文摘

炎症是人体的生物对内源性和外源性刺激的反应。最近的研究表明一些消炎的教鞭物种。在本文中,我们决定研究ethanolic提取物的抗炎作用竹板阿魏对肿瘤坏死因子- oleo-gum-resin(阿魏)α刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。HUVECs被培养的平底盘子然后ethanolic处理提取阿魏(EEA 0 - 500μ克/毫升)和肿瘤坏死因子-α(0 - 100 ng / ml) 24 h。我们使用MTT测试来评估细胞的生存。此外,质分析来确定活性物质。HUVECs与经济区进行预处理,然后引起肿瘤坏死因子-α。细胞内活性氧(ROS)和外周血单核细胞的粘附(PBMCs)与DCFH-DA HUVECs进行评估,CFSE荧光探针,分别。基因表达的细胞间细胞粘附molecule-1 (ICAM-1)、血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)和E-selectin ICAM-1蛋白质的表面表达测量使用实时PCR和流式细胞术方法,分别。而肿瘤坏死因子-α显著增加细胞内ROS形成和PBMC粘附TNF -α的预处理全身HUVECs HUVECs经济区(125年和250年μg / ml)显著降低参数。此外,EEA预处理降低TNF -α全身的mRNA的表达VCAM-1 ICAM-1和表面蛋白表达的靶细胞。总的来说,结果表明,EEA阻止活性氧生成,肿瘤坏死因子-触发α的表达,抑制VCAM-1 ICAM-1,导致PBMC附着力降低。这些发现表明,EEA可能有抗炎作用。

1。介绍

炎症是机体保护性反应对室内或外国刺激器,导致疼痛和组织损伤。成为慢性炎症时,会导致各种条件,包括哮喘、过敏反应、癌症、心血管疾病、血栓形成,和自身免疫性疾病(1,2]。

内皮细胞(提到过)的重要调节器血管炎症,及其功能障碍与许多慢性炎症的感应和扩张问题[3]。激活。年代upregulation炎症部位导致的内皮细胞粘附分子(ECAMs),其中包括血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)、细胞间粘附分子1 (ICAM-1), E-selectin (CD62E) [4,5]。同时,白细胞游走后ECAM表达导致组织和器官功能障碍通过分泌炎性细胞因子和趋化因子,包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和白介素- (I.L.) 1β6和86,7]。此外,有相当多的证据表明,肿瘤坏死因子-α会引发氧化应激通过增加活性氧(ROS)。减少活性氧代谢产物氧气,使其氧化能力。研究表明,表达量VCAM-1和ICAM-1直接连接到细胞内ROS合成(5,8- - - - - -10]。因此,抑制ROS的生成和ECAM表达式可以是一个有用的药用方法控制血管炎(11]。

糖皮质激素及非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药)是常见的治疗方法,预防慢性炎症通过减少生产和分泌TNF -α,il - 1β、活性氧和一氧化氮(NO)的炎症细胞(12]。然而,病人可能受到不利影响糖皮质激素和非甾体抗炎药,如胃痛、溃疡、肾功能衰竭、库兴氏综合征、高血压、糖尿病、骨骼脆弱,易受感染13,14]。因此,新的化合物以最小的副作用往往是检测并启动。

草药和提取常用多年来由于他们拥有活跃的化合物可能会提供一个有价值的药物发现平台(2,15]。例如,阿魏是一个oleo-gum-resin派生通过削减的茎和根不同教鞭物种,如f·阿魏L。(主要来源),f .麻,F。rubricaulis,f . rigidula,F。alliacea,F。教堂前厅,F。latisecta,F。lutensis,分布在伊朗南部和东部16,17]。

阿魏著名是因为它在伊朗民间医药制药的影响。它一直被用作止痉挛的,antihelmintic,抗癌,驱风剂,平喘药,全球抗癫痫,止痛剂(2,18]。此外,阿魏长期以来一直被用于治疗炎症,和一些消炎的特性被发现。阿訇等人证明了antinociceptive和抗炎的活动竹板阿魏在小鼠的慢性和急性疼痛,爪子水肿[19,20.]。在一个双盲研究中,阿魏炎症改善过敏性结肠疾病(21]。另一项研究显示,阿魏的影响减少和治疗类风湿性关节炎而引起的炎症标记物和软骨损伤大鼠(22]。这个证据提供了可靠的评估阿魏对减少炎症的影响和原因识别可能的机制参与了这一行动。我们的研究的主要目的是探索ethanolic提取物的抑制效果竹板阿魏oleo-gum-resin或阿魏(EEA) TNF -α刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。

2。材料和方法

2.1。材料

二乙酸5-Carboxy-fluorescein N-succinimidyl酯(CFSE)购买的圣克鲁斯(sc - 214315,圣克鲁斯、钙、美国)。2,7-Dichlorofluorescein二乙酸(DCFH-DA)和(5-dimethyl-2-thiazolyl) 2、5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)购买的σ(分别D6883和M2128 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。GeneAll RiboEx解决方案(301 - 001),互补脱氧核糖核酸合成装备(K1621热费希尔科学、钙、美国),和聚蔗糖密度为1.078 g / ml被买了ge医疗(17-5442-02,ge医疗、芝加哥,美国)。从eBiosciences PE-conjugated ICAM-1和PE-isotype控制(分别为12-0549-42和12-0549-42,eBioscience热费希尔科学、钙、美国)。胰蛋白酶、青霉素和链霉素(P / S),胎牛血清(的边后卫)、DMEM high-glucose媒介购买都从GIBCO(美国纽约大岛)。二甲亚砜(DMSO)从Amresco购买(梭伦,哦,美国)。

2.2。制备浸渍的经济区

竹板阿魏oleo-gum-resin塔巴聚集的地区(南方Khorasan伊朗)。确认该凭证标本的标本学院制药、医学科学大学马什哈德、伊朗(代金券号码:13257)。35克的干竹板阿魏oleo-gum-resin浸渍在70%乙醇和保存在一个瓶孵化器(28°C, 145 rpm)两天。后来,解决方案是通过绘画纸过滤器过滤。4,离心机,浮层。剩余的解决方案是在37°C,干重,保持在整个研究−80°C。

2.3。细胞培养和条件

HUVECs是天才博士核磁共振Ardeshiry-Lajimi (Shahid Beheshti医疗,德黑兰,伊朗)。DMEM high-glucose介质纯度10% 的边后卫和1% penicillin-streptomycin提供细胞实现融合在37°C在潮湿的气氛中在5%以下 有限公司₂。

2.4。细胞生存能力评估

细胞生存能力MTT试验测定。HUVECs ( 细胞/ 96 -孔板)保存在补充媒体24小时。一天后,与200年文化媒体交换μl无血清培养基组成的不同浓度的经济区(0,31,62、125、250年和500年μ克/毫升)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α克隆(如前所述)23]在不同浓度(0、0.1、1、10和100 ng / ml) 24 h。第二天,20μl (MTT(5毫克/毫升)应用于每个好,储存在37°C为另一个4 h。最后,井被清空,满100μl (DMSO溶液溶解甲瓒晶体。水溶性的吸光度甲瓒在570和630海里使用读出时代微型板块分光光度计(美国Biotek仪器)。培养细胞在控制中100%被认为是可行的。

2.5。PBMC附着力试验

为了检查TNF -的效力α的感应ECAMs HUVECs在细胞表面,我们执行一个细胞粘附试验使用外周血单核细胞(PBMC)。HUVECs被播种在96孔板( 细胞/)和孵化,直到达到融合。细胞被刺激10、20和40 TNF - ng / mlα6、12、18 h,分别。PBMCs被从外周血分离所述其他地方(24),与CFSE标记(1毫米)15分钟37°C。PBMCs是离心机5分钟,洗两次与PBS(1×)删除CFSE自由。洗了HUVECs PBS(1×)然后50μl PBMC悬挂标签( 细胞/毫升)被添加到每个和孵化1 h。板是用PBS(1×)去除未婚PBMCs。然后,每个充满了100年μl PBS和检查了一个倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯IX70),而照片用数码相机(日本奥林巴斯DP-12)。之后,与0.25% Triton x - 100细胞细胞溶解,细胞溶解细胞的荧光强度测量在485 nm使用荧光激发和535海里排放标仪(美国BioTeck Cytation 3)。

EEA的抑制作用TNF -α全身的PBMC粘附在HUVECs评估与经济区作为预处理两个浓度(125年和250年μg / ml)缺乏媒体包含1% 的边后卫6 h, TNF -紧随其后α在最优时间刺激。

2.6。细胞内活性氧测定

肿瘤坏死因子的影响α在细胞内的活性氧产量HUVECs使用DCFH-DA协议进行评估。首先,HUVECs ( 细胞/)在12-well培养板直到confluency达成。然后,细胞治疗10,20,TNF - 40 ng / mlα12 h。接下来,媒体被丢弃,细胞被洗两次与PBS(1×)和孵化DCFH-DA (10μ米)20分钟的孵化器。然后,删除未使用的DCFH-DA洗井,然后满心PBS (100μ信用证)。接下来,用一个倒置荧光显微镜细胞进行了分析,并与数码相机照片。最后,与0.25% Triton x - 100细胞细胞溶解,细胞溶解细胞的荧光强度是决定在485 nm励磁和535海里排放通过荧光标。

EEA的抑制性影响TNF -α全身的活性氧产量评估通过预处理HUVECs经济区在两个浓度(125年和250年μg / ml)在缺乏媒体6 h, TNF -紧随其后α刺激在最佳时间和浓度。

2.7。使用实时PCR基因表达的评估

HUVECs治疗后在各种条件下,RiboEx总RNA提取的解决方案。样本收获1毫升的解决方案特定的RNA提取按照制造商的指示。首先,总RNA浓度和纯度量化。然后,互补DNA制备与RevertAid第一链cDNA合成装备生产商的指导。实时PCR,扩增的E-selectin ICAM-1, VCAM-1 ABI期实时PCR系统上执行使用SYBR绿色qPCR大师混合(A325402、Ampliqon、丹麦)根据制造商的指示。放大过程包括一个初始变性15分钟在95°C,变性15 s在95°C,引物退火15 s 60°C,和扩展了30年代在72°C,融化曲线温度范围从60°C到95°C。PCR循环的数量是40岁的反应。引物序列见表1。

2.8。通过流式细胞仪检测ICAM-1

HUVECs首次治疗或没有EEA所需浓度的6 h, TNF -紧随其后α刺激(20 ng / ml) 12 h。治疗后,HUVECs收获使用PBS-EDTA(10毫米)和PBS洗,resuspended在100年μl绑定缓冲。然后再对样本5μl pretitrated PE-conjugated ICAM-1抗体。相关PE-labeled同形像被用作控制。这些细胞被洗后30分钟在4°C在黑暗中孵化,和表面的表情ICAM-1被流式细胞术检测(Sysmex-partec、立方体6)。

2.9。液相色谱-光谱法(质)的分析竹板阿魏提取

液相色谱-光谱法(质)在安捷伦1200系列液相色谱分析加上安捷伦6410三重四极质谱仪25,26]。在安捷伦液相色谱分离了Eclipse + C18 ( )列。流量被设定为0.4毫升/分钟,和流动相组成(一)水+ 0.1%甲酸和甲酸(B)甲醇+ 0.1%。梯度程序如下:0.0 - -1.0分钟10% B, 1.0 -40分钟从10%到100% (B), 42.0 (B) 40.0 - -42.0分钟100%,-50分钟从100%到10% (B)。质谱是收购了从100年到1000年在50分钟的扫描时间。积极的电喷雾电离(ESI)模式是质谱仪的应用。质量质获得数据的特征提取和最大峰值检测是使用完成的MZmine分析软件包,2.3版本。

2.10。统计分析

所有值都被评估使用SPSS 16.0版软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。由于提供的报告 对于每一个至少三个独立实验的条件和使用参数或非参数检查事后分析。此外,原始数据的流式细胞术和实时PCR分析FSC表达2009软件,和休息。因此,单向方差分析(方差分析)和图基进行测试调查组织变化。统计上显著差异,一直在考虑 ,0.01和0.001。

3所示。结果

3.1。决定细胞生存能力,PBMC粘附,细胞内ROS HUVECs的生产

首先,EEA的细胞毒性影响HUVECs测试使用MTT测定24 h后治疗。欧洲经济区没有显著影响细胞的生存能力高达500μ克/毫升(图1(一))。然后,我们评估的细胞毒性产生TNF -αHUVECs。如图1 (b)没有什么变化,在细胞的可行性HUVECs 0.1利用浓度范围从-100 ng / ml,表明TNF -α不是直接HUVECs有毒。

在那之后,我们决定评估TNF -的功效α通过分析能力促进PBMC在HUVECs粘附和细胞内ROS生产。如图1 (c)的附着力PBMCs HUVECs明显增加了20 ng / ml TNF -α在所有条件下相比,其控制( ),最可观的上升在12 h。此外,治疗HUVECs表明TNF -α浓度为12小时显示显著的活性氧产量增加,ng / ml TNF - 20α比其他浓度的TNF -α(图1 (d))。

3.2。EEA抑制肿瘤坏死因子-α全身的细胞内ROS PBMCs-HUVECs生产和附着力

我们调查是否EEA可以减弱TNF -α全身的活性氧产量。HUVECs在定义使用EEA浓度与肿瘤坏死因子- 6 h,然后刺激α(20 ng / ml) 12 h。如图2(一个),EEA TNF -大幅下降α介导细胞内ROS浓度在HUVECs同时生产125 ( )和250年μ克/毫升( )。因为细胞内活性氧的增加是一种有效的诱导物的细胞粘附分子,我们调查了经济区的影响在PBMC粘附TNF -α激活HUVECs。研究结果展示,与250年EEA预处理μg / ml显著减少PBMCs-HUVECs附着力( ,图2 (b))。

3.3。EEA抑制肿瘤坏死因子-α全身ECAM HUVECs mRNA的表达

实时PCR探索已经完成检查VCAM-1, ICAM-1和HUVECs E-selectin mRNA表达激活。预处理的HUVECs经济区(250μg / ml) 6 h VCAM-1下降,ICAM-1, E-selectin基因表达与肿瘤坏死因子-平行α刺激组。但这只是减少重大VCAM-1表达式( )(图3)。

3.4。EEA抑制肿瘤坏死因子-α全身ICAM-1 HUVECs表面蛋白表达

自从ICAM-1 PBMCs-HUVECs依从性是一个关键的先决条件,我们研究了经济区的影响在其蛋白质表面分布通过流式细胞术。研究结果表示,ICAM-1蛋白表达(图4)缺乏如果细胞,肿瘤坏死因子-α(20 ng / ml)增强其表面聚合。相比之下,EEA(125年和250年μg / ml)显著降低ICAM-1蛋白的表达在肿瘤坏死因子-α刺激HUVECs ( )这两种情况下,图4)。

3.5。质分析竹板阿魏提取

实验上33 hydroethanol提取的特征化合物竹板阿魏,这是一个丰富的氧杂蒽酮,flavonoid-glycosides、异黄酮和其他衍生品。确定了化合物在表表示2。的总离子色谱图竹板阿魏提取和提取离子色谱图的例子从总离子色谱图及其相关质量图所示5。女士光谱数据与之前报道的化合物在一些比较文学。大部分的化合物中发现f·阿魏提取曾被报导过教鞭物种。此外,一些香豆素(ligupersin)、倍半萜烯(taraxacin, fetidone, fetidone B),和倍半萜烯香豆素(assafoetidin、umbelliprenin assafoetidinol,甲基galbanate, 8-acetoxy-5-hydroxyumbelliprenin, galbanic酸,epi-samarcandin,和epi-conferdione)被检测到竹板阿魏提取。一些含硫化合物(2-butyl 1-propenyl二硫化物,2-butyl 3 - (methylthio) 2-propenyl二硫化物,1-methylthio-1-propene, methyl-1-propenyl二硫化物,S-methylpropanethioate,二甲基三硫化物,2-butyl甲基二硫化物,二丙基二硫化物,2-butyl乙烯基二硫化物,甲基1 -丙基二硫化物(methylthio), 1 - (methylthio)丙1-propenyl二硫化物,asadisulfide, di-2-butyl三硫化物,di-2-butyl四硫化物,foetisulfide,和foetisulfide C),二萜(7-oxocallitrisic酸,picealactone C, 15-hydroxy-6-en-dehydroabietic酸),和乙炔(falcarinolone)也确定了。

4所示。讨论

炎症反应是一个复杂的互连机制的各种生物、化学和物理刺激。慢性炎症可引起组织损伤和炎症性疾病,如关节炎、动脉粥样硬化和癌症。白细胞的运动炎性病变和促炎细胞因子和趋化因子的主要步骤是患慢性炎性疾病(27]。如果提到过这些事件发生促炎介质引起的年代,如肿瘤坏死因子-α通过肿瘤坏死因子,刺激ECAMs / TNF -α受体信号级联和活性氧的生产(28- - - - - -30.]。因此,抑制ROS的生成和ECAM表达式将是一个有用的治疗方法治疗血管炎性疾病(31日]。

我们所知,这是第一个研究考虑f·阿魏肿瘤坏死因子-提取物的抗炎活性αHUVECs炎症模型。肿瘤坏死因子-α在几项研究使用不同浓度检查多个化合物的抗炎活性(32]。在这一点上,我们与TNF -诱导炎症α最重要的促炎细胞因子,在无毒浓度,特别是增加PBMC粘附和ECAM表达水平。符合这些发现,之前的实验表明TNF -α增强活性氧生成、单核细胞粘附和ECAM表达式(33,34),支持我们的结果。

提供一个好的愿景挑选工作浓度,我们首先进行了细胞毒性分析基于各种HUVECs EEA浓度。我们发现在这些细胞提取没有任何细胞毒性浓度低于500μ克/毫升。我们也观察到,EEA只有250μ克/毫升的EEA显著抑制ROS水平和PBMC附着力。肿瘤坏死因子-α刺激HUVECs,表明抑制行动EEA的高水平的ROS和PBMC附着力。质分析显示这种植物中33个不同化合物的存在,包括foetisulfide, foetisulfide C, B fetidone assafoetidin, umbelliprenin,和其他人,这可能有一个角色在inflammation-induced行动。在这种背景下,一些研究表明,毛地黄黄酮和香豆素,阿魏的重要成分,抑制活性氧的形成,减少单核细胞粘附TNF -α刺激HUVECs [35,36]。umbelliprenin Khaghanzadeh和他的同事们发现,倍半萜烯香豆素,诱导抗炎反应通过增加血清抗炎细胞因子的分泌和小鼠的脾细胞(37]。Kohno等人表明,甲基galbanate来自竹板szowitsiana减少没有生成和伊诺mRNA表达和降低cox - 2 mRNA表达有限合伙人/ IFN-stimulated RAW264.7细胞(38]。正如预期的那样,欧洲经济区显著抑制TNF的表达α全身VCAM-1基因和ICAM-1蛋白质在我们的研究中。同样,EEA减少ICAM-1基因表达却微不足道。转录、翻译、和蛋白质周转都是细胞活动所需。这些因素的参与讨论蛋白质含量,记录水平和同源蛋白质含量并不总是关联由于不同的计时,点的行动,转化的规定,和蛋白质降解规定,所有这些都需要在控制稳态蛋白质丰度(39]。mRNA的故障包括记录长度,核糖体密度、偏置密码子的使用,和G.C.密码子第三点内容,提高蛋白质破裂创造(40,41]。

Ahmadvand等人在2013年的一项研究表明,阿魏富含天然抗氧化剂如eremophilene和化合物δ杜松烯抑制monocytes-endothelial通过抑制细胞粘附VCAM-1表达式(19]。此外,它被发现阿魏包含不同的化合物,如酚类化合物、黄酮类化合物、含硫化合物、二萜、倍半萜烯(42,43]。1995年,Gerritsen等人表明,一些黄酮类化合物ICAM-1的表达下降,VCAM-1, E-selectin基因和减少其表面表情TNF -α全身HUVECs [44]。此外,在一项由Motai(2004),倍半萜烯香豆素类抑制没有发展和诱导合成酶的表达LPS-induced鼠macrophage-like细胞系(原始264.7),建议的抗炎效果竹板fukanensis(45]。

此外,2004年进行的几项研究表明,各种天然抗氧化化合物,包括类黄酮和多酚类化合物,抑制单核细胞粘附在提到过年代(46,47]。因此,根据所有证据,我们提出这个问题f·阿魏和它的化合物可能具有抗炎作用。然而,更多的实验是必要的标识的组件的影响f·阿魏和其在体外和抗炎活性在活的有机体内研究。

5。结论

自阿魏有很强的消炎作用中提到的各种研究中,我们评估了经济区是可能的抗炎分子机制。肿瘤坏死因子-α可以触发激酶级联途径在细胞和诱发NF -κB在核,导致粘附基因的转录和表达在细胞表面。EEA通过减少活性氧生成、VCAM-1基因表达ICAM-1蛋白质表达和白细胞粘附在HUVECs可能抑制炎症。这项研究提供了大量的证据,支持阿魏的治疗价值竹板阿魏申请人是一个新的预防和治疗慢性炎症性疾病,如动脉粥样硬化疾病,在人类身上。然而,进一步的工作是需要解释这些有前途的特性。

缩写

肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α
EEA:	Ethanolic提取的阿魏oleo-gum-resin
HUVECs:	人类脐静脉内皮细胞
TNFR:	肿瘤坏死因子受体
PBMCs:	外周血单核细胞
ROS:	活性氧
VCAM-1:	血管细胞粘附蛋白- - - - - -1
ICAM-1:	细胞间粘附molecule-1
提到过:	内皮细胞
ECAMs:	内皮细胞粘附分子
非甾体抗炎药:	非甾体类抗炎药
没有:	一氧化氮
CFSE:	二乙酸5-Carboxy-fluorescein N-succinimidyl酯
DCFH-DA:	2,7-Dichlorofluorescein二乙酸
麻省理工:	(4、5-Dimethyl-2-thiazolyl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴离子
的边后卫:	胎牛血清
DMSO溶液:	二甲亚砜。

数据可用性

数据用于支持本研究的发现可以以合理的请求。

的利益冲突

作者验证没有利益冲突。

作者的贡献

L.M.,M.K., and VRA carried out the experiment, wrote the manuscript, and analyzed the data. H.S. helped to supervise the project. MM helped on carrying out the investigation. GAS and M.K. supervised the project. All authors discussed the results and commented on the manuscript.

确认

我们承认Birjand大学医学科学在经济上支持这个研究项目。这项工作是研究和技术支持的副校长Birjand大学医学科学(格兰特号码:455590)。