文摘

背景。Visfatin是一种已经证明adipocytokine参与心血管疾病。本研究旨在确定visfatin sepsis-induced心肌损伤的作用,确定其可能的机制。方法。visfatin表达的动态变化与脂多糖(LPS)诱导小鼠败血症测量。此外,老鼠用visfatin预处理,进一步管理有限合伙人观察visfatin在心脏损伤的影响。最后,败血性老鼠还使用JSH-23调查是否通过NF - visfatin调节心脏损伤κB p65通路。结果。Visfatin表达水平在心脏和血清中增加LPS-treated老鼠和达到6个小时,和Visfatin源自心脏巨噬细胞。在脓毒性小鼠,预处理visfatin存活率下降,恶化心脏功能障碍,和增加心肌损伤标记物的表达,包括肌酸激酶心肌绑定(水平)和乳酸脱氢酶(LDH)。治疗visfatin也增加了CD3 +细胞和F4/80 +细胞的渗透,放大心脏炎症反应,提高心肌细胞凋亡。治疗JSH-23逆转visfatin在脓毒性小鼠的影响。结论。本研究表明,visfatin放大了心脏炎症反应通过p65信号通路和加剧心脏损伤。Visfatin可能是临床预防败血症心脏损伤的目标。

1。介绍

脓毒症是一种全身性炎症综合征引起的感染,患者得不到及时治疗可以进步多器官功能衰竭(1,2]。在感染性并发症观察病人,心脏损伤和随后的心脏功能障碍最严重,死亡率非常高,可以达到90%3]。因此,它有利于发现新的干预方法来改善心脏损伤和心脏功能障碍治疗脓毒症患者。

Visfatin,这被认为是一个分泌adipokine,并在2005年首次被发现,随后隔离,可以表示在许多哺乳动物的组织和器官4]。Visfatin公布的主要是脂肪细胞、巨噬细胞和骨骼肌细胞通过内质网或微泡(4,5]。各种病理条件,包括老化、氧化应激、高脂肪饮食和炎症反应,可以促进visfatin的释放,和巨噬细胞的主要来源visfatin炎症环境中(6- - - - - -9]。

先前的研究还表明,visfatin与心血管疾病密切相关。Downregulation visfatin表达式可以显著改善内皮功能障碍和抑制炎症反应,从而减少主动脉斑块面积ApoE - / -小鼠,而治疗外源性visfatin加重炎症反应,促进了动脉粥样硬化的进展10- - - - - -12]。循环水平的visfatin增加急性心肌梗塞患者,和高架visfatin表达建议的主要不良心血管事件发生率更高(13]。此外,visfatin难治性高血压患者中高度表达,其表达水平与左心室肥厚的严重程度呈正相关(14]。然而,在sepsis-induced visfatin心脏损伤的作用仍然是未知的。在这项研究中,visfatin在心脏损伤的作用和可能机制研究在败血症的老鼠。

2。方法和材料

2.1。老鼠和老鼠败血症模型

野生型雄性C57BL / 6 J小鼠(WT、GemPharmatech、中国)年龄在9 - 10周被用于这项研究。首先,WT小鼠腹腔内(IP)注射脂多糖(LPS, 10毫克/公斤,σ)或生理盐水和visfatin表达在不同的时间点和样品测定。第二,WT老鼠用PBS预处理或visfatin (100μ克/公斤,Adipo生物科学)30分钟15)然后IP使用有限合伙人或生理盐水注射6小时;心脏损伤的影响在每组中发现。上面的一些老鼠观察了8天,和死亡率都被记录下来。最后,他们用PBS预处理+ JSH-23(3毫克/公斤)16],visfatin + JSH-23 DMSO + PBS,或DMSO + visfatin 30分钟,然后所有老鼠收到有限合伙人为6小时。一些老鼠8天随访观察生存率。

老鼠安乐死结束时治疗,然后分别收集血液和心脏。血样后得到的上层清液离心机 15分钟并存储在液态氮。心脏样本分成两部分,存储在4%多聚甲醛在液态氮。本研究机构动物保健和使用委员会批准的医院(批准号心脏20200123 a)。

2.2。检测心脏功能

超声心动图和血液动力学被用来评估每个老鼠的心脏功能。老鼠IP注射LPS或生理盐水后6小时,他们用1.5%异氟烷麻醉,然后平放在手术台上。超声心动图与10 mhz线性阵列超声波传感器,包括MyLab 30简历超声波系统(Esaote SpA、意大利)被用来获取信息在左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期直径(LVESD),左心室射血分数(LVEF)和部分缩短(FS)。然后,microtip导管传感器(米勒,Inc .)、美国)插入通过正确的颈动脉,左心室收缩压的和最大斜率值增加(+ dp / dt)和舒张压衰减(−dp / dt)记录使用米勒PressureVolume系统(米勒,Inc .)。

2.3。信使rna表达水平的检测

左心室组织从液态氮,磨成粉,然后用试剂盒提取试剂(罗氏)。总RNA被收集后,浓度是确定,2μ克总RNA被用来合成cDNA使用逆转录工具包(罗氏)根据制造商的指示。然后,cDNA被用来进行PCR扩增480 LightCycler SYBR绿色主人混合(罗氏)来检测目标mrna的表达水平,包括visfatin,单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α),干扰素-γ(IFN -γ),il - 1β、il - 6、il - 12、IL-17和地震,在每组;测量目标mRNA的表达水平和规范化GAPDH mRNA水平。表中列出使用的引物1。

表1
引物用于这项研究。
2.4。分析NF -κB p65通路磷酸化

左心室组织细胞溶解使用radioimmunoprecipitation分析裂解缓冲,然后收集上层清液总蛋白。每个样本的浓度测定用BCA蛋白质化验设备(热费希尔科学),然后量化到相同的浓度。然后,大约45μ克总蛋白质被用来执行电泳Laemmli十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶分离不同分子量的蛋白质。后转到Immobilon-FL PVDF膜(微孔),膜被封锁的脱脂牛奶,然后用anti-NF孵化——5%κB p65 anti-NF -κB p65 anti-cleaved caspase3、anti-Bcl2 anti-GAPDH(所有从Abcam购买)抗体在一夜之间在4°C。然后,膜与二次孵化抗体和扫描使用《奥德赛》(LI-COR生物科学)。

2.5。测量Visfatin、心肌损伤标记物和炎性细胞因子

血清总蛋白从左心室收集被稀释;鼠标visfatin酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒用于检测循环和心脏visfatin水平,心肌绑定(水平)和肌酸激酶测定工具和乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒用于检测水平和血清和上层清液LDH表达式。此外,MCP-1的表达水平,TNF -α干扰素-γ,il - 1β、il - 6、il - 12、IL-17和地震在血清中也使用ELISA试剂盒检测。所有试验程序进行按照制造商的指示。

2.6。组织学分析

心脏组织和4%多聚甲醛固定了两天,嵌入在石蜡,切成4 - 6μ米部分,进一步安装在幻灯片。幻灯片与鼠标anti-visfatin孵化、鼠标anti-CD3和anti-CD68抗体(美国三个从GeneTex购买)来确定心脏大量visfatin, T淋巴细胞和巨噬细胞。有些幻灯片孵化anti-visfatin和anti-F4/80确定visfatin是否由心脏巨噬细胞分泌抗体。心肌细胞凋亡测定使用终端原位dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色试剂盒(美国微孔)根据制造商的指示。

2.7。数据分析

在这项研究中表示的数据 ,并使用GraphPad棱镜7所有数据进行了分析。学生的 - - - - - -执行测试分析手段的差异2组,和单向和双向方差分析是用来评估差异3或更多组。存活率在使用生存率较密集跟进分析。 5被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Visfatin水平增加感染性老鼠

ELISA结果显示,与生理盐水组相比,治疗有限合伙人血清visfatin水平增加了1小时;visfatin水平继续提高在3小时,6小时达到高峰,然后逐渐下降了9小时12(图1(一))。类似的趋势在心脏visfatin mRNA水平观察(图1 (b))。免疫荧光染色的数据还显示,治疗与LPS 6小时显著增加visfatin表达式在心脏巨噬细胞(数字1 (c)和1 (d))。

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图1
表达式的visfatin感染性老鼠。(a和b) visfatin水平动态变化在小鼠血清和心脏检测LPS-induced败血症。(c)心脏visfatin表达式中检测出盐水,LPS-treated老鼠(200×)。(d) Visfatin表达心脏发现巨噬细胞(200×)。 在每一个组。 与生理盐水组。# 与前一组。
3.2。Visfatin加剧LPS-Induced心脏损伤的老鼠

在密集跟进,预处理visfatin显著增加小鼠的死亡率与LPS-induced败血症(图2(一个))。Visfatin展出的表达水平增加LPS-treated小鼠血清和心脏(数字2 (b)和2 (c))。此外,脓毒性小鼠接受visfatin出现心脏功能障碍的恶化,进一步增加LVESD和LVEF的进一步减少,FS, + dp / dt,−dp / dt,尽管没有影响LVEDD观察(数字2 (d)- - - - - -2 (f))。

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图2
在老鼠身上visfatin对LPS-induced心脏损伤的影响。(一)四组的生存率进行分析在跟进; 在每一个组。(b和c)水平的表达水平和LDH在血清和心脏检查。(d-f) LVEDD, LVESD、LVEF、FS, + dp / dt max,−dp / dt马克斯在每组被检测到。 在每一个组。 与生理盐水+ PBS组。# 与有限合伙人+ PBS组。SL意味着生理盐水;音频电报visfatin手段。
3.3。Visfatin放大心脏炎症LPS-Treated老鼠

免疫荧光染色显示,CD3 +细胞的渗透和CD68 +细胞心脏明显增加(图3(一个))。此外,mRNA和蛋白表达水平的炎症相关的因素,包括MCP-1, TNF -α干扰素-γ,il - 1β、il - 6、il - 12、IL-17和地震,在心脏和血清被LPS-treated visfatin治疗显著增加小鼠(图3 (b))。Visfatin也进一步提升NF -κB p65通路引起的磷酸化有限合伙人(图3 (c))。

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图3
visfatin对心脏的影响炎症LPS-treated老鼠。(一)心脏CD3 +细胞和CD68 +细胞在四组检查。(b)的表达MCP-1, TNF -α干扰素-γ,il - 1β、il - 6、il - 12、IL-17和地震在心脏和血清检测。(c)的激活NF -κB p65通道测量。 在每一个组。 与生理盐水+ PBS组。# 与有限合伙人+ PBS组。
3.4。治疗Visfatin增加LPS-Induced在小鼠心肌细胞凋亡

心脏的表达裂解caspase3 proapoptotic蛋白质,增加在visfatin-pretreated脓毒性小鼠与脓毒性小鼠相比,虽然proapoptotic蛋白的表达Bcl2降低(图4(一))。Visfatin进一步TUNEL-positive LPS-treated小鼠细胞的比例增加,这表明凋亡心肌细胞(图4 (b))。

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图4
老鼠visfatin对LPS-induced心肌细胞凋亡的影响。(a)的表达裂解caspase3、Bcl2 apoptosis-related蛋白质,被检测到。(b) TUNEL-positive细胞检查。 在每组6。 与生理盐水+ PBS组。# 与有限合伙人+ PBS组。音频电报visfatin手段。
3.5。抑制NF -κB p65途径改善心脏功能障碍Visfatin-Treated感染性老鼠

visfatin-treated感染性小鼠的死亡率显著降低由JSH-23 NF -的抑制剂κ(图B p65途径5(一个))。visfatin-mediated增加心肌损伤标记,包括水平和LDH,心脏和血清被JSH-23逆转(数字5 (b)和5 (c))。visfatin的影响LPS-induced心脏功能障碍的恶化也显著提高后JSH-23管理局(数字5 (d)- - - - - -5 (f))。

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影响JSH-23在老鼠LPS-induced心脏损伤和功能障碍方面研究。(a)的影响生存率的JSH-23 visfatin-treated感染性老鼠测量, 在每一个组。(b和c)心肌损伤标志物的血清和心脏测量。每组(d-f)心脏结构和功能测定。 在每一个组。 与有限合伙人+ DMSO +音频电报。音频电报visfatin手段。
3.6。JSH-23缓解心脏炎症反应和心肌细胞凋亡

治疗JSH-23减少NF -的激活κ(图B p65通路visfatin-treated败血症的老鼠6(一))。MCP-1的表达水平,TNF -α干扰素-γ,il - 1β、il - 6、il - 12、IL-17和地震都减少心脏和血清治疗感染性鼠JSH-23相比之下,那些没有接受JSH-23(图6 (b))。减少凋亡细胞被观察到当JSH-23管理visfatin-treated感染性老鼠(图6 (c))。

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图6
JSH-23对心脏炎症和心肌细胞凋亡的影响。(一)磷酸化NF -κB p65路径组件被检测到。(b)在心脏和血清炎症介质。(c), TUNEL-positive心肌细胞被量化的数字。 在每一个组。 与有限合伙人+ DMSO +音频电报。

4所示。讨论

作为一种重要的adipokine visfatin已经证明参与多种心血管疾病的过程,而其作用在脓毒症心肌损伤没有被报道。在这项研究中,我们发现visfatin表达升高感染性老鼠,visfatin可能由巨噬细胞分泌的。治疗visfatin加剧心脏炎症和加剧心脏损伤和心脏功能障碍。当NF -这些效果是相反的κB p65 JSH-23通路受到抑制。我们的研究发现,心脏炎症通过NF - visfatin可能放大κB p65通路和加剧LPS-induced心脏损伤。Visfatin可能是一个潜在的目标在脓毒症心肌损伤的预防诊所。

有限合伙人是一种重要的致病因子在脓毒症可引起多种组织和器官,损害及其过程可以由visfatin监管。姚等人报道,免疫细胞浸润和脾细胞凋亡显著增加后有限合伙人管理但visfapin治疗后进一步加重(17]。肖等人发现visfatin进一步加剧LPS-mediated牙周损伤,加重牙周炎症状和影响预后18]。此外,治疗visfatin会加重LPS-induced肠道损伤的大鼠和小鼠(19,20.]。这些研究表明,visfatin可能加剧LPS-induced组织损伤。在另一项研究中,罗等人报道,意外visfatin治疗缓解LPS-induced急性肺损伤(15]。结果不一致的原因可能与不同的器官。在这项研究中,我们调查了监管visfatin对感染性心脏损伤的影响,发现visfatin进一步增加了小鼠的死亡率,调节心肌损伤的标志的表达在血清和心脏,和恶化心脏功能障碍。这些结果表明,visfatin加剧LPS-induced心脏损伤。

各种病理效应,如炎症反应、氧化应激、钙超载、和ferroptosis参与LPS-induced组织损伤的发展(1,21]。由于穷人宽容心肌细胞的炎症反应,增强炎症反应可以激活心肌细胞的程序性死亡机制,包括caspase-dependent和caspase-independent通路,导致心肌细胞死亡和心脏功能障碍(1]。因此,炎症在sepsis-induced心脏损伤中扮演着关键角色。Visfatin可导致胰岛素抵抗,从而导致糖尿病的恶化,影响脂质代谢,这是与肥胖的发展和相关免疫细胞的侵入组织,导致增加炎症反应(15,20.,22]。它已被广泛报道,visfatin参与sepsis-induced组织损伤通过调节炎症反应(1,20.- - - - - -22]。先前的研究已经发现,肝星状细胞的激活和乳腺癌的监管由visfatin由巨噬细胞(23,24]。减少visfatin表达式可以显著降低T淋巴细胞激活,从而提高脊髓损伤和减少伤残率(25]。在风湿性疾病,visfatin会加重Th1 / Th2平衡,从而促进疾病进展和关节损伤(26]。这些研究表明巨噬细胞和T淋巴细胞的下游信号visfatin和协调监管visfatin对炎症反应的影响。因此,解释的机制在LPS-treated visfatin调节心脏损伤小鼠,炎症的调控visfatin测量。炎症细胞的浸润心脏第一次被检测到,和结果表明,表达CD3 + T淋巴细胞和F4/80 +巨噬细胞显著增加。炎症介质水平的进一步研究,我们发现治疗visfatin进一步增加多种促炎因子的表达。这些结果表明,visfatin参与sepsis-induced心脏损伤的调节通过调节炎性反应。

NF -κB p65是一种重要的核转录因子,细胞内磷酸化激活模式,主要参与免疫反应,应激反应和调节细胞凋亡等生物学效应。越来越多的研究证实,NF -κB p65可以调节渗透和各种免疫细胞的分化,包括巨噬细胞和淋巴细胞,组织和放大炎症反应参与组织损伤的规定。

越来越多的研究证实,visfatin NF -密切相关κB p65信号通路。在先前的研究中,王等人发现激活的NF -κB p65信号通路释放il - 6和促进转移的骨肉瘤细胞(27]。神田等人报道,NF -的磷酸化κB p65信号可能调解科学家的释放趋化因子配体8 (CXCL8) CXCL10,和CXCL20 visfatin的存在,这是与表皮形成(28]。减少visfatin表达下调NF -的激活κB p65途径,细胞侵袭性显著降低(29日]。此外,政府的NF - visfatin也进一步激活κB p65 LPS-treated小鼠和细胞信号通路(30.,31日]。这些研究表明NF -κB p65通路可能是一个重要的下游信号的visfatin和NF -κB p65通路可能调节LPS-induced心脏损伤和心脏功能障碍。

确认上述猜测,小分子化合物JSH-23,特定抑制剂的NF -κB p65信号通路,据报道在以前的研究中,是管理visfatin-treated感染性老鼠。结果表明,治疗JSH-23显著降低死亡率在脓毒性小鼠使用visfatin密集跟进。此外,心肌损伤标记物的表达水平和心脏功能障碍也逆转了小鼠JSH-23对待。这些结果表明,JSH-23逆转的监管效果visfatin LPS引起的心肌损伤和心脏功能障碍。与此同时,NF -磷酸化水平κB p65下降;炎症标记物的水平在心脏和血清明显减少,心肌细胞凋亡是缓解,这表明JSH-23改善心脏炎症反应和心肌细胞凋亡。这些结果表明,监管visfatin对sepsis-induced心脏损伤和心脏功能障碍的影响是由NF -κB p65通路。NF -κB p65通路已经被报道在炎症反应的调节起着重要的作用,及其激活可以促进多种促炎因子的释放。因此,各种心脏损伤相关的表达促炎因子,包括MCP-1, TNF -α干扰素-γ,il - 1β、il - 6、il - 12、IL-17和地震,被检测到;结果表明,治疗visfatin furthere LPS-induced感染性老鼠,这些细胞因子表达增加,这些影响被JSH-23废除。这些结果表明,visfatin可能参与调节炎症反应的NF -κB p65通路。

总之,我们发现visfatin可能进一步激活NF -κB p65通路放大炎症反应,促进心肌细胞凋亡,加重心脏损伤和心脏功能障碍。Visfatin可能是一个潜在的目标干预sepsis-induced心脏损伤。

数据可用性

我们的数据可用科研人员除了商业目的。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突。

作者的贡献

Yewen胡锦涛和南吴的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的科技计划的资金在浙江省医疗卫生(批准号2021 ky1002);宁波的自然科学基金(批准号2021 j266);宁波省公共福利项目(批准号20211 jcgy020364);动脉粥样硬化疾病的精密医学重点实验室浙江省(批准号2022 e10026);中国的国家自然科学基金(批准号81900441);浙江省自然科学基金(批准号LQ19H020002)。