文摘
Sepsis-induced炎症反应导致肠道损伤和继发性细菌易位,引起系统性感染并最终死亡。大黄素是一种天然蒽醌衍生物在许多植物有前途的生物活性。然而,大黄素的效果和机制sepsis-induced肠道障碍尚未好澄清。我们发现大黄素抑制治疗脓毒性小鼠的肠道炎症反应。肠道屏障功能也提高了大黄素通过加强ZO-1和occludin的表情,防止二次易位大肠杆菌。蛋白质微阵列的调查,JNK2被确认为大黄素的直接目标。在体外研究还表明,大黄素抑制LPS-induced肠道上皮细胞的炎症反应。核因素包括NF -κB和AP-1 JNK2进一步确定为下游效应器。基于16 s rRNA基因测序的生物信息学分析表明大黄素治疗显著增加α-和beta-diversity感染性肠道微生物群的老鼠。此外,根据功能的预测数据显示,大黄素在肠道潜在致病菌的大量减少。我们的研究结果表明,大黄素治疗预防炎症诱导屏障功能障碍和减少流明的潜在致病性细菌,减少肠道细菌易位腔在脓毒症的风险。
1。介绍
脓毒症是一种危及生命的疾病造成的感染,并发免疫系统功能障碍,和multiorgan失败1,2]。发布的数据显示,脓毒症仍然是主要的死亡原因重症监护室(ICU) [3,4]。医院在整个人口死亡率是22.4%,甚至与感染性休克是相关的死亡率超过40% (5,6]。尽管治疗脓毒症的治疗方法不断改善,越来越多的证据显示增加脓毒症的发病率在过去的20年7]。
器官功能的临床评估是由常规生物标记,最受影响的器官在脓毒症和脓毒性休克包括肾脏、肺、心血管系统(8]。然而,最初的病理机制和肠道组织也被认为是必不可少的脓毒症(9- - - - - -11]。上皮被描述作为炎症反应的电动机由于促炎细胞因子的分泌和活性氧在应对病原体(12]。过度炎症反应小肠导致肠道上皮屏障的损害和细菌易位,导致当地的继发感染以及遥远的地区(13,14]。因此,治疗注重肠道可能有助于治疗脓毒症(15- - - - - -17]。
大黄素(1、3、8-trihydroxy-6-methylanthraquinone)是一种天然蒽醌衍生物中存在不同类型的中药,如感冒palmatuml草决明,蓼属植物multiflorum研究,芦荟精华素。几项研究已经报道,大黄素具有广泛的药理作用,如免疫抑制、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏药、抗糖尿病的属性(18,19]。最近的证据报道,大黄素治疗脓毒症的治疗有益。玉等人发现,大黄素显著抑制overactivation严重脓毒血症患者的外周血单核细胞隔离(20.]。郭等人报道,大黄素在脓毒性减弱急性肺损伤大鼠通过抑制过度炎症和细胞凋亡21]。陈等人表明,大黄素减轻空肠的损伤在大鼠脓毒症(22]。
在过去的几十年中,许多策略也已经被开发出来,以挖掘和研究潜在的抑制剂的蛋白质。例如,HuProt™20 k是一种固相蛋白微阵列芯片阵列芯片与近20,000全身蛋白质芯片,提供一个公正的高通量筛选方法来发现目标分子(23,24]。蛋白质的分子动力学模拟,已经使用了25年前,现在广泛使用的是策略研究结构和动力学在各种条件下(25- - - - - -27]。通过使用这些工具,研究人员能够识别潜在的蛋白质和分子组合和理解交互的细节。
尽管积累利益的大黄素的药理和生物活性,还有有限的文档报告了大黄素的减少肠道细菌的致病性和防止潜在的易位,这可能反过来帮助我们改善我们的理解对大黄素的药理作用。
2。材料和方法
2.1。试剂
大黄素高效液相色谱法(HPLC)纯度(> 98%)购买从Tauto生物技术(上海,中国)。有限合伙人(大肠杆菌O55: B5), DMSO、EMB FITC, DAPI,苏木精和伊红,山羊antirabbit抗体买来Sigma-Aldrich化学(圣路易斯,密苏里州,美国)。Bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验设备购买从皮尔斯(美国罗克福德,IL)。TARC ELISA试剂盒,il - 1β和肿瘤坏死因子-α买来Cusabio(武汉、湖北,中国)。ZO-1抗体,Occludin、Claudin-1 Caspase-3裂解,sirt - 1基因,JNK2, p-JNK2 pAP-1, pp65,肌动蛋白从Abcam购买(丹弗斯、马、美国)。
2.2。CLP模型的建立
一百五十雄性BALB / c小鼠,8周大(在18到22岁的g),被随机分为5个处理组。戊巴比妥钠(40毫克/公斤·bw)作为疼痛医学手术期间。像之前描述的那样鼠CLP模型建立了以下协议(28]。短暂,老鼠接受CLP手术前禁食24 h与水允许操作。和结扎麻醉老鼠然后打开腹腔中位置,由50%的盲肠。在盲肠5-gauge针用于穿刺(从回盲肠的结1厘米)。然后,少量的粪便被挤压的小孔。最后,盲肠被谨慎地搬迁到腹部和切口缝合起来。小鼠皮下注射1毫升37°C生理盐水和禁食12小时。在我们的手中,这个模型的48小时死亡率约为80%。
2.3。细胞培养
MODE-K细胞从美国购买类型文化集合(罗克维尔市,医学博士,美国)在DMEM培养基培养和补充10%的边后卫和抗生素(100 U /毫升链霉素和100 U /毫升青霉素)在37°C湿润孵化器有限公司为5%2。
2.4。瞬时转染JNK2与本构活跃
质粒表达flag-tagged持续活跃JNK2 (pCDNA3国旗MKK7B2Jnk2a2)描述之前29日),并从Addgene购买(美国Cambridge, MA)。MODE-K细胞转染了JNK2 (pCDNA3国旗MKK7B2Jnk2a2)质粒一起Lipofectamine 2000试剂(热费舍尔CN,中国上海)一夜转染。条件培养基收集,然后细胞细胞溶解。西方墨点法进一步用来确认JNK2的表达。
2.5。分子对接的AutoDock
进一步描述大黄素和JNK2蛋白质之间的相互作用,我们进行了分子对接和仿真研究使用的晶体结构JNK2 (RCSB PDB: 3人大)获得的蛋白质数据库(PDB)https://www.rcsb.org/structure/3NPC。大黄素的Mol2文件被ChemDraw画和转换。AutoDock软件用于灵活码头JNK2和大黄素和得到初步对接阶段结构。至少50对接结果生成,最好的阶段对接结构提取的能源选择。
2.6。由AMBER16分子动力学模拟
选择最优对接构象和分子动力学模拟方法使用AMBER16软件。整个蛋白质系统支持的鱼钩和ff14SB力场。氢原子和敌对的离子被自动添加到使系统电中性。分子动力学模拟的工作流程包括四个步骤:最小化,加热、平衡和生产运行。使用两步能量最小化和动态仿真时间是100 ns。蛋白质分子的构象结构复杂的平均60 - 100 ns用于后续分析。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)
简单地说,我们采用ELISA检测释放细胞因子的水平在活的有机体内和在体外,包括TARC il - 1β和肿瘤坏死因子-α。收集血清或细胞上清液,马上化验。所有协议都是按照制造商的指示执行。
2.8。西方墨点法
蛋白质提取的样本通过裂解缓冲,并量化使用BCA化验设备。蛋白质分离通过sds - page和electro-transferred硝化纤维素膜(热费希尔CN、上海、中国),然后孵化与特定的抗体,包括ZO-1 Occludin, Claudin-1, Caspase-3裂解,sirt - 1基因,JNK2, p-JNK2 pAP-1, pp65和肌动蛋白。辣根过氧化物酶(合)共轭山羊antirabbit免疫球蛋白(Sigma-Aldrich CN 1: 5000年,中国上海)采用二次抗体。
2.9。苏木精和伊红染色())
回肠段每组第一个沉浸在10%中性缓冲福尔马林(甲醛100毫升,900毫升蒸馏水,和磷酸二氢钠6.5克)在室温下48 h。固定的标本被嵌入在液体石蜡和切成5μ米厚度。部分被苏木精和伊红染色,肠道形态学变化使用光学显微镜观察(德国蔡司、耶拿TH)。肠道损伤的程度得分从0到5赵的评分方法的使用标准。从每个老鼠至少五个随机选择的字段进行评估和平均来确定粘膜损伤。
2.10。扫描电子显微镜(SEM)
回肠室的标本固定在4%戊二醛在一夜之间,然后你找找在寒冷的四氧化锇1% 1 h,紧随其后的是三个甲次砷酸盐缓冲洗。逐步脱水后通过一系列乙醇分级方案,样本嵌入Epon-Araldite (Emicron EPON 812年,中国上海)。超薄部分是沾饱和在50%乙醇和醋酸铀酰柠檬酸铅。微形照片是通过采用扫描电子显微镜(S3400N、日立、日本东京)。
2.11。肠道上皮Paracellular渗透率试验
小鼠的肠道通透性测定使用的通量FITC-labeled葡聚糖分子质量4 KDa (FD4, Sigma-Aldrich)如前所述21]。44个毫克/ 100克体重FITC-labeled 4-kDa右旋糖酐是口头管理到每一个鼠标。血液收集和离心分离血清5 h后FD-4管理。血清荧光强度评估是由荧光计(激发,492海里;发射,520海里;BioTek)。
2.12。JC-1荧光检测
细胞收获和染色使用J-aggregate-forming亲脂性的阳离子5,5 ,6、6 - - - - - -tetraethylbenzimidazolocarbocyanine碘(JC-1)染料(热费希尔CN、上海、中国),这表明线粒体极化转移其荧光发射从绿色(em 530海里)红色(em 590海里)。获得的图像使用蔡司Axio成像仪M2荧光显微镜使用AxioCam和Axiovision软件和分析。
2.13。16 s rRNA肠道微生物群的基因序列分析
每个粪便样本中提取的总基因组DNA,和目标序列(16 s rDNA V3-V4地区)被PCR扩增。然后产品纯化、量化和均质序列库。图书馆建设图书馆,进行了质量控制和合格库测序在Illumina公司HiSeq 2500 (Illumina公司、圣地亚哥、钙、美国)。高通量测序获得的原始图像数据文件被base-calling分析转化为测序读。结果存储在FASTQ格式文件为进一步的生物信息学分析。
2.14。细胞因子微阵列分析
每个治疗组回肠样本或细胞上清液分别使用RayBio®小鼠炎症抗体阵列(RayBiotech AAM-INF-1,诺,美国)。简而言之,样本稀释和在抗体阵列孵化池。数组的幻灯片被清洗和孵化biotin-conjugated anticytokine混合2 h。Cy3-conjugated链霉亲和素被添加到抗体阵列池和孵化2 h。最后,荧光信号的强度检测通过InnoScan 300芯片扫描仪(Innopsys, Carbonne、Occitanie、法国)。
2.15。Phosphoproteomics分析
第一次细胞溶解样品里帕裂解缓冲(Applygen技术,北京)与磷酸酶抑制剂。蛋白质浓度测定用BCA试剂盒。20μ每个样本集中的g蛋白SpeedVac(热费舍尔CN,中国上海)此处则浓缩和孵化与二氧化钛珠子(二氧化钛)1 h在室温下然后通过离心分离颗粒状。洗后,此处则被筛选了,集中在SpeedVac。所有样品都是通过C18和加载到一个Nano-LC系统脱盐。肽分离,MS / MS是由使用视数据采集。数据法女士生组织磷酸化蛋白质组分析MaxQuant软件。方差分析测试进行识别蛋白质磷酸化水平有显著改变。
2.16。蛋白质微阵列数据处理
像之前描述的那样Biotin-emodin合成(30.]。蛋白质微阵列首次治疗阻断缓冲区(1% BSA在0.1%渐变20 TBST)在室温下1 h。Biotin-emodin和生物素添加到10μ米阻断缓冲区和孵化蛋白质微阵列为另一个1 h。之后,微阵列是孵化Cy3-Streptavidin稀释(Sigma-Aldrich CN 1: 1000年,中国上海)1 h和旋转干燥在250 g×3分钟。GenePix 4200芯片扫描仪(美国加利福尼亚州圣何塞分子器件、)被用来可视化并记录结果。一个R脚本应用于处理蛋白质微阵列数据。信噪比(信噪比)被定义为前景信号的中值比背景信号的中值。另一个索引,“比”,被定义为信噪比(biotin-emodin) /信噪比(生物素)24]。
2.17。统计分析
所有数据了 (SD)。统计分析了使用GraphPad棱镜7程序(美国GraphPad拉霍亚,CA)。生存率较用于kaplan meier生存分析。单向方差分析(方差分析)分析是用来比较两个或两个以上的团体之间的统计学差异数据,其次是图基的测试。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。大黄素在脓毒性减弱肠损伤老鼠
盲肠的结扎和穿刺手术(CLP)被用来评估治疗大黄素对脓毒性小鼠的影响。kaplan meier存活率的每组显示,口服大黄素20毫克/公斤·bw显著降低死亡率感染性的老鼠通过7天观察期(图1(一))。图片说明CLP手术不仅引起上层绒毛表面的侵蚀,也广泛的被破坏肠道绒毛。大黄素治疗保护肠道结构和减毒脓毒性小鼠的组织病理学变化(图1 (b))。由肠的组织学变化,赵emodin-treated组的得分显著低于在CLP(图组1 (d))。TUNEL分析结果表明,大黄素减轻肠道组织中细胞凋亡的发生率在一定程度上(数据1 (c)和1 (d))。
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3.2。大黄素抑制炎症反应的肠道感染性老鼠
细胞因子抗体阵列进行评价大黄素的抗炎效应在脓毒性小鼠的肠道(共40细胞因子表中列出S1)。结果显示,11高度表达细胞因子的回肠CLP老鼠明显下调大黄素的存在,包括胸腺和activation-regulated趋化因子(TARC)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)、白介素(IL) 1β,IL-17 il - 4 - 2、IL-3 il - 10, IL-12p70,肿瘤坏死因子(TNF)α和干扰素(IFN)γ(图2(一个))。考虑到高通量检测的假阳性,进一步验证我们的发现是由通过ELISA检测这些细胞因子。这些数据显示一致的结果,因为TARC的表达,TNF -α,il - 1β在回肠显著减少了大黄素治疗(图2 (b))。
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3.3。大黄素可防止Sepsis-Induced肠道屏障功能障碍
肠道屏障的重要蛋白质的功能评估。免疫印迹结果显示表达式的zonula occludens-1 (ZO-1) occludin, claudin-1感染性肠道的老鼠比对照组明显降低。大黄素治疗恢复ZO-1和occludin的表达式,对claudin-1但有限的监管作用。此外,一些凋亡蛋白包括caspase-3和Sirtuin蛋白1 (SIRT1)被发现。结果表明,大黄素明显抑制的表达裂解caspase-3感染性老鼠。在图3(一个)发现,sirt - 1基因的表达被大黄素部分恢复治疗(灰度值比较图S1)。的位置和表达ZO-1通过免疫荧光和occludin的进一步调查。这些数据表明大黄素恢复受损的表达式ZO-1 occludin的脓毒性小鼠(图3 (b))。氧化应激指标包括ROS和减少了大黄素治疗(图S2)。细菌易位是一个重要的肠道屏障功能障碍的结果。的数量大肠杆菌(大肠杆菌)在肠系膜淋巴结(mln)每组的评估。结果表明,的数量大肠杆菌在败血症小鼠mln显著高于对照组。大黄素治疗的数量明显减少大肠杆菌(图3 (c))。肠道通透性评估在活的有机体内使用FD4。老鼠的大黄素治疗组血浆FD4水平显著降低,与中电集团(图3 (d))。
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3.4。大黄素的JNK2被确定为直接目标
探讨大黄素的结合蛋白,bio-emodin(图4(一))是合成,蛋白质微阵列包含16368蛋白亲和力来净化氨基GST-tagged蛋白质。Bio-emodin或生物素是探测蛋白质微阵列和进一步孵化Cy3-conjugated链霉亲和素(Cy3-SA),导致蛋白质/ Bio-emodin交互(图4 (b))。JNK2微阵列的位置表示,荧光信号的值控制和bio-emodin微阵列比较(图4 (c))。信号噪声比(信噪比)为每个点了大黄素亲和力的蛋白质。大黄素/ JNK2的信噪比是13.3,表明强相互作用(图4 (c))。SPR检测也表明大黄素之间有一个强大的组合和JNK2 e-5 M(图1.19的亲和力S3)。活动检测的数据进一步证实了大黄素/ JNK2组合(图的影响4 (d))。的磷酸化水平JNK2被大黄素抑制治疗(图4 (e))。在对接过程中,至少50对接结果生成,和最好的阶段对接能源被选为结构提取,和AMBER16软件被用于分子动力学模拟。根据仿真数据,与RMSD Emodin-JNK2组合稳定在1.8,-8.05千卡/摩尔(图的价值S4)。对接数据进一步显示,从蛋白质的疏水性的表面地图,显示蛋白质的表面是由极性氨基酸。蛋白质表面主要由极性氨基酸。小分子绑定的口袋是一个疏水结合口袋的地区组成的纯疏水性氨基酸。此外,物理和化学性质的平面环小分子空腔(图匹配的绑定4 (f))。分子JNK2与大黄素相互作用的分析表明,糖环组由周围氨基酸和K55 Q117极性氨基酸,其中Q117可以形成一个强烈的氢键与羟基-哦组大黄素的顶部。苯环集团包括周围氨基酸的疏水氨基酸如L168、手机等,V158, M111, I86, L110和极性氨基酸如E109和N114(图4 (g))。
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3.5。JNK2对大黄素展览活动至关重要
为了更好地理解大黄素/ JNK2组合如何影响在脓毒性小鼠肠道损伤的过程,MODE-K细胞系被用来揭示出其潜在的机制。大黄素对炎症反应的影响估计使用40-cytokine微阵列。类似的结果在活的有机体内研究大黄素治疗抑制21细胞因子的过度LPS-challenged细胞(图5(一个))。此外,我们发现大黄素治疗表达下调JNK2的磷酸化水平,p65, P70S6K,和p53但在有限合伙人的存在增强p-AP1表达式,通过磷酸化蛋白质微阵列(共17列在表中S2)和免疫印迹检测(数字5 (b)和5 (c))。然而,提高JNK2部分逆转的监管效果的表达大黄素的磷酸化pp65 p-AP1。此外,大黄素治疗诱导的表达ZO-1 JNK2防止过度(图5 (c)),按照灰度值比较(图S5)。大黄素的抗炎效应也禁止JNK2超表达细胞(图5 (d))。此外,大黄素治疗逆转LPS引起的线粒体膜电位的降低,这种效应是被JNK2超表达(图5 (e))。
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3.6。大黄素调节肠道感染性老鼠的群落结构
到目前为止,感染性老鼠的大黄素对肠道微生物的影响还没有被报道。通过使用16 s rRNA基因测序,我们注意到重大变化在脓毒性小鼠的肠道群落结构和物种分布在不同的层面,包括门、类、秩序、家庭、和属的水平。这些趋势将被大黄素治疗(图部分逆转6(一))。此外,肠道微生物的物种丰度和多样性明显减少感染性老鼠。α多样性分析,数据说明,香农和辛普森指数显示对照组显著差异和脓毒症组和大黄素治疗可以恢复。但是,没有有意义的结果由Ace和曹国伟(图索引6 (b))。β多样性分析,大黄素治疗也逆转的变化引起的败血症根据PCoA和Anosim分析(图的结果6 (c))。
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3.7。转变的潜在功能分析感染性微生物群的老鼠
根据LEfSe和三元图分析,我们发现大量的变形菌门而减少吗厚壁菌门和拟杆菌门增加了大黄素相比,脓毒性小鼠(数据吗7(一)和7 (b))。进一步的功能预测基于BugBase用来预测微生物表型和潜在的功能。结果说明,兼性厌氧细菌的丰度与阻力的能力对宿主免疫系统被证明是脓毒性显著增加小鼠和大黄素能够降低(图7 (c))。齿轮函数预测反映序列的功能分布和丰富的样品也执行。值得注意的是每组之间的微生物群落功能基因参与代谢途径包括细胞生长和死亡,复制和修复、细菌性传染病(图7 (d))。
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4所示。讨论
脓毒症是一种危及生命的器官功能障碍引起的失调宿主对感染的24]。在脓毒症的早期阶段,过度释放炎性细胞因子引起的感染导致multiorgan损伤和缺血再灌注损伤,例如,肠屏障功能障碍。众所周知,胃肠道在脓毒症的病理生理学中发挥着关键作用,这是因为intestinal-derived感染是最常见的并发症的患者遭受创伤,烧伤,脓毒症和脓毒性休克31日]。压倒性的感染情况下,炎症环境有助于肠道研究进展,随后导致完整的细菌易位,内毒素,及各种代谢物的流明到以前的位置,加剧脓毒症以及历久不衰的炎性反应和插件(32]。因此,肠道功能障碍导致脓毒症的发病机制和插件33]。
大黄素是一种天然蒽醌,拥有完善的生物属性。Ho等人已经证明了,大黄素承诺抗病毒活动通过阻断S蛋白之间的相互作用和ACE2,从而抑制S protein-pseudotyped逆转录病毒的传染性细胞(34]。东等人发现,大黄素具有显著的抗菌效应革兰氏阳性和耐药细菌,如金黄色葡萄球菌,枯草芽孢杆菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)18]。除了抗感染作用,大黄素治疗也有器官保护属性,如神经保护、hepatoprotection和抗过敏药活动(35- - - - - -37]。最近,陈等人报道,大黄素减轻在脓毒性大鼠空肠的损伤通过抑制pJAK1 / pSTAT3-mediated炎症反应和Bcl2 /伯灵顿涉及细胞凋亡,部分揭示了大黄素对调节肠道功能障碍在脓毒症的影响(22]。在这项研究中,大黄素的作用在保护肠屏障功能和挖掘其潜在的机制在治疗败血症是评估。根据记录的数据(38),大黄素显示可再生的治疗效果在减少脓毒性小鼠的死亡率。同时,大黄素的保护作用减轻肠道损伤引起的CLP手术通过使用多维分析方法,包括他染色、扫描电子显微镜和TUNEL检测。考虑到肠脓毒症的病理过程的重要性,大黄素的保护作用肠道结构应该被认为是一个有前途的制备在脓毒症的预后。
肠道是由一层上皮细胞排列,它充当一个生理和代谢障碍paracellular运动的水,溶解物,和免疫调控因素,而潜在的入侵管腔内的毒素、病原体,和抗原被拦截到肠系膜淋巴结和循环(39,40]。肠道粘膜的保护和监管等上皮交界复合物adherens连接和紧密连接(套)。几个分子作为贡献者套如occludin的跨膜蛋白claudins, ZO-1已确定(41]。评价大黄素的影响在脓毒性小鼠套的调制,ZO-1的表达水平,occludin, claudin-1,套的缺陷可能会导致功能障碍,影响。类似于前公布的数据,ZO-1的表情,occludin, claudin-1受损的肠道感染性老鼠。大黄素治疗恢复ZO-1和occludin的表达,但没有显示出对claudin-1监管的影响。根据不同的表达模式和上游调节机制claudin-1和ZO-1 /阻塞[之间42,43),大黄素治疗调制ZO-1的表达,从claudin-1 occludin通过不同的信号通路。由于肠道屏障功能障碍,细菌易位在脓毒症的病理过程具有重要意义[32]。因此,大黄素对脓毒性小鼠肠道细菌易位的影响被计数的数量估计大肠杆菌在mln。不出意料,的数量大肠杆菌大大增加感染性mln的老鼠,表明继发感染的潜在情况。大黄素治疗抑制过度增长造成的细菌易位CLP手术,这可能是由于大黄素在套的保护财产和屏障功能。
物,包括三个不同的基因JNK1 JNK2 JNK3,是一个家庭的压力激发了MAPK的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶。与JNK3专门表达在中枢神经系统中,JNK1和JNK2具有广泛的组织分布和炎症反应中起着重要的作用,细胞凋亡,细胞信号(44,45]。可变剪接在两个不同部位产生不同的物亚型。差异蛋白激酶IX和X生产JNK1和JNK2α和β变体。同一类型的分子量46 kDa和54 kDa的可变剪接产生糖基(46]。通过蛋白质组学芯片和生物信息学分析,显示JNK2大黄素作为一个潜在的目标,以信噪比为13.3。下拉检测的结果也证实了大黄素和JNK2之间的互动。20 k的HuProt™微阵列芯片,我们使用数组是一种固相蛋白芯片与近20,000全身蛋白质芯片,覆盖81%的子区域的人类基因组。突变JNK2已经包含在HuProt™20 k芯片。根据芯片的结果,我们发现大黄素结合到JNK2人大(PDB ID: 3)。因此,我们使用这个晶体结构(3人大)调查Emodin-JNK2复杂的相互作用。根据模拟数据,大黄素治疗引起JNK2嵌入到活跃的地区主要是通过氢键和疏水作用,这是两个重要的约束性指标对于复杂的稳定,并包含许多氨基酸如Q117 K55, L168,手机等,M111, E109, V158, M111 I86, L110。在光生物效应的JNK2通过磷酸化调制,大黄素在JNK2磷酸化的影响进一步检测。正如所料,大黄素治疗预防pJNK2表达式脓毒性小鼠的肠道,这可能会反过来抑制激活下游的监管机构。
由于大黄素和JNK2的直接绑定,我们研究如何交互在肠道的完整性保护脓毒症。MODE-K细胞系被用来研究底层机制在体外。按照在体外发现,过度的炎症反应和TJ功能障碍引起的有限合伙人是减毒。实际上,21 40炎性细胞因子被微阵列检测减少了大黄素治疗。TJs-related蛋白质,包括ZO-1和occludin,也恢复了大黄素的存在。然而,大黄素的影响在JNK2超表达细胞系部分逆转,表明JNK2在大黄素表现出活动的潜在作用。为了更好地理解大黄素的调控机制,一个定制的磷酸化包含17个蛋白质微阵列芯片,其磷酸化是重要的细胞信号,建立了。通过比较结果WT与JNK2超表达细胞系,重大的改变与pp65和pAP-1引起了我们的注意。与WT细胞相比,pp65的表达增强,但pAP-1降低当JNK2在有限合伙人和大黄素的存在。P65 NF -亚基κB,这是一个核转录因子,免疫功能的监管机构已充分证明,增殖和迁移47]。因此,绑定到JNK2大黄素具有抗炎作用,从而阻止了NF -的激活κB-mediated信号通路,导致肠道炎症损伤的减轻。本研究显示另一个点对大黄素的作用/ JNK2套和屏障功能。最近,法比奥等人报道,抑制物具有增强上皮屏障功能通过调制claudin [48]。我们的研究结果揭示了潜在的调控机制JNK2在TJ / AP1功能,尚未报道。根据我们的数据,大黄素/灭活JNK2 JNK2复杂,导致AP1表达式的增强。过度的JNK2减少AP1表达式。这类似于这项研究由Kanaga et al .,这表明JNK2 c-Jun优先约束,从而导致c-Jun退化(49]。因此,得出的结论是,大黄素与JNK2结合,抑制NF -κJNK2 B-mediated过度炎症反应,大黄素治疗使其失去活性,导致AP-1的积累,这被认为是必不可少的恢复套在脓毒症和肠屏障功能。
肠道菌群中一览无遗的重要性考虑发展中脓毒症的风险(31日,50,51]。但是,没有数据可用对大黄素的调节财产感染性肠道微生物群的老鼠。据报道,较低的微生物多样性与各种疾病发病率升高,包括败血症(52]。数据从16 srrna也表明,α和β多样性明显减少感染性老鼠,可部分恢复了大黄素治疗。最近的研究报告说,肠道微生态学在危重病人显示显著的改变,它的特点是增加的机会变形菌门和减少共生的厚壁菌门和拟杆菌门(53,54]。的作用变形菌门,包括沙门氏菌,大肠杆菌,幽门螺杆菌是非常小的动物以及人类的健康。然而,它的规模增加肠道感染或结直肠癌患者。在感染性老鼠,变形菌门有更高的几率群落结构与对照组相比。这可能是由于消除能力受损,在败血症病原菌。大黄素治疗明显减少的数量变形菌门,这可能是重要的保护宿主免受病原体的机会。厚壁菌门和拟杆菌门是两个重要的细菌类群在宿主体内参与代谢的调节和维持能量平衡。维护他们的富足是很有价值的败血症的患者的生存及预后(55,56]。减少大量的厚壁菌门和拟杆菌门在脓毒性小鼠,进而被大黄素治疗恢复。这表明潜在的监管影响能量代谢的障碍。不同于严格的厌氧菌,这被认为是必不可少的保护对外源微生物和防止细菌易位,兼性细菌等厌氧菌肠杆菌科和Bacteroideae促进脓毒症的发展(57- - - - - -59]。大黄素抑制大量的兼性厌氧菌,增加感染性老鼠。同时,大黄素在生物膜形成潜在的抑制影响,占超过80%的微生物感染人体,为脓毒症的临床治疗,因为创造困难的高阻抗菌药物(60,61年]。除此之外,我们发现大黄素降低了大量的细菌,包含移动元素,具备更高的能力抵御外部压力和宿主免疫系统。以上数据说明,除了调制的炎症反应和保护屏障的完整性,大黄素调节肠道菌群,脓毒症的治疗中。
5。结论
总之,大黄素直接JNK2结合,一方面,抑制NF -κB诱导炎性损伤和过度,另一方面,维护肠道屏障的完整性通过促进AP-1 TJ功能参与感染性老鼠。此外,大黄素展品监管对肠道菌群的影响可能是由于增加物种多样性和减少流明的潜在致病性细菌。这项工作说明大黄素的药理作用在保护肠上皮屏障功能,从而防止继发性细菌易位和败血性感染小鼠,治疗脓毒症和提供更多的证据。
缩写
| JNK2: | C-Jun n端激酶2 |
| NF -κB: | 核factor-kappaB |
| AP-1: | 激活蛋白1 |
| 中电控股: | 盲肠的结扎和穿刺 |
| TARC: | 胸腺和activation-regulated趋化因子 |
| gm - csf: | 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 |
| IL: | 白介素 |
| 肿瘤坏死因子: | 肿瘤坏死因子 |
| 干扰素: | 干扰素 |
| ZO-1: | Zonula occludens-1 |
| SIRT1: | Sirtuin蛋白1 |
| mln: | 肠系膜淋巴结 |
| Cy3-SA: | Cy3-conjugated链霉亲和素 |
| 信噪比: | 信号噪声比 |
| 套: | 紧密连接。 |
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
伦理批准
程序上执行所有动物进行按照美国国立卫生研究院的指导方针在实验室研究和动物保健和使用委员会批准的北京中医学院(许可证号码:2019020201)。
的利益冲突
所有作者宣称他们没有利益冲突。
作者的贡献
枭龙徐和清泉刘设计研究。郭散热和Jingxia赵完成实验质量控制。枭龙,米娜,博丽安,鲁伊·张,沙沙村,他Yunjing呗,宁王,王阎林,Xuerui进行实验和分析数据。枭龙徐、张米娜博丽安写的手稿。张米娜和波丽安了同样的工作。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(格兰特数字81973608,81973608),国家重大科技项目拨款2017号zx10305501,特殊项目中国科技部授予2020号yfc0841600,和北京自然科学基金(批准号7192083)。
补充材料
表S1。细胞因子微阵列与40个因素。表S2。磷酸化蛋白质微阵列与17个。图S1。世行在图的量化3(一个)。数据代表了 三个独立实验的平均值之间的差异被单向方差分析评估。 和 显示显著差异与中电集团。图S2。大黄素的抑制作用在脓毒性小鼠氧化应激。数据代表了 三个独立实验的平均值之间的差异被单向方差分析评估。 表示与对照组相比显著差异。图S3。JNK2 SPR检测和大黄素的组合。图S4。均方根偏差(RMSD)的模拟。横坐标表示时间,纵坐标代表表示的特定值。图S5。世行在图的量化5 (c)。(补充材料)