文摘

几项研究表明,锻炼预处理是一种有效的方法缓解卒中后认知障碍(PSCI)。认知功能的调节机制尚未完全阐明。在此,本研究旨在探索microbiota-gut-inflammasome-brain轴的影响的过程中锻炼预处理缓和缺血性中风后认知障碍。我们观察到锻炼预处理减少梗塞大小,减少神经元损伤的程度,减轻认知障碍与缺血性中风小鼠。此外,也锻炼预处理降低炎性细胞因子的表达,以及NLRP3 Caspase-1,地震,il - 1β蛋白质表达。缺血性中风可能下调的丰富Roseburia而增加的丰度幽门螺杆菌在属的水平。作为对比,锻炼预处理的丰度增加乳酸菌,这是有利于老鼠在属水平。总之,锻炼预处理可以改善缺血性中风后认知功能障碍通过减轻炎症和调节肠道微生物群的组成和多样性,这可能提供一种新的策略来预防PSCI。

1。介绍

缺血性中风是紧急情况下减少造成的血液流向大脑,导致损伤大脑细胞(1]。卒中后认知障碍(PSCI)是一种常见的后果。它也是一个主要因素的长期残疾和生活质量降低。在一个以社区为基础的研究在中国,PSCI患病率是80.97% (2]。PSCI的发病机理复杂,目前还没有有效的临床治疗(3]。锻炼预处理实验作为一种有效的策略已经被证明在中风幸存者(神经保护4]。然而,锻炼预处理的生物机制和途径促进认知功能尚未完全阐明。

广泛的研究表明,运动可以产生神经保护作用(通过减少神经炎症5]。人类和动物的研究已经证明,适当的锻炼延迟认知衰老和神经退行性变(6,7]。一项研究[8)发表在《自然》显示,“跑步者血浆”,从主动收集运行注入久坐不动的老鼠,老鼠和基线神经炎症基因表达减少,实验诱导大脑炎症。这一发现证实了抗炎亚稳态运动因素的存在,目标大脑血管,有益于大脑。更重要的是,以人群为基础的研究发现,有规律的锻炼预处理与缺血性中风并发症少和更好的长期作用结果9]。

有大量证据表明PSCI也与炎症反应相关的发病机制(10]。inflammasome是一个重要的multiprotein复杂,在炎症免疫反应功能。组件inflammasome包含nod样受体pyrin domain-containing 3 (NLRP3),这是一个包含NLRP3脚手架multiprotein信号复杂,适配器蛋白质PYCARD / ASC和Caspase-1。这些蛋白质之间的相互作用可以灵活调节inflammasome的本构功能,确保inflammasome被激活在适当的场合11]。Overactivation炎症是扮演着一个关键的角色在脑缺血中,从早期损伤组织缺血后恢复(12]。具体来说,NLRP3被视为一个主要inflammasomes和丰富地表达在大脑中。它在识别细胞损伤起着关键作用,调节炎症反应缺血性中风(13]。一项研究[14]表明,脑缺血再灌注小鼠后,增加梗死区和脑积水内容和高架NLRP3 Caspase-1表达式。系统性炎症激活NLRP3 inflammasome,触发神经炎症,加剧了缺血性脑损伤和认知障碍。

近年来,人们越来越感兴趣的角色microbiota-gut-brain (MGB)轴调节大脑功能(15]。MGB轴也起着至关重要的作用的病理生理学PSCI和管理炎症反应(16]。它表明,肠道微生物群交流信息与中枢神经系统通过免疫、神经内分泌和迷走神经的“双向brain-gut信号,”影响宿主的大脑功能,因此其行为和认知功能17]。此外,系统性低度慢性炎症可能是由于生态失调的肠道微生物群在中风患者,这是一个关键原因PSCI[的发病机制18]。调节肠道微生物群是一个潜在的目标治疗和预防一些慢性疾病。大量研究表明,肠道微生物群可以协调各种因素,如运动,抗生素,感染,和饮食19- - - - - -21]。运动可以调节肠道微生物群的组成和多样性(22]。运动改变肠道微生物与相应的生理变化相关联的主机,包括免疫和代谢23]。增生的危险微生物群诱发炎症通过改变肠道粘膜屏障,导致中枢神经系统的神经炎症和神经退行性变的(24]。值得注意的是,最近的证据支持,NLRP3 inflammasome扮演重要的角色在主机生理和格式编排外围和中央炎症/免疫反应中枢神经系统疾病通过释放的地震和il - 1β(25,26]。肠道微生物群可能与NLRP3 inflammasome通过动态交互,称为microbiota-gut-inflammasome-brain轴(27]。肠道微生物群采用inflammasome信号调节周围炎症通路,进而有助于保持大脑内稳态。

虽然研究表明,运动有积极影响肠道微生物群,目前尚不清楚microbiota-gut-inflammasome-brain轴在运动过程中发挥作用与缺血性中风预处理。因此,本研究的目的如下:(1)研究的锻炼预处理对认知的影响结果缺血性中风和(2),以确定锻炼预处理可以改善卒中后认知功能通过抑制炎症和调节肠道微生物群。

2。材料和方法

2.1。动物

安徽医科大学动物中心(合肥,中国)为我们提供了40雄性C57BL / 6 j小鼠(年龄:6 - 8周;重量:22 - 24 g)。老鼠在12 h的光/暗周期,和水和食物都免费。动物实验动物伦理委员会授权的协议是,蚌埠医学院,进行符合道德标准。

2.2。试验协议

C57BL / 6 j小鼠随机分为均匀虚假的操作组(假的),在大脑中动脉阻塞(MCAO)组,虚假的操作与锻炼预处理组(EP +假)和MCAO锻炼预处理组(EP + MCAO) ( 在每组)。老鼠在EP +假组和EP + MCAO组配备运行车轮笼子里的啮齿动物和自主运动为4周。老鼠在虚假的组和MCAO组维护传统的笼子里。随后,MCAO组和EP + MCAO受到对脑缺血再灌注的操作,而虚假的组和EP +假组仅暴露了右颈外动脉和颈总动脉通过虚假的操作,没有在右大脑缺血中风。再灌注24 h后,老鼠刺激排便,举起尾巴在每小时9点之间的时间间隔。12点。,和approximately 200 mg of feces was collected from each mouse [28]。考虑到昼夜节律对肠道菌群的影响,所有样品在同一时期内天(29日]。我们存储在-80°C的粪球,直到进一步的处理。

2.3。大脑中动脉闭塞(MCAO)

它进行诱导的小鼠缺血性中风阻塞大脑中动脉。戊巴比妥钠腹腔注射小鼠接受麻醉(100毫克/公斤)。右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉通过颈部中线切口分离。长30毫米和0.12毫米厚尼龙单丝(MSMC21B120PK50 RWD生命科学,深圳,中国),其尖端圆角的硅胶(4毫米长度和直径0.21毫米),插入,留给90分钟从颈总动脉颈内动脉大脑中动脉的开始。90分钟后,单丝是收回来恢复脑缺血后再灌注。虚假的组的老鼠和EP +假针灸组相同的过程,除了单丝渗透。

2.4。神经功能评分

老鼠的神经功能检查后24小时再灌注的五级评分体系根据隆:0,没有赤字;1、无法扩展右爪;2、纵向旋转;3、向右下降;4,不能自发地走。老鼠进了1和3之间的神经被选为下面的研究中,虽然老鼠得分等于1或4被认为MCAO手术的失败。入选标准如下:(1)神经系统评分从1到3基于巴隆的评分系统,(2)至少5%的损失在缺血性中风后24 h(体重30.]。未能满足这些标准之一的动物在24 h卒中后被认为自发恢复,排除在外。

2.5。行为测试

2.5.1。小说对象识别的任务

评估小鼠的非空间识别内存容量可以通过小说对象识别(也)的任务。在这个任务中,准确的测试执行的前一天,老鼠习惯为30分钟的测试空间减少应激反应(31日]。在训练的短语,老鼠与两个相同的对象定位在开放领域。一段10分钟,老鼠被要求探索相同的对象在同一距离上一个熟悉的领域。1小时后,老鼠设置在相同的领域在两个对象面前,其中一个是换一个新对象,另一个5分钟。老鼠冒险所花费的时间的两个对象是显而易见的。和特定的老鼠的气味被喷洒乙醇在测试之前下一个。(小说)的次数老鼠探测新对象,(熟悉)的次数他们探索熟悉的对象,和歧视指数计算 。

2.5.2。Y-Maze测试(自发交替)

自发交替实验作为一个方法来探测空间识别记忆能力在啮齿动物中利用新奇的好奇心。他们喜欢探索之前他们从未去过的地区。执行的测试是在一个对称的白色Y-maze三个武器( )。带来的老鼠最后一只胳膊的y形迷宫和允许自由移动一段8分钟。一系列的手臂条目被实验者被蒙蔽视觉评估,取得了治疗。一个交替决心进入这三个武器顺序。交替变化的最大数量等于手臂的总数输入- 2。自发交替率计算 。

2.6。脑梗死体积

进球后的神经功能,小鼠深刻与戊巴比妥钠麻醉(600毫克/公斤)快速孤立大脑,大脑被放置在一个-20°C冰箱15分钟。随后,前囱+ 4.0毫米到6.0毫米的大脑被切成五2.0毫米厚的部分。然后,部分被沾染了2、3,5-triphenyl四唑氯化物溶液(TTC Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)37°C水浴30分钟,然后用4%甲醛固定15分钟。效果地区发现的梗死面积,而现场区域应该变红了。梗死面积测量使用ImageJ软件。相对梗塞体积是手动按照下列公式计算: 。

2.7。形态学检查

的小鼠麻醉后,他们的大脑被取出心脏灌注与磷酸盐(PBS)和4%多聚甲醛。大脑在一夜之间4%的多聚甲醛固定,嵌入在石蜡,切成5μ米厚的部分,和沾hematoxylin-eosin(他)。组织形态学的变化正确的海马体在显微镜下观察。

2.8。酶联免疫吸附试验(ELISA)

再灌注90分钟后,从眼底静脉丛血液样本聚集。血清是由离心分离在3000 rpm 15分钟在4°C和收集。地震和il - 1的水平β检查使用地震-酶联免疫试剂盒(Calvin生物技术、苏州、中国)和il - 1β酶联免疫试剂盒(Calvin生物技术、苏州、中国),指令后分别由制造商提供。样品的吸光度测量在450海里。

2.9。免疫印迹分析

总蛋白提取从小鼠的海马区域,蛋白质浓度由BCA分析决定。等量的蛋白质样本抽样10% sds - page凝胶电泳分离的蛋白质,然后,PVDF膜是由恒流electrotransformed 90分钟的280毫安。随后,膜浸泡脱脂奶粉5%在TBST (Tween-20 Tris-buffered盐水含1%)2 h。然后,添加相应的初级抗体是一夜之间在4°C。主要的抗体是NLRP3(1: 1000年,ab263899) Caspase-1(1: 1000年,ab179515), il - 1β(1:1000年,ab234437)地震(1:1000年,ab207323)β肌动蛋白(1:2000年,BL005B),从Abcam购买(英国剑桥)除外β肌动蛋白是购自Biosharp(安徽,中国)。膜被移除,冲洗与TBST 3 x 10分钟,在37°C和孵化2 h山羊anti-rabbit免疫球蛋白(从Biosharp BL003A 1: 10000年,安徽,中国),分别。TBST被用来洗膜前三次受到Bio-Rad电泳(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。所有带强度分析是使用ImageJ软件完成的。

2.10。肠道微生物群分析

16 s rRNA方法被用来检测肠道微生物群如下:基因组DNA得到使用制造商指定的DNA提取从老鼠粪便工具包(DNeasy PowerSoil装备,莫生物,美国),并使用Nanodrop量化。证实了DNA提取的质量1.2%琼脂糖凝胶电泳。使用引物PCR进行双(转发:ACTCCTACGGGAGGCAGCA;反向:TCGGACTACHVGGGTWTCTAAT)的高度变异V3-V4地区细菌16 s rRNA基因。PCR扩增了利用Pfu高保真DNA聚合酶(TransGen生物技术),和放大周期的数量是严格控制的。然后,25μl的PCR产物纯化增加0.8倍体积的磁珠(Vazyme VAHTSTM DNA清洁珠)。受到荧光定量PCR扩增恢复产品使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析工具和量化的标(BioTek FLx800)。DNA测序图书馆准备使用Illumina公司TruSeq Nano LT图书馆准备装备。双头社区DNA片段的测序进行使用Illumina公司MiSeq平台。嵌合使用DADA2序列筛选方法。绿色煤电和席尔瓦数据库选择的物种分类注释QIIME2(2019.4)平台。

2.11。统计分析

实验结果给出了 (SEM)。单向方差分析Newman-Keuls测试后被用来分析数据在多个组。 被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。锻炼预处理改善神经分数和减少梗死面积与缺血性中风小鼠

MCAO成功诱导后局灶性脑缺血的方法中,我们评估了缺血性中风和锻炼预处理对神经系统的影响隆赤字的方法。结果表明没有虚假的神经损伤的症状组和EP +假组。相比之下,MCAO组神经功能缺损评分显著高于老鼠比虚假的集团( ,图1(一))。然而,四个星期的锻炼预处理与MCAO组相比显著降低分数( ,图1(一))。这些结果表明锻炼预处理改善缺血性中风后神经损伤发生在老鼠身上。随后,我们评估梗塞大小。如数据所示1 (b)和1 (c),没有虚假的组的梗死体积和EP +假组。梗死面积明显出现在缺血组,和一个统计上的显著差异被发现在MCAO组和EP + MCAO组( ,数据1 (b)和1 (c))。我们的数据指出了一个事实:锻炼预处理改善神经分数和梗死区域由于缺血性中风。

3.2。锻炼预处理改善认知功能与缺血性中风小鼠

3.2.1之上。小说对象识别的任务

一个新对象识别的任务是用于评估非空间内存容量,这是与海马体有关。虚假的组相比,老鼠MCAO组少花点时间浏览新对象( ,图2(一个))。相比之下,这种减少的能力被锻炼增强预处理( ,图2(一个))。缺血性中风影响非空间识别小鼠的记忆能力,同时锻炼缺血性中风前预处理改善认知功能。

3.2.2。Y-Maze测试(自发交替任务)

Y-maze自发交替任务的测试是用来评估空间记忆能力与海马体。Y-maze的实验结果表明,老鼠在MCAO模型组显著减少自发交替速度与虚假的组相比,差异显著( ,图2 (b))。虽然老鼠给锻炼预处理增加了自发交替,这是明显高于MCAO模型组( ,图2 (b)),这表明锻炼预处理可以改善缺血性中风引起的认知障碍和改善空间记忆能力。

3.3。锻炼预处理能提高小鼠的海马神经元损伤的程度与缺血性中风

他染色显示,小鼠的海马神经元虚假的组织排列整齐,完整的细胞结构,可见细胞核。相比之下,MCAO老鼠表现出显著的神经损伤与细胞形状不规则,集中细胞质和细胞核,和损坏海马结构。损坏是提高EP + MCAO组与MCAO组相比,表明锻炼预处理可以对脑组织的保护作用(图3)。

3.4。锻炼预处理减轻炎症因子的表达引起的缺血性中风

由于炎症反应参与了缺血性中风的病理过程,我们使用ELISA观察il - 1的变更β缺血性中风后的地震,如果锻炼预处理可以调节他们的排泄。的il - 1β水平升高在MCAO组相比,虚假的组,如图4(一)。与MCAO组相比,il - 1的显著下降β提出了通过锻炼手术前预处理。我们的数据表明,il - 1β参与缺血性中风和锻炼预处理可以降低其表达式。然而,MCAO的地震水平和EP + MCAO有增加的趋势与虚假的群体相比,但并不显著(图4 (b))。

3.5。锻炼预处理减少的表达NLRP3 Inflammasome和促炎的因素引起的缺血性中风

澄清的差异表达NLRP3 inflammasome和促炎细胞因子在蛋白质水平组,NLRP3的蛋白表达水平,Caspase-1,地震,il - 1β在缺血性脑组织(图确定5)。的蛋白表达水平NLRP3 Caspase-1,地震,il - 1β明显高于在MCAO组与虚假的组。锻炼预处理的表达水平降低NLRP3, Caspase-1,地震,il - 1β有效。这些研究结果表明锻炼预处理变弱和缺血性中风小鼠的炎症。

3.6。锻炼预处理调节肠道微生物群的多样性和组成

我们使用16 s rRNA焦磷酸测序研究肠道微生物群的差异基因在所有组。1520869清洁通过高通量焦磷酸测序序列生成。首先,我们认为α多样性包括Chao1和信仰的PD独立指数表示和基于进化学多样性丰富。如图6(一)和6 (b)虚假的集团,MCAO组相比,增加了Chao1和信仰的PD的水平指标,表明缺血性中风增加物种的丰富性和多样性的老鼠。Chao1和信仰的PD指数之间的差异MCAO组和EP + MCAO组微不足道,表明锻炼预处理并没有显着影响的丰富性和α多样性的物种。

PCoA情节随后用于分析β多样性,不同的样品表现出聚类或分散分布,样本与类似的组件被放置在靠近对方的阴谋。结果表明(图6 (c))之间的肠道菌群分布之间的虚假和MCAO组以及虚假和EP +假组明显分离,表明缺血性中风不仅可以改变肠道菌群的多样性也改变微生物群的分布结构。同时,锻炼预处理可以重塑小鼠肠道菌群的分布。

通过聚类,我们推导出每组的宗教丰富微生物群落在不同分类水平。17个不同类群的肠道微生物群,厚壁菌门(71%),拟杆菌门(16%)和变形菌门(10%)成为最主要的类群(图7)。大约97%的总细菌丰度是限制这三个类群。

此外,肠道微生物群组成在属水平进行了分析。图8(一个)讲述了。层次聚类分析使用未加权的两组与算术平均法(UPGMA)显示,大多数样本聚集在自己的组。同时,找到ASV(扩增子序列变异)与组织之间的显著差异,我们使用了metagenomeSeq方法比较样本2乘2,称为fitFeatureModel函数以适应每个使用zero-inflated ASV对数正态分布的分布模型,并使用这个模型的适应结果区别的意义差异。如图8 (b),与MCAO组相比,幽门螺杆菌虚假的组和减少Roseburia是增加了。如图8 (c),与MCAO组相比,瘤胃球菌属在EP + MCAO组和下降乳酸菌和Alistipes是增加了。其他未提及ASV id并不在属级分类。

在最后的分析中,LEfSe查询组间显著差异和不同物种的生物标记的分类样本(图9)。在三个微分生物标志物的属,Akkermansia和Faecalibacterium的虚假的集团和Lactococcus EP + MCAO组被发现。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查了锻炼预处理的保护作用与认知障碍在缺血性中风。我们提供了直接的证据,锻炼预处理神经赤字,减少梗塞大小老鼠遭受缺血性中风。此外,运动后预处理,的表达NLRP3 inflammasome减少,肠道微生物群的组成和β多样性改建,和认知功能障碍的缓解在缺血性中风。这些研究结果表明锻炼预处理改善缺血性中风后认知功能障碍通过减轻炎症和调节肠道微生物群的组成和多样性。根据我们的研究,我们提供了一种新的病理生理学的观点在缺血性中风锻炼预处理认知障碍。

PSCI是卒中后的主要并发症之一,治疗和预后效果是有限的。之前的研究表明,神经炎症被认为是一个重要因素在PSCI [31日]。Inflammasomes已在人类疾病治疗靶点[32]。的NLRP3 inflammasome是一种胞内multiprotein复杂性,诱发组促炎趋化因子,导致炎症。在中枢神经系统中,NLRP3 inflammasome首次报道在皮质神经元缺血条件下被激活,表达NLRP3, Caspase-1, il - 1β是调节在体外和体内33]。在我们的研究中,炎症因子的水平,包括NLRP3 Caspase-1, il - 1βMCAO组升高,表明NLRP3 inflammasome与缺血性中风的发展。然而,地震没有明显的表达不同的四组。原因是地震展品延迟的诱导时间的表达过程,从24到48 h和缺血后6天(见顶34]。此外,我们还注意到,MCAO组认知功能受损的老鼠,和海马区神经元的形态和结构异常。这些结果表明MCAO小鼠认知功能下降伴随着增加inflammasome表达式。相比之下,上述指标在EP +有效改善MCAO组,这表明锻炼预处理可以改善缺血性中风的炎症反应和认知障碍。

横断面的一项研究表明,锻炼预处理与完整的认知有关的病人(35]。在动物身上进行的大量研究已经表明,运动训练可以改变肠道微生物群的组成和功能能力(36- - - - - -40]。同样,人口研究发现,α多样性和相对丰富的40种不同的细菌类群在肠道微生物群的职业运动员明显比久坐不动的控制(41]。值得注意的是,很少有研究肠道微生物群和PSCI之间的关系。直到2020年,它第一次被报道,PSCI患者改变微生物群组成和相应代谢物与认知障碍的程度,这表明,肠道微生物群可能发展的工作基本上PSCI [42]。因此,我们分析了每组的肠道微生物群组成。我们的数据表明,老鼠接受MCAO增加肠道微生物群的α多样性相比虚假的组。这一发现支持了前瞻性队列研究(43),显示,卒中后患者的肠道微生物群的α多样性高于健康对照组。相反,我们观察到微生物多样性的降低MCAO老鼠使用4周自愿的运动。

我们进一步发现幽门螺杆菌减少,Roseburia增加虚假组相比,MCAO组。幽门螺杆菌的一员吗变形菌门门,促炎效应和与缺血性中风(密切相关44]。幽门螺杆菌是一个endotoxin-producing细菌内毒素和改善肠道通透性增加。这些变化扰乱了肠上皮屏障,使有害物质进入外周血。然而,运动等预处理明显丰富有益的细菌乳酸菌和Alistipes并减少了瘤胃球菌属。在这些有益的细菌中,乳酸菌被广泛认可的角色在保护人类健康和免疫功能修改45- - - - - -47]。此外,乳酸菌据报道在缺血性中风的老鼠模型保护通过抑制神经细胞凋亡,减少脑梗死体积,降低氧化应激,赤字和恢复神经行为(48]。Alistipes是一种相对较新的属的细菌可以被视为一个潜在的短链脂肪酸(短链脂肪酸)生产商49]。通过分析SCFAs与PSCI大鼠的肠道内容,研究人员发现,乙酸和丙酸的浓度低于早期中风在虚假的集团,和丁、戊酸始终在低水平(50]。这些结果表明,肠道微生物群的短链脂肪酸浓度与卒中后认知障碍的发生和预后。背后的机制与SCFAs脑缺血性中风的治疗可能包括减少炎症,重塑的肠道微生物群44]。人们已经发现,肠道SCFA缺血性中风后水平下降。移植SCFA-rich粪便细菌和抑制炎症是有效治疗缺血性中风(51]。一旦可以抑制炎症反应,可以减轻神经元死亡的进展,可以改善卒中后认知功能。在这个实验中,我们发现锻炼预处理改善卒中后认知障碍。我们也观察到,锻炼预处理能改善认知功能障碍通过抑制NLRP3 inflammasome以及丰富乳酸菌和Alistipes和减少瘤胃球菌属。这些研究结果表明锻炼预处理可以显著影响肠道微生物群的成分通过增加有益菌,减少有害细菌,从而抑制炎症反应的激活inflammasome和衰减的老鼠。

我们承认我们的研究几个重要的局限性;首先,没有深入研究FMT(粪便微生物群移植)肠道微生物群的基础上。FMT已成为一个研究热点领域的基础医学和临床医学和可能涉及几种机制值得进一步探索:(1)抑制炎性因子的表达在卒中后肠道和大脑组织;(2)增加有益菌的数量和恢复正常的肠道菌群结构;(3)促进肠道紧密连接蛋白的表达,减少肠粘膜通透性。另一个限制是,我们在选择忽略半影神经元的韧性的标本,侧枝血管的数量仍然可以供给氧气和葡萄糖周围半影,防止不可逆坏死的神经元坏死核心。最后,我们无法显示特定的关联可能是由于样本量不足,而不是缺乏一个真正的关系。

5。结论

总之,我们的研究表明,锻炼预处理可以改善缺血性中风后认知功能障碍通过减轻炎症和调节肠道微生物群的组成和多样性。抑制的分子机制可能涉及NLRP3 inflammasome-mediated炎症反应。这些证据表明,调节肠道微生物群的组成和多样性和抑制炎症反应通过锻炼预处理可以在缺血性中风是一种有效的预防措施。

数据可用性

使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突的研究,本文的作者,和/或出版。

作者的贡献

亨Lv和王沙沙村进行了实验和写的手稿。Meihui田和王Liya进行实验和分析数据。杰高,Qitao赵、李做了统计分析及修订后的手稿。应于,Xianjie贾庆林设计和监督。所有作者都阅读和批准了手稿。亨Lv和沙沙村王同样这项工作。

确认

支持的工作是安徽省自然科学基金(批准号2108085 mh252), 512年的人才培养计划,蚌埠医学院(格兰特数字by51201202 by51201307),大学生创新与创业培训项目(批准号S202110367109)。