文摘

神经炎症中起主导作用的进展术后认知功能障碍(POCD)。维生素D是已知炎症和免疫反应的重要监管职能。nod样受体蛋白3 (NLRP3)是一个重要的inflammasome可以激活炎症反应及麻醉和手术。在这项研究中,雄性C57BL / 6小鼠年龄在14 - 16个月给出VD3连续14天前有一个开放的胫骨骨折手术。动物要么牺牲获得海马体在莫里斯水迷宫测试或测试。免疫印迹是用来估计NLRP3的水平,ASC, caspase-1,用于识别小胶质激活免疫组织化学,酶联免疫吸附试验是用来测量地震和il - 1的表达β使用对应的分析工具来评估,而ROS、MDA水平反映了氧化应激状态。我们发现VD3预处理显著提高surgery-induced记忆和认知障碍的年长老鼠,这是与失活的NLRP3 inflammasome和神经炎症的抑制作用。这一发现为临床提供了新颖的预防性策略减少老年手术患者术后认知障碍。这项研究有一些局限性。性别差异的影响VD3并不认为,只有雄性老鼠。此外,VD3被作为预防措施;然而,尚不清楚是否有POCD小鼠的疗效。这个试验是注册chictr -中华民国17010610。

1。介绍

术后认知功能障碍(POCD)是一种临床患者的麻醉和手术后发生的条件,特别是在老年人(1]。临床研究提供的证据表明,POCD可能与死亡率增加,贫困的生活质量,延长住院治疗(1,2]。然而,POCD的病理生理学仍然是未知的。

维生素D缺乏已经成为一个全球性的公共卫生问题,尤其对老年人(3,4]。有有限的调查对维生素D水平之间的联系和POCD的老年病人。最近的一项前瞻性群组研究发现,缺乏维生素D会增加神经认知障碍的老年人的风险在围手术期期间,大概是因为低维生素D水平不能有效防止术后氧化应激增加(5]。此外,补充维生素D的活性代谢物1,25-dihydroxy维生素D3 (1,25 (OH)2骨化三醇,D3 VD3)提供保护作用在动物模型的有限合伙人的记忆和学习,七氟醚anesthesia-induced肝切除术,认知功能障碍(6- - - - - -8]。因此,维生素D可能作为一种潜在的治疗开发POCD;然而,可能的机制目前还不清楚。

越来越多的证据从临床和实验研究表明,POCD是由neuroinflammation-related促炎细胞因子(9]。NLR pyrin domain-containing 3 (NLRP3)激活最近被广泛地探讨和[与神经炎症9- - - - - -12]。NLRP3组装NLRP3 multiprotein复杂(inflammasome)组成,凋亡和speck-like蛋白质包含半胱天冬酶招聘领域(ASC)和caspase-113]。激活inflammasomes可以促进生产和释放促炎细胞因子il - 1等β和地震。大量研究表明,VD3抑制了NLRP3 inflammasome,防止各种炎症性疾病。段et al。14)发现VD3针对维生素D受体阻止chondrogenic通过调节巨噬细胞细胞外基质降解NLRP3激活和炎症细胞因子的分泌,从而减轻骨关节炎。董et al。15)发现VD3改善氮mustard-induced皮肤炎症通过灭活NLRP3 inflammasome。

基于上述证据,本研究旨在确定VD3减毒surgery-induced认知障碍通过调节海马神经炎症的失活NLRP3 inflammasome。

2。材料和方法

2.1。动物

14 - 16岁雄性C57BL / 6个月从北京购买重要河流实验动物科技(中国)。老鼠被安置在特定无菌条件(环境温度, ,和湿度40%)在饲养和实验。食物和水随意。所有实验过程涉及动物是动物保健和使用委员会批准后,宁波大学的实验室动物保健和使用指南由美国国立卫生研究院。

老鼠被随机分配到四组之一:控制”(体质)、“手术(sur),手术+ VD3(苏尔+ VD3)和手术+车辆(苏尔+阿明费)。一半的每组动物进行行为测试而另一半牺牲术后24小时内分子检测行为的潜在干扰最小化测试炎症标记物(图1)。


图1
实验设计。微波加工:莫里斯水迷宫。
2.2。手术创伤

我们执行开放胫骨骨折手术如前所述[16- - - - - -18]。左后爪子刮,消毒,切开剥离骨膜,和一个截骨术。这时,一个0.38毫米销插入髓内管。这个骨折固定后,伤口与聚乙烯吡咯酮碘灌溉,4/0缝线缝合的皮肤缝合。

建立了麻醉剂利用密封室给3 - 5%七氟醚和100%的氧气,紧随其后的是一只老鼠麻醉面罩附在动物麻醉设备维护2 - 3% sevoflurane-O2 (R500SE RWD生命科学,深圳,中国)。

2.3。莫里斯水迷宫(微波加工)

水循环水箱周围视觉线索,分为4个象限,与一个平台目标象限中水面以下。收购开始在术后第三天,探针进行了探索性试验在术后一天6。在收购期间,审判是终止当老鼠到达平台,在那里,他们可以停留15秒。动物是手动走上平台,保持15秒60秒内如果不能找到平台。在探测试验,平台删除,搜索行为又跟踪了。视频跟踪系统是用于分析移动路径和所需的时间来定位象限或隐藏逃避平台(EthoVision XT, Noldus仪器、瓦赫宁根、荷兰)。

2.4。治疗VD3

动物被注射VD3 (Sigma-Aldrich有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)腹腔手术前14天开始每天体重(VD3剂量:2.5 ng / g)。无菌玉米油作为车辆VD3解决方案(8]。

当老鼠牺牲,0.5毫升的血液收集,站了30分钟后,这是离心机在3000 r / min在4°C 20分钟,和上层的血清收集检测VD的内容由ELISA (25 (OH) D)。

2.5。西方墨点法

海马体中收集和均质裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂(美国卡尔斯巴德热科学)。样本10% sds - page凝胶分离和转移到PVDF膜(0.22μm;美国微孔,泰梅库拉,CA)。5%脱脂奶粉的膜被Tris-buffered盐水然后孵化隔夜NLRP3 (1: 1000;美国CST), ASC (1: 1000;美国CST), caspase-1 p20(1: 500年,圣克鲁斯,CA),和GAPDH (1: 5000;Proteintech,中国)。洗后,膜与800年孵化CW山羊anti-rabbit IgG抗体(LI-COR 1: 15000年,内布拉斯加、美国)或800 CW山羊anti-mouse IgG抗体(LI-COR 1: 15000年,内布拉斯加、美国)60分钟。目标乐队与荧光扫描仪显示(奥德赛红外成像系统,LI-COR生物、NE、美国)。量化的乐队,西方墨迹图进行了分析使用ImageJ分析软件(美国国家卫生研究院)。蛋白质蛋白质带卷进行了评估,并带值被GAPDH标准化值相同的样本。

2.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)

七氟醚在被斩首的小鼠麻醉,大脑很快被移除和解剖收集海马体。Interleukin-1β(ExCell生物、太仓、中国)和interleukin-18(研发系统,明尼阿波利斯,美国)后用ELISA测定样品与冷生理盐水冲洗。所有试剂的制备、工作标准和协议之后根据制造商的指示。

2.7。免疫组织化学

麻醉后,老鼠transcardially灌注生理盐水其次是4%多聚甲醛(PFA)。当时大脑解剖,固定4% PFA在一夜之间,连续孵化24小时分别在15%和30%蔗糖的解决方案。大脑被冻结在一个最佳的切削温度复合,切成25μ米厚的部分(CM1950、徕卡、法兰克福,德国)。一夜之间,部分包含海马体被孵化在4°C 0.1 PBS缓冲含有0.5% Triton x - 100和山羊anti-ionized钙结合适配器分子1 (Iba-1, 1: 500;美国剑桥Abcam)。之后,部分在PBS溶液洗了三次,然后孵化90分钟在同一PBS溶液在室温下包含Alexa 488 -共轭驴抗体抗体(1:500;美国剑桥Abcam)。三个部分是每只老鼠使用共焦激光扫描显微镜成像(SP8、徕卡、法兰克福,德国)。Iba-1染色分析蒙蔽的方式使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。每个图像像素的数量和强度高于预定阈值水平被认为是积极的染色。阳性免疫反应性的程度反映了积极染色区域总面积的百分比在成像领域感兴趣的结构。

2.8。氧化应激检测

检测活性氧(ROS)在小鼠的海马,ROS分析工具包(南京建成生物工程研究所、中国)。收集上清液后,蛋白质浓度测定。一百九十毫升的上层清液添加到10公升的2,二乙酸7-dichlorofluorescin,样本孵化37°C 30分钟。结果表示为荧光强度/ 100毫克蛋白在荧光测量(激发波长500 nm和发射波长530 nm)。

丙二醛(MDA)水平测量小鼠的海马中使用一个MDA测定装备。蛋白质量化后,添加适当的试剂是按照制造商的说明创建反应混合物,在100°C,然后加热20分钟之前离心机在3500 g在室温下10分钟。吸光度测量532海里。中给出的数据nanomoles每毫克(nmol /毫克)的蛋白质。

2.9。统计分析

统计分析了使用GraphPad Prism 8.0(美国圣地亚哥GraphPad软件)。所有的数据表示为 (SD)。进行了统计比较使用单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni事后测试。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。VD3治疗改善认知障碍的年龄POCD老鼠

空间记忆是评估使用莫里斯水迷宫测试。胫骨骨折手术导致动物明显不再逃避延迟6天在收购过程中( , ,图2 (b))。外科组相比,老鼠与VD3管理经历了一个减少逃脱延迟( , ,图2 (b))。在调查测试,平台跨越手术组低于对照组( , ,图2 (e)),但它是高VD3-treated老鼠( , ,图2 (e))。此外,VD3-treated老鼠更远的地方,花更多的时间在目标象限( ,3.161, ,数据2 (c)和2 (d))。之间没有显著改变游泳速度组( , ,图2(一个)),证明小鼠胫骨骨折手术有一个运动机能的影响。总的来说,VD3修复手术引起的记忆和学习神经赤字。

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图2
的影响VD3在老年小鼠surgery-induced术后认知障碍。(一)小鼠的游泳速度微波加工测试。(b)逃避延迟在微波加工测试。(c, d)在目标象限时间和距离。数量(e)的平台。数据了 ( 每组)。
3.2。VD3抑制Surgery-Induced NLRP3 Inflammasome激活在老年小鼠的海马

ELISA是用来测量血清25 (OH) D水平。结果表明,接收VD3治疗的小鼠表现出25 (OH) D的浓度大于汽车集团( )(图3)。


图3
手术后血清25 (OH) D的内容。数据了 ( 每组)。

根据我们的调查结果,胫骨骨折手术小鼠海马的NLRP3表达水平高于控制老鼠的 , ,数据4(一)和4 (b))。手术后caspase-1和ASC的水平调节( 和5.144 ,数据4(一),4 (c),4 (d)),由VD3逆转预处理( 和3.861, 和0.01,数据4(一),4 (c),4 (d))。

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图4
表达水平的NLRP3、ASC和caspase-1海马的手术后24小时。免疫印迹(a)和定量结果(罪犯)关于NLRP3的表达,ASC和caspase-1。数据了 ( 每组)。
3.3。在老年小鼠的海马VD3减少术后神经炎症

神经炎症与POCD密切相关。炎性细胞因子检测海马的手术后24小时。地震和il - 1β表达式在海马体增加手术后( 和3.701, ,数据5(一个)和5 (b))。此外,VD3抑制surgery-induced增加的地震和il - 1β海马的表达式( 和4.100, ,数据5(一个)和5 (b))。

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图5
手术后海马神经炎症。地震和il - 1β海马的蛋白表达。数据了 ( 每组)。
3.4。VD3减少老年小鼠的海马术后小胶质激活

由于至关重要的作用,小胶质细胞在中枢神经系统出现的神经炎症疾病,我们试图确定小胶质激活出现在海马体24小时手术后采用免疫染色确定Iba-1小胶质细胞标志。有更多Iba-1-positive CA1区细胞的老鼠在手术治疗组比对照组( , ,图6)。外科组相比,有更少的VD3 Iba-1-positive细胞组( , ,图6)。

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图6
小胶质激活在手术后的海马。(一)免疫染色Iba-1在海马的CA1区。酒吧是25μm。(b)量化Iba-1-positive细胞。数据了 ( 每组)。
3.5。VD3治疗可以防止氧化应激在老年小鼠的海马

根据先前的研究,氧化应激影响海马长期势差,损害认知。我们使用ROS、MDA评估氧化应激的状态。海马体的ROS、MDA水平显著高于手术后24小时控制小鼠相比 和3.759 ,图7),但明显减少VD3预处理( 和3.439, 和0.05,图7)。

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图7
表达水平的(a)和(b) MDA ROS海马体手术后24小时。数据了 ( 每组)。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,VD3预处理显著提高surgery-induced记忆和认知障碍的小鼠岁的失活与NLRP3 inflammasome和神经炎症的抑制作用。

的神经保护、抗炎和抗氧化作用的维生素D已广泛研究在临床前研究中,从而导致维生素D的假设可能作为一种可改变的危险因素的认知下降和神经退行性疾病(19- - - - - -21),包括POCD [5,8,22]。然而,临床前研究的功能VD3 POCD的发展仍然是有限的。在这项研究中,胫骨骨折surgery-based POCD模型,和微波加工试验表明,预处理VD3老年小鼠术后认知下降的显著降低。模型的有限合伙人、肝切除术和七氟醚anesthesia-induced认知功能障碍,保护VD3补充剂的益处在学习和记忆也指出6- - - - - -8]。

在过去的几十年中,14日认知障碍和神经炎症有关。发展的一个主要因素提出了认知障碍的释放促炎细胞因子(18,23,24]。它已经证明了神经炎症反应期间POCD病理生理学的影响变化促炎细胞因子的水平在术后患者的脑脊液。生产过剩的促炎细胞因子活化的小胶质细胞也被证明有助于慢性神经炎症(25,26]。在目前的研究中,它是确定VD3预处理抑制炎性细胞因子的通过测量surgery-induced神经炎症海马体和小胶质细胞的激活。因此,抗炎活性维生素D3可能是一个因素与POCD的防护效益。

维生素D,维生素D2(钙化醇)或是否维生素D3(维生素D3),送到肝脏,人体内25 -羟维生素D转化为(25 (OH) D)。生理活性分子随后转化成1,25-dihydroxy维生素D (1,25 (OH)2D),肾或extrarenal组织(27]。血脑屏障是透水25 (OH) D和1,25 (OH)2d .的1,25 (OH)2D信号来自25 (OH) D 1-alpha-hydroxylase调节大脑活动通过激活维生素D受体神经元和神经胶质细胞28]。通过提高乙酰胆碱合成维生素D改善神经递质失衡和恢复多巴胺神经元的平衡(29日,30.),以及通过减少促炎细胞因子的生产和移植抗炎细胞因子(31日,32]。

的NLRP3 inflammasome是一种胞内multiprotein复杂,先天免疫系统的一部分的炎症通路(33]。它是由一个凋亡speck-like蛋白质与半胱天冬酶招聘领域,炎症细胞凋亡蛋白酶,和nucleotide-binding寡聚化域受体启动信号级联(33,34]。的NLRP3 inflammasome调节caspase-1激活控制着成熟和il - 1的分泌β和地震。生产过剩的il - 1β地震会导致慢性炎症性疾病,包括POCD [9,10]。在临床前模型,通过灭活NLRP3 inflammasome VD3可以减弱骨关节炎,牙周炎,和皮肤炎症15,35,36]。这项研究表明,NLRP3 inflammasome是调节在老年小鼠的海马胫骨骨折手术后,这一过程被VD3预处理抑制。这一发现表明,压制NLRP3 inflammasome可能与保护VD3相关认知功能和神经炎症的消除。

根据这项研究,预处理VD3显著降低ROS、MDA表达式的upregulation手术创伤引起的海马。最近的研究表明,活性氧与术后认知障碍37]。生产过剩的活性氧(ROS)是一个重要的上游事件可以激活NLRP3炎症(38]。此外,VD3可以减弱氧化stress-mediated炎症通过灭活NLRP3 inflammasome [39]。因此,VD3能够具有抗神经炎性反应的特征可能归因于NLRP3通道的失活,这是由氧化应激。但还需要进一步研究,以完全理解这一假设。

尽管NLRP3 inflammasome正在有针对性的治疗方法治疗POCD的,NLRP3 inflammasome抑制剂不被用于临床10]。根据这项研究,通过抑制NLRP3 VD3补充剂可以减轻POCD的症状,提供一个替代NLRP3 inflammasome-based POCD的治疗策略。的用量VD3受雇于本研究是基于以前的研究(8,进一步的研究是必要的,以确定治疗POCD的理想剂量。

饮食不足的模型被广泛用于研究的行为后果改变维生素D信号在大脑发育。饮食不足模型似乎有更大的建构效度,但他们劳动,和长时间的和他们解释结果的能力有时约束(40]。在这项研究中,年龄在老鼠因此补充VD3手术前两周内。

由于其极低的水平,缺乏定量的方法,可以确定picomolar,脑组织的维生素D含量可能很难检测到。血清分析是最基本的方法,检测维生素D代谢产物。25 (OH) D的浓度,现在被认为是最丰富的形式在血清维生素D,可能正确地代表了维生素D水平(41]。

它已经表明,神经炎症反应峰值手术后24小时(16,17,42]。因此,手术后24小时的时间点选择评估神经炎症变量。排除任何可能干扰行为测试的炎症标记物,一半的动物在每组牺牲手术后24小时ELISA和免疫染色。

本研究有一定的局限性:首先,NLRP3没有探索的上游和下游机制;第二,只有雄性老鼠被使用,和性别差异的影响VD3没有考虑;第三,VD3预防性管理;无论是对POCD小鼠有治疗效果尚不清楚。基于本研究的发现,药物的预防性和治疗性使用可以随着研究VD3的一剂良药。这也是值得调查各种管理技术。总之,我们的研究表明,海马炎症和NLRP3 inflammasome激活与胫骨骨折surgery-induced在老年小鼠认知障碍,可以通过与VD3 presupplementing减轻。这一发现为临床提供了新颖的预防性策略减少老年患者术后认知障碍。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

信息披露

我们声明,投资者没有参与协议设计、收集、分析和解释数据,要么写的手稿。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

司法院J和XH设计研究和写的手稿。司法院J,低频年代,XH进行了实验。XG和SH Y分析数据。所有作者的文章和批准提交的版本。

确认

这项工作是医学科学研究基金会赠款支持浙江省,中国(2021 zh038和2022480702号)。