - 181 a - 5 - p规范反k个轮胎的过程。我们观察到,大多数PKH26-positive细胞CD68阳性(单核细胞谱系标记)而不是Ly-6G / Ly-6C多形核中性粒细胞(标记),表明液特别被肺巨噬细胞(图6(一))。治疗mir - 181 - 5 - p增强mir - 181 - 5 - p在巨噬细胞从BALF中获得(图表达6 (b))。ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p压抑在肺组织细胞浸润(图6 (c))。巨噬细胞和中性粒细胞减少的细胞计数ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p((图6 (d)))。ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p减毒inflammasome活动和il - 1的水平β地震,TNF -αTGF -β,并引发肺(数字6 (e)- - - - - -6 (g)和图S1)。

4所示。讨论

肺炎克雷伯菌革兰氏阴性的主要原因是肺炎。ADSCs了抑制功能k个轮胎侵染诱导损伤。然而,mir - 181 a的影响- 5 - p从ADSC-derived液肺炎克雷伯菌侵染诱导肺损伤仍然是模糊的。在目前的研究中,我们确定了关键作用的ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p在衰减克雷伯氏菌肺炎侵染诱导肺损伤。

先前的研究表明,mir - 181 - 5 - p减轻炎症通过瞄准endocan monocrotaline-stimulated肺动脉高血压(29日]。mir - 181 - 5 - p调节急性肺损伤和呼吸窘迫综合征30.]。mir - 181 - 5 - p限制血管动脉粥样硬化和炎症(31日]。在这项研究中,我们的数据表明,mir - 181 - 5 - p表达式由有限合伙人或升高k个轮胎BMDM感染和支气管肺泡灌洗液(BALF)的老鼠。这些数据暗示mir - 181 - 5 - p在调制的可能发挥重要作用k个轮胎感染。同时,微泡——(MV)分泌miR-223/142 BALF中增强和抑制肺部炎症和巨噬细胞活化钝化Nlrp3 inflammasomek个轮胎感染(22]。MiR-23a和mir - 155规范肺炎克雷伯菌人类肺上皮细胞粘附目标整合素α5β1信号[23]。Perlee和他的同事们最近报告说,ADSCs调节肺免疫增强抗菌反应k个轮胎引起pneumosepsis [14]。在这项研究中,我们观察到的转移和吸收mir - 181 - 5 - p从mir - 181 - 5 - p mimic-treated ADSCs GW4869 BMDM和外来体抑制剂可以抑制吸收。ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p压抑的肺和传播的产物k个轮胎感染小鼠,以及减毒的k个轮胎侵染诱导体内肺部炎症。我们的数据提供了一个ADSCs预防的关键机制k个轮胎侵染诱导的肺损伤和显示一个新的函数mir - 181 - 5 - p。的具体作用mir - 181 a - 5 - p在BMDMk个轮胎感染仍不清楚,需要进一步的调查。此外,STAT3被发现中发挥重要的作用k个轮胎感染相关性损伤(32,33]。在这里,我们发现mir - 181 - 5 - p能够抑制STAT3表达在转录后的水平和压抑Nlrp3 BMDM Asc表达式。我们的发现提供了新的见解的机制k个轮胎侵染诱导肺损伤,提出了报道的相关性mir - 181 - 5 - p STAT3信号在这个过程。与此同时,有一些当前研究的局限性。成功的外来体隔离应该基于验证了大小的方法,如动态光散射(DLS)。的临床价值ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p并不在这个调查评估,和交付方法的有效性ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p在临床应用应该探索由于microrna的不稳定特性。此外,STAT3可能只是下游的因素之一,mir - 181 a - 5 - p的调制k个轮胎侵染诱导肺损伤和其他潜在的机制需要在将来的研究中调查。

5。结论

总之,我们认为ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p缓解k个轮胎侵染诱导肺损伤通过瞄准STAT3信号(图6 (h))。ADSC-derived exosomal mir - 181 - 5 - p可以作为治疗的一个潜在的候选人克雷伯氏菌肺炎侵染诱导肺损伤。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了江苏省青年医学人才(批准号QNRC2016163)和顶尖人才支持计划的年轻人和中年人无锡健康委员会(批准号BJ2020092)。

补充材料

图S1: ADSC-derived exosomal mir - 181 - a - 5 - p变弱克雷伯氏菌肺炎侵染诱导肺部炎症。(a - c) PBS或收到的老鼠肺炎克雷伯菌(10⁴cfu)。和老鼠从ADSCs或液液处理mir - 181 a - 5 - p - ADSCs治疗。肿瘤坏死因子的水平αTGF -β,引发被ELISA检测BALF中。 。数据了 。统计显著差异表示: 。(补充材料)