文摘

背景和目的。椎间盘变性(IDD)密切相关,背部疼痛。发现生物标志物IDD非常有利于维护椎间盘的功能,减少背部疼痛的发生。本研究旨在探讨IDD的生物标志物,探索免疫细胞浸润在IDD的角色。方法。GSE56081的数据集和GSE63492基因表达综合(GEO)数据库中用于筛选和分析,和关键基因标记被GSE34095和GSE126883验证。最后,免疫细胞的渗透MCPcounter分析的数据分析包。结果。在这项研究中,一个包含15 lncRNAs,电抗器,9 microrna, 103年mrna构造。multimodel筛选和验证后,发现关键基因标记,即ATF2。lncRNA / microrna / mRNA轴还发现了ATF2密切相关,即SNHG5 / mir - 299 - 5 - p / ATF2。在分析免疫渗透,ATF2与T细胞负相关,但与中性白细胞和内皮细胞呈正相关。结论。SNHG5 / mir - 299 - 5 - p / ATF2 IDD可以作为生物标志物,以及免疫细胞的渗透在IDD的病态发展起着重要的作用。此外,IDD的标志,上述轴参与IDD的病态发展还有待进一步探讨。

1。介绍

背部疼痛是一种现代社会中最常见的疼痛。据估计,95%的人偶尔会背痛或很长一段时间在他们的生活中1]。延长背部疼痛不仅会给患者带来严重的经济负担,还会导致严重的精神压力,甚至自杀倾向(2]。背部疼痛椎间盘退化密切相关(IDD) [3]。由于椎间盘变性,会有病变,如坐骨神经痛,椎间盘突出/脱垂,脊髓狭窄,会导致背部疼痛从颈椎到尾椎骨(4]。因此,它具有重要意义理解IDD的机理和减缓IDD的可能过程减少背部疼痛。目前,IDD的诊断仍是主要根据临床表现和影像学信息当症状出现时,也没有很大的进步在早期诊断5]。缺乏早期诊断标记物可能会影响患者的早期干预。因此,寻找早期生物标志物IDD不仅可以更好的维护病人的椎间盘的生物功能,也减少背部疼痛的可能发生的概率,具有重要的临床意义。

目前,IDD的机制仍不清楚,研究人员提出了多种理论来探索其发生和发展的原因(6]。一些研究人员指出,椎间盘的退化可能与物理力量,和日常的长期压力会导致阀瓣逐渐“失去水,”最终导致变性(7]。其他研究认为IDD激素调控密切相关,尤其是更年期女性雌激素水平的下降可能导致IDD的发生(8]。除了上面的研究中,一些研究人员相信IDD的发生和发展是与免疫细胞浸润密切相关。研究表明,IDD T细胞的激活密切相关(9]。T细胞可以参与炎性反应IDD的高度表达γ干扰素(IFN -γ)[10,11]。同时,干扰素-γ还参与激活的巨噬细胞的炎症反应IDD,共同影响IDD的免疫微环境(12]。此外,有证据表明,免疫反应参与IDD可能与髓核。由于阀瓣结构,中间的髓核从免疫循环系统是孤立的13]。同时,髓核细胞释放Fas配体(FasL)肿瘤坏死因子破坏免疫细胞浸润和维护免疫隔离(14,15]。在IDD,髓核细胞将减少FasL的释放,和髓核细胞也会暴露于免疫循环系统,刺激免疫系统释放大量的T细胞和B细胞,从而破坏椎间盘的平衡免疫微环境,和导致炎症级联反应的发生16]。因此,探索具有重要意义的角色IDD关键标记免疫渗透和免疫微环境的变化从免疫细胞渗透的角度揭示IDD的机制。同时,它是很有价值的在临床实践中积极探索可能的干预IDD基于上述机制的途径。MCPCounter (MCP)是用来估计tissue-infiltrating免疫细胞的数量和其他基质细胞(17]。MCP首次免疫渗透(用于癌症相关的分析18),现在越来越多的研究人员应用在其他几种nontumor炎症反应的研究19]。

为了提高研究结果的可靠性,编码RNA和非编码RNA的数据相同的样本集进行了分析,从基因表达数据库综合(GEO)估计在这个研究。关键标记基因通过基因表达差异分析、龙头、网络建设、随机森林(RF)机器学习模型筛选,和接受者操作特征曲线(ROC)验证。同时,MCP免疫渗透数据库被用来分析和总结免疫细胞浸润的程度在目标数据集,并进行了相关分析结合之前验证标记,以便构建关键生物标记可能会影响IDD的免疫微环境,并指出了方向IDD的免疫机制的进一步探索。

2。方法

2.1。数据源

在这项研究中,公共数据集GSE56081 [20.]和GSE63492 [21)在地理数据库中被用作训练集的估计和分析,和数据集GSE34095 GSE126883 [22)被用作验证将验证结果。

2.2。数据预处理

的 (V4.0.4)软件(https://www.r-project.org/)是用于数据预处理,包括缺失值完成、修正,归一化等步骤。

2.3。分析差异表达基因(度)

limma分析包(23)是用于分析lncRNAs的表达,microrna,和mrna的数据集,以屏幕DElncRNAs, DEmiRNAs, DEmRNAs。火山的地图来显示生成的微分表达式度(DElncRNAs, DEmiRNAs, DEmRNAs)。度与 和 被认为是具有统计学意义。

2.4。筛查lncRNA的胞内定位

内生竞争力lncRNAs主要是在细胞质中表达的影响。lncRNAs位于核只有在使用在线数据库lncATLAS[被排除在外24]。

2.5。lncRNA目标预测microrna的

母星(25在线数据库是用来预测microrna能绑定到lncRNAs和交叉DEmiRNAs获得hubmiRNAs,包括在接下来的分析。

2.6。microrna的目标预测mRNA

母星(25]和TargetScan [26在线数据库是用来预测可能绑定到mrna hubmiRNAs和交叉DEmRNAs获得hubmRNAs,包括在接下来的分析。

2.7。龙头、建设网络

hublncRNAs之间的绑定关系,hubmiRNAs hubmRNAs分析上面的步骤被用来构建龙头、网络,由Cytoscape提出软件(27]。

2.8。功能富集分析

在线数据库大卫(https://david.ncifcrf.gov)[28)是用于基因本体论(去)浓缩基因和基因组的分析和京都百科全书(KEGG)富集分析hubmRNAs电抗器。结果与 被认为是重要的浓缩。GOplot分析包(29日)是用来画GOCircle情节浓缩分析结果,和在线网站生物信息学(http://www.bioinformatics.com.cn)被用来画的GOBubble阴谋KEGG浓缩分析结果。

2.9。射频模型的筛选

随机森林分析包(30.机器学习)是用于执行射频分析数据集筛选标记的关键。分析的结果与hubmRNAs获得关键基因标记。在线网站Venny (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)被用来画出文氏图。

2.10。关键基因标记验证和ROC验证

生物信息学是用于验证关键基因的表达生产商在验证数据集GSE34095 GSE126883。同时,这个数据集用于ROC分析和ROC曲线。结果与 和 被认为是具有统计学意义。与此同时,电抗器,网络被用来寻找lncRNA ~ microrna ~ mRNA轴相关的关键基因标记。

2.11。相关分析lncRNA / microrna / mRNA轴

corrplot分析包(31日)是用于分析轴的基因之间的相关性。结果与 被认为是具有统计学意义。

2.12。免疫渗滤分析

MCPcounter分析包是用于分析和矩阵估计转录组数据包括在这项研究中,和免疫细胞渗透矩阵数据。corrgram分析包(32)是用于可视化之间的相关性免疫浸润细胞参与了MCP。

2.13。lncRNA / microrna的mRNA轴之间的相关分析和免疫浸润细胞

tidyverse分析包(33)和ggstatsplot分析包(https://CRAN.R-project.org/package=ggstatsplot)被用来分析之间的相关性lncRNA / microrna基因的mRNA轴和免疫细胞浸润。生物信息学是用来画出相关系数图。结果与 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。数据分析过程的结果

在这项研究中,GSE56081和GSE63492数据集进行分析。首先,185 DElncRNAs, 50 DEmiRNAs, 2743 DEmRNAs差异基因筛选(图后得到1);其次,在细胞内定位筛选之后,140 DElncRNAs依然;第三,总共15 hublncRNAs和9 hubmiRNAs被发现受在线数据库预测;第四,总共103 hublncRNAs以上9 hubmiRNAs被发现受在线数据库预测;最后,验证射频模型筛选和民国之后,总共1获得了关键基因标记,即ATF2。同时,lncRNA / microrna的信使rna提取轴键标记也密切相关,即SNHG5 / mir - 299 - 5 - p / ATF2,并包含在最终的分析(图2)。

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图1
度的数据集。(一)火山DElncRNAs地图。绿色代表表达下调DElncRNAs,红色代表调节DElncRNAs。(b)火山DEmiRNAs地图。绿色代表表达下调DEmiRNAs,红色代表调节DEmiRNAs。(c)火山DEmRNAs地图。绿色代表表达下调DEmRNAs,红色代表调节DEmRNAs。
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图2
研究分析的流程图。(一)内容研究的全过程。(b)电抗器,网络建设的过程内容。度:差异表达基因;:基因本体;KEGG:京都基因和基因组的百科全书;射频:随机森林;中华民国:接受者操作特征曲线。
3.2。龙头、网络

总共15 hublncRNAs 9 hubmiRNAs, 103 hubmrnas电抗器中包含网络,其中包括289绑定(图的关系3)。


图3
龙头、网络。蓝色的模块lncRNA,绿色的microrna的模块,和红色的模块是信使rna。
3.3。去和KEGG浓缩分析的结果

去分析的结果表明,hubmRNAs主要是负相关监管RNA聚合酶II启动子的转录,蛋白质分解代谢的过程中,负调节骨化,多细胞生物生长,lamellipodium大会,lipopolysaccharide-mediated信号通路,骨骼系统形态发生,细胞迁移和生物过程的积极调控的蛋白质磷酸化(BP)(图4(一));主要与轴突、核、核浆,核染色质,胞质囊泡膜、胞质囊泡,髓鞘细胞组件(CC)(图4(一));,主要与蛋白结合,蛋白质homodimerization活动,蛋白质heterodimerization活动,β-淀粉样蛋白绑定,绑定相同的蛋白结合,酶分子功能(MF)(图4(一))。这些结果表明,hubmRNAs大多与分解、合成、和转换的蛋白质也参与多个信号通路。KEGG分析的结果表明,p53 hubmRNAs主要是相关信号通路,河马信号通路,雌激素信号通路,蛋白聚糖在癌症(图4 (b))。

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图4
去和KEGG浓缩分析的结果。(一)GOCircle情节浓缩去分析。(b) GOBubble KEGG浓缩分析的阴谋。
3.4。射频模型筛选的结果

总共30前基因通过射频模型分析(图5(一个)),一个关键基因标记与hubmRNAs相交后,获得了即ATF2(图5 (b))。

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图5
射频模型筛选的结果。(一)前30名基因通过射频模型分析。(b)维恩图解hubmRNAs和射频前30名基因之间的十字路口。
3.5。验证关键基因标记和ROC验证的结果

ROC分析结果表明,在GSE34095 ATF2有很好的可预测性和GSE126883 ( )(图6)。

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图6
中华民国验证的结果。(一)ROC曲线ATF2 GSE34095验证数据集。(b) ROC曲线ATF2 GSE126883验证数据集。
3.6。lncRNA / microrna的mRNA轴紧密相关的关键基因标记

lncRNA / microrna的mRNA轴从龙头中提取ATF2密切相关,即SNHG5 / mir - 299 - 5 - p / ATF2。图中显示的结合位点SNHG5 / mir - 299 - 5 - p和mir - 299 - 5 - p / ATF2(图7)。

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图7
结合位点的基因。(一)结合位点SNHG5 / mir - 299 - 5 - p。(b)的结合位点mir - 299 - 5 - p / ATF2。
3.7。相关分析的结果lncRNA / microrna的mRNA轴

相关分析后,结果表明,SNHG5和ATF2负相关,mir - 299 - 5 - p,如图8(一个)和8 (b),之间存在着正相关SNHG5 ATF2,如图8 (c)。

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图8
相关分析结果的基因。(a)之间的负相关SNHG5和mir - 299 - 5 - p。(b)之间的负相关ATF2和mir - 299 - 5 - p。(c) SNHG5和ATF2之间存在正向关系。
3.8。相关性分析结果之间的基因和免疫浸润细胞

相关分析结果表明,T细胞CD8 +骨髓树突状细胞呈正相关,但与癌症相关的纤维母细胞负相关。单核细胞巨噬细胞/单核细胞呈正相关;髓系树突状细胞与中性粒细胞负相关,内皮细胞,与癌症相关的成纤维细胞;中性白细胞与内皮细胞和癌症相关的纤维母细胞呈正相关;内皮细胞呈正相关,癌症相关的成纤维细胞(图9(一个))。ATF2呈正相关,嗜中性粒细胞( , ),内皮细胞( , ),和癌症相关的成纤维细胞( , )但与T细胞CD8 +负相关( , )和骨髓树突状细胞( , )(图9 (b));SNHG5呈正相关,嗜中性粒细胞( , ),内皮细胞( , ),和癌症相关的成纤维细胞( , )但与T细胞负相关( , )(图9 (c))。

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图9
相关性分析结果之间的基因和免疫浸润细胞。(一)免疫浸润细胞的相关分析。(b)的相关系数块ATF2和免疫浸润细胞。(c)相关系数块SNHG5和免疫细胞浸润。

4所示。讨论

IDD的衰老过程是椎间盘与年龄或其他因素,这是背部疼痛[密切相关34]。发现早期的关键标记IDD的过程可以有效地干预IDD和提供强有力的支持维护椎间盘的生物功能和防止各种并发症。在这项研究中,我们发现ATF2 IDD的关键基因标记,还发现一个lncRNA / microrna的mRNA轴ATF2密切相关,即SNHG5 / mir - 299 - 5 - p / ATF2。我们发现上述基因免疫细胞浸润密切相关,这表明lncRNA / microrna的mRNA轴的过程可能影响IDD通过干扰免疫微环境。

富集分析结果,我们发现hubgenes主要富集在生产过程中,磷酸化改性,异构体形成、绑定和分解代谢的蛋白质。这些结果表明,碘缺乏症的发生密切相关的代谢异常。研究表明,IDD的主要生理变化是蛋白聚糖的巨大损失,尤其是小分子蛋白聚糖。在IDD,蛋白聚糖不断退化,小分子蛋白聚糖不断流露出的组织,导致降低渗透压和椎间盘的持续“失去水”(35]。II型胶原蛋白也被发现更容易变性和破损IDD的螺旋结构,影响胶原蛋白在IDD的类型和分布36]。此外,纤连蛋白的含量增加,蛋白质变性增加和变得更加分散37]。上述研究结论表明IDD将有明显的代谢异常蛋白质和蛋白质的配合,这在IDD的发生和发展中发挥作用。我们的研究结果证实上述研究的观点。我们的研究结果还发现,hubgenes IDD也丰富的生物过程,如负调节骨化,骨骼系统形态发生和细胞迁移。椎间盘退变椎间盘钙化的是一个重要的原因。随着椎间盘继续年龄、骨刺、纤维化、钙化出现在椎间盘造成脊髓狭窄和神经根受压38]。我们的研究结果表明蛋白质代谢异常和IDD的骨化。与此同时,我们发现许多microrna的龙头、网络,这可能是参与IDD的过程。一些角色的microrna在IDD的研究中已被证实。已经证明,circ-TIMP2提升TNF -α- - - il - 1β全身的退变髓核细胞增强细胞外基质合成代谢和分解代谢失衡通过mir - 185 - 5 - p - mmp2信号(39]。王等人建议circ-RERE促进氢peroxide-induced髓核细胞凋亡和自噬通过mir - 299 - 5 - p / galectin-3轴(40]。

多个模型筛选后,我们获得了SNHG5 / mir - 299 - 5 - p / ATF2轴。我们发现ATF2 IDD SNHG5表达较低,和他们有正相关。和mir - 299 - 5 - p与上述两个负相关,表明绑定的监管关系mir - 299 - 5 - p SNHG5和ATF2。ATF2 mRNA负责编码激活转录因子2 (41]。在细胞周期中,ATF2主要与细胞周期蛋白D1结合促进软骨细胞的增殖和分化。这个过程是由细胞因子如转化生长因子β(TGF -β)和甲状旁腺与荷尔蒙相关的肽(PTHrP) [42]。在大骨节病,增加磷酸化ATF2与软骨细胞凋亡有关的43),在破骨细胞分化[符合前面定义的角色44]。在这项研究中,我们的研究结果表明,ATF2 underexpressed IDD,是负相关和mir - 299 - 5 - p,这表明ATF2-mediated软骨细胞增殖减少IDD,它可能会影响到microrna的绑定。ATF2也被证明是巨噬细胞和树突细胞密切相关。ATF2将刺激这些细胞释放细胞因子如白细胞介素23 (IL-23)通过物途径和参与免疫渗透(45]。然而,没有发现这样的协会在我们的研究中,这表明ATF2的低表达可能不影响巨噬细胞和树突细胞,反映了IDD的免疫机制的特征。ATF2将结合c-Jun形成异质二聚体。被肿瘤坏死因子α刺激后,它迅速完成磷酸化和促进E-selectin的表达46]。E-selectin是一个关键的蛋白质,促进中性粒细胞对内皮细胞的迁移和一个关键分子调节endothelial-leukocyte附着力的过程(46]。在这项研究中,我们发现ATF2与中性白细胞和内皮细胞高度相关,这表明leukocyte-endothelial附着力也出现在IDD免疫反应,反映了IDD免疫微环境的变化的特征。ATF2主要参与炎症反应通过物和p38 MAP激酶通路(47]。ATF2的低表达可能导致的过度激活免疫系统和大规模入侵的T细胞(11]。我们的研究结果发现,ATF2的表达与T细胞的含量负相关,表明IDD的过度激活免疫反应和免疫级联的发生。

lncRNA参与许多生理过程,如细胞迁移、增殖、周期,细胞凋亡和自噬48]。SNHG5胶原细胞的增殖密切相关,参与miR-26a / SOX2信号轴,并促进软骨细胞的增殖和迁移49]。在这项研究中,我们发现低表达SNHG5 IDD会影响在IDD软骨细胞的再生和修复。SNHG5还可以调节mir - 205 - 5 - p / ZEB2轴促进神经胶质细胞的增殖50]。在IDD的过程中,不仅椎间盘的老化和脱水,但也可能出现神经系统的变性和坏死。SNHG5可能影响神经痛的发生在IDD通过上述途径。SNHG5参与炎症反应和细胞凋亡。主要调节上述生物过程通过促进分子mir - 155,影响大量炎性细胞因子的释放内皮细胞,导致细胞凋亡的发生(51]。我们的研究结果发现,SNHG5与中性白细胞和内皮细胞呈正相关,表明SNHG5可能发挥作用在IDD通过以上途径的免疫反应。SNHG5也参与了il - 1的过程β全身的软骨细胞凋亡,并已证实SNHG5阻碍il - 1β全身的软骨细胞凋亡,骗取miR-10a-5p [52]。在IDD,这个过程的拮抗效应大大降低由于SNHG5的低表达,导致大量的软骨细胞凋亡和椎间盘的衰老过程中扮演了重要的角色。先前的研究显示的角色mir - 299 - 5 - p / ATF2轴肿瘤细胞的免疫逃逸。的低表达ATF2 overactivation密切相关的免疫系统,表明IDD的免疫微环境之间的相互调节,mir - 299 - 5 - p / ATF2轴。ATF2和SNHG5显示某些功能在我们的研究结果的一致性。他们两人中性粒细胞和内皮细胞呈正相关,但与T细胞负相关,表明两种元素的协同作用在IDD免疫机制和可能的未知的共同监管的关系。目前,SNHG5之间的相互调节关系/ mir - 299 - 5 - p / ATF2和T细胞需要澄清。激活T细胞被认为是密切相关的修复髓核IDD的早期阶段。然而,过度释放细胞因子和炎症因子的T细胞和其他免疫细胞可导致椎间盘的退变加重(16]。

5。限制

由于样本量的限制使用的数据在这项研究中,支持向量机(SVM)和最绝对的收缩和选择算子(套索)模型用于分析检查,这是一个研究设计的限制。此外,尽管多个数据库搜索、验证数据集的样本包含在当前的研究仍相对较小,这也是我们研究的一个限制。

6。结论

在这项研究中,我们发现SNHG5 / mir - 299 - 5 - p / ATF2 IDD可以作为生物标志物,以及免疫细胞的渗透在IDD的病态发展起着重要的作用。此外,IDD的标志,上述轴参与IDD的病态发展还有待进一步探讨。

数据可用性

在这项研究中使用的数据集已经公开共享地理(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/;加入数量:GSE56081, GSE63492 GSE34095, GSE126883)。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

研究概念和设计被屈服强度的贡献,R.G.,和W.W. Acquisition, analysis, or interpretation of data was contributed by Y.S., Q.F., and X.W. Drafting of the manuscript was contributed by Y.S., Y.Z., and W.W. Critical revision of the manuscript was contributed by W.L., W.W. and G.H. Statistical analysis was contributed by Y.S., Y.Z., Q.F., and X.W. Technical support was contributed by W.W. Study supervision was contributed by W.W. and W.L. Yu Shi and Rong Guo contributed to the work equally and should be regarded as co-first authors.

确认

我们感谢Wan et al .,王et al .,蔡et al .,和程et al .,他们共享的数据集地理(GSE56081, GSE63492 GSE34095, GSE126883)。这项工作得到了国家自然科学基金(NNSFC),中国(合同授予数量:82102645,82172526,81772430),南方医科大学的临床研究基金会,中国(合同授予数量:LC2016PY037),广东基础研究和应用基础研究的基础上,中国(2019年合同授予数量:2021 a1515011042, a1515110739),和中国博士后科学基金会、中国(合同授予数量:2019 m662995)。