文摘

动脉粥样硬化,动脉壁的慢性炎症,是由免疫细胞和细胞因子。最近的证据表明,白介素(IL) -27显示多向性的属性在免疫疾病。然而,精确IL-27机制,尤其是在动脉粥样硬化仍是未知的。在我们的研究中,我们审查的影响政府IL-27和anti-IL-27p28抗体(anti-IL-27p28-Ab)在启动和动脉粥样硬化的进展。组(起始和进展)接收IL-27重组政府,动脉粥样硬化斑块的形成是暂停,调节性T细胞的百分比(腿上+或具体+)在脾脏和外周血增加。同时,辅助T 1 (Th1)和辅助T 17 Th17细胞减少。在外周血血浆,TGF -β和il - 10的表达增加,而干扰素-的水平γ和IL-17减少。至于病变、mRNA的表达Foxp3 TGF -β,il - 10在增加,而干扰素-γ和IL-17减少。anti-IL-27p28抗体组,我们得到相反的结果。我们还观察到DCs治疗IL-27显示耐受性表型,IL-27-treated耐受性DCs (tDCs)很可能在动脉粥样硬化中发挥保护作用。我们的研究表明,IL-27或过继转移IL-27加载tDCs可能在动脉粥样硬化是一种新的治疗方法。

1。介绍

IL-27白介素家族的一员,由巴尔病毒诱导gene3 (EBI3)和p28子单元,它是由活跃的抗原递呈细胞(1]。IL-27 IL-27ra和gp - 130结合复杂,表达在多种细胞类型,包括T淋巴细胞(2]。IL-27在生理和病理条件下有不同的免疫调节活动。据报道,IL-27执行代理传统CD4的抗炎作用+T细胞诱导IL-10-producing细胞参与控制炎症反应(3]。同时IL-27产生促炎效应通过促进Th1, CD8,自然杀伤(NK), T卵泡辅助(Tfh)和B细胞增殖/功能,通过抑制Treg和Th2细胞代寄生虫感染(4]。然而,研究影响IL-27 / anti-IL-27抗体(anti-IL-27p28-Ab)政府在ApoE动脉粥样硬化模型- / -老鼠没有被报道。

动脉粥样硬化是一种lipid-driven慢性炎症性疾病,其特征是进行性动脉粥样硬化斑块的增长。修改后的低密度脂蛋白在动脉壁堆积。浸润的单核细胞接受修改后的低密度脂蛋白,成为泡沫细胞,使斑块不稳定,导致急性心肌梗死(5]。许多研究表明,许多免疫细胞促进慢性炎症和进步的斑块的增长4]。进一步研究表明,Th1细胞促进动脉粥样硬化的起始和进展6,7]。然而,Th2细胞在动脉粥样硬化中的作用仍存在争议。重要的是,最近的研究表明,类型17 T辅助细胞的重要性(Th17细胞)和调节性T细胞亚群)在各种免疫疾病的发病机制,特别是在动脉粥样硬化。

众所周知,亚群发挥重要作用在维护外围宽容,防止自身免疫性疾病,和抑制慢性炎性疾病。亚群产生细胞因子,包括TGF -β(8)和il - 10 (9),它可以抑制动脉粥样硬化斑块的发展和特点。Treg删除加速动脉粥样硬化的发展,过继转移Treg抑制动脉粥样硬化(10]。经典的CD4+亚群是由细胞内Foxp3标志标识11]。针对经典亚有限Foxp3的检测和表面Treg标记激活细胞。其他类型的亚群,包括Tr1和Th3细胞,也被描述,尽管他们不是和经典的具体特征+亚群。圈,aminoterminal域TGF -β前体肽,仍然是共价与TGF -β潜在的TGF -肽在乳沟和形式β复杂。据报道,latency-associated肽(圈)阳性Treg子集有更大的比经典Foxp3体内抑制特性+实验性自身免疫性脑脊髓炎Treg子集的TGF -模型和功能β端依赖的方式(12]。效应由CD4 T细胞反应是抑制+腿上+TGF -亚群β端依赖时尚体外和体内。我们最近发现,天然CD4的百分比+CD25+亚群和CD4+腿上+亚群减少急性冠脉综合征(ACS)患者(13)和CD4细胞的数量和功能+腿上+扩张型心肌病患者亚群是减少(14]。更重要的是,我们报道了一圈+亚群引起的鼻氧化低密度脂蛋白(15]或胸腺基质淋巴细胞生成素(16]减载脂蛋白E-deficient (ApoE的动脉粥样硬化−−/老鼠)。这些结果表明,腿上+亚也可以由外部因素。探索这些监管因素尤为重要。

树突状细胞是一种专业的抗原递呈细胞”,它管理免疫反应和外围宽容17- - - - - -19]。据报道,抑制炎性细胞因子的分泌IL-10-treated DCs,这些DCs诱导代的调节性T细胞亚群)[20.,21]。越来越多的证据表明,特定antigen-loaded tDCs减轻动脉粥样硬化和实验性自身免疫性心肌炎(22,23]。值得注意的是,我们之前的结果表明,IL-37 +肌钙蛋白我加载DCs收购耐受性DCs的特点(tDCs)和亚群的数量增加24]。令人惊讶的是,在小鼠,过继转移这些tDCs显著改善梗死心脏的炎症细胞浸润(24]。然而,免疫调节tDCs作为动脉粥样硬化治疗的效用是刚刚开始。

鉴于这些发现,我们调查是否IL-27管理或anti-IL-27p28抗体减轻动脉粥样硬化。我们发现IL-27政府镇压ApoE的动脉粥样硬化斑块的发生和发展- / -老鼠。IL-27促进了腿上的一代+亚群和Foxp3+亚群的抑制效应T细胞反应。我们进一步发现IL-27-tDCs引发免疫耐受性,减轻动脉粥样硬化的载脂蛋白e- / -老鼠。

2。方法

2.1。动物

雄性C57BL / 6小鼠和载脂蛋白e- / -在C57BL / 6小鼠背景(杰克逊实验室)培育和维护动物中心的北京大学。老鼠在一个特定的无菌设施(同济医学院),被喂以普通食物的饮食或西式饮食含0.15%胆固醇和21%的脂肪。老鼠6周大的实验分为六组( 老鼠/组)。在166、500和1500 ng / mL这三个浓度,500 ng / mL IL-27是最佳的。治疗500 ng / mL IL-27导致显著降低动脉粥样硬化病变大小、健壮upregulation的大腿上+和具体+Treg频率,抑制Th1和Th17频率。因此,我们使用500 ng / mL IL-27在这项研究中。至于anti-IL-27p28抗体,我们也调查了三个浓度(16.6、50和150μ和50 g / mL)μg / mL anti-IL-27p28抗体是最优的一个(图S1)。组A, B, C收到腹腔内注射重组IL-27 (BioLegend、圣地亚哥、钙;500 ng每三天),一个anti-IL-27p28抗体(anti-IL-27p28-Ab;圣地亚哥eBioscience CA;50μg每三天),或磷酸盐(PBS)(0.1毫升每三天)为8周,而组D, E, F开始治疗后8周的西式饮食消费和治疗8周。Stumhofer和猎人报道,gp - 130和IL-27ra复杂,结合IL-27p28, IL-27信号中扮演着重要的角色,因此,我们使用anti-IL27p28-Ab作为拮抗剂IL-27信号(3]。饮食和水管理的随意。所有的实验都在遵循的指导方针进行护理和使用实验动物(湖北省科学技术厅、中国)。

2.2。细胞培养和直流/ t细胞Coculture

骨骨髓来源DCs (BMDCs)生成与gm - csf和il - 4(如前所述)(24]。3天,不依从细胞被清洗和ref相同浓度的gm - csf和il - 4。6天,一半的培养基代替新鲜培养基。不成熟的DCs (imDCs)获得8天后文化。CD4+T细胞是隔绝雄性C57BL / 6小鼠的脾细胞CD4 MicroBead鼠标套件:Miltenyi研究。在那之后,imDCs tDCs或mdc ( /毫升)和CD4细胞+T细胞( cocultured细胞/毫升)。混合细胞培养3天在37°C公司为5.0%2与10% FCS 2毫升RPMI 1640补充。

2.3。体重和脂肪测量

每个老鼠的体重被记录在2,4,6,8周后腹腔内注射的开始。血液被收集到肝素管。等离子体是由离心分离小鼠血液在1200 g 10分钟。总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯等离子体水平是衡量酶测定和确定自动分析器(日立917)。

2.4。动脉粥样硬化损伤和心脏组织分析

主动脉粥样硬化病变窦和胸降主动脉被量化。总之,包括主动脉根部,平行于心房,准备,和部分固定在4%甲醛、处理,嵌入在最佳切削温度(10月)化合物。5 - 35岁的主动脉窦seven-micrometer部分被剪掉了μ米的间隔从三瓣尖点。此外,胸降主动脉解剖,固定的,纵向剖开,固定到黑蜡盘子。上述所有标本都沾油红O和苏木精。斑块面积测量在每个鼠标,Image-Pro + 6.0(媒体控制论)使用。

2.5。实时聚合酶链反应

总RNA提取试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示和转化为互补使用PrimeScript RT试剂盒(豆类、志贺、日本)。一个10μl聚合酶链反应混合物包含1μ克总cDNA和5 pmol每个引物从应用生物系统公司购买(CA)福斯特城。所有反应进行SYBR预混料TaqII交货(豆类)和孵化应用生物系统公司7500实时PCR系统(Bio-Rad、新加坡)96孔板根据制造商的协议。在这项研究中使用的引物序列表中列出1。对于每个样本,信使rna表达水平是规范化GAPDH mRNA水平。

表1

3所示。流仪分析Th1细胞,Th17细胞,Foxp3+亚群,一圈+亚群

3.1。分析Foxp3+亚群和腿上+亚群

从脾脏单核细胞分离与Ficoll-Paque + (MP生物医学)和红细胞被移除。PBMCs和从脾脏单核细胞用PBS然后resuspended密度 完成培养基的细胞/毫升(rpmi - 1640中补充heat-inactivated 10%胎牛血清;Gibco BRL大岛,纽约)。细胞悬液被播种在24-well文化板块。感应圈,细胞被刺激和可溶性anti-CD3 anti-CD28抗体(2μ克/毫升每个;eBioscience) 24 h。孵化器将37°C和5%的股份2环境。Treg分析,PBMCs和从脾脏单核细胞沾anti-mouse CD4 - FITC-conjugated (eBioscience) anti-mouse CD25——APC-conjugated (eBioscience)和anti-mouse圈——PerCP-Cy5.5-conjugated (BioLegend)抗体在4°C为30分钟。Anti-mouse IgG1-PE-conjugated (eBioscience)同形像控制被用来使正常化并确认抗体特异性。表面染色后,细胞被洗与PBS、固定和固定/透化作用permeabilized试剂在4°C (eBioscience) 30分钟,洗两次1×透化作用缓冲(eBioscience)和孵化anti-mouse Foxp3-PE-conjugated (eBioscience)在4°C 30分钟。

3.2。Th1和Th17细胞的分析

Th细胞分析、PBMCs和脾脏被播种的单核细胞的密度 /在rpmi - 1640细胞中补充heat-inactivated 10%胎牛血清(Gibco BRL)和PMA刺激(50 ng / mL;σ,圣路易斯,密苏里州)+ ionomycin (1μg / mL,σ),莫能菌素(500 ng / mL, eBioscience) 4 h在37°C下5%的股份有限公司2条件。与PBS刺激后,细胞被洗,孵化anti-mouse CD4的FITC-conjugated抗体在4°C (eBioscience) 30分钟,用PBS,固定与IC固定缓冲区在4°C (eBioscience) 30分钟,洗两次1×透化作用缓冲以及沾anti-mouse IFN -γPE-conjugated (eBioscience)或anti-mouse IL-17A-PE-conjugated (eBioscience)抗体在4°C 30分钟。Anti-mouse IgG1——PE-conjugated和anti-rat IgG2 PECy7-conjugated (eBioscience)同形像控制被用来使正常化并确认抗体特异性。

执行流仪采集使用FACSCalibur (BD Immunocytometry系统,圣何塞,CA),和所有分析使用FlowJo软件(FlowJo, LLC、亚什兰或)。

3.3。细胞因子检测

TGF -等离子体水平β干扰素-γ,和IL-17以酶联免疫吸附试验(ELISA)根据制造商的指示(NeoBioscience有限公司,中国)。所有elisa的intraassay和interassay变异系数< 10%。所有的样品都在重复测量。

3.4。统计分析

值表示为 在文本和数字。学生的 - - - - - -测试是用来检测两组之间的差异和单向方差分析后跟Newman-Keuls事后测试是用于比较≥3组。的概率值 被认为是具有统计学意义。

4所示。结果

4.1。动脉粥样硬化的起始是被重组IL-27 Anti-IL-27p28抗体和推广

确定管理重组IL-27影响动脉粥样硬化的起始,我们6 ApoE治疗- / -小鼠IL-27 anti-IL-27p28-Ab / PBS时被喂以高脂肪饮食为8周。与PBS的小鼠相比,老鼠接受IL-27动脉粥样硬化的早期表现出主动脉窦动脉粥样硬化病变的大小减少33.7%(平均主动脉窦斑块面积 vs ,分别; ;图1)。anti-IL-27p28抗体的小鼠动脉粥样硬化的早期表现出增加35.4%主动脉窦动脉粥样硬化病变的大小比对待PBS(平均主动脉窦斑块面积 vs ,分别; ;图1)。此外,我们通过en脸分析测量主动脉斑块的负担。类似的结果代表油红O染色的图片所示。相比接受pbs老鼠,老鼠接受IL-27动脉粥样硬化的早期表现出显著减少39.2%(图主动脉斑块的负担1; vs ,分别; ),而对待anti-IL-27p28-Ab显示主动脉斑块增加32.2%(图负担1; vs ,分别; )。

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图1
重组IL-27抑制动脉粥样硬化的起始。(a)、(b)和(c),代表显微照片显示油红O和苏木精染色主动脉根部分组接受IL-27 anti-IL-27p28-Ab,或PBS时被喂以高脂肪饮食为8周,分别。(g)的数据组(a)、(b)和(c)所示。一个黑条代表200人μm。(d)、(e)和(f)代表显微照片显示油红O染色组接受IL-27降主动脉,anti-IL-27p28-Ab,或PBS时被喂以高脂肪饮食为8周,分别。(h)的数据组(d), (e)和(f)。 , , 。
4.2。动脉粥样硬化的进展被重组IL-27抑制和促进Anti-IL-27p28抗体

确定管理重组IL-27影响动脉粥样硬化的进展,我们对载脂蛋白e- / -小鼠IL-27 anti-IL-27p28抗体/ PBS为另一个8周后8周的西方饮食消费。使用群体建模动脉粥样硬化的进展,我们获得的结果与早期团体所观察到的类似。与PBS的小鼠相比,老鼠接受IL-27在动脉粥样硬化的进展显示减少24.4%的主动脉窦动脉粥样硬化病变大小( vs ,分别; ;图2)。anti-IL-27p28抗体的小鼠都大大增加了23.6%在主动脉窦动脉粥样硬化病变的大小( vs ,分别; ;图2比PBS处理)。我们也测量主动脉斑块负担通过en面对这些组织分析。与PBS的小鼠相比,老鼠接受IL-27在动脉粥样硬化的发展表现出减少24.4%的主动脉窦动脉粥样硬化病变大小( vs ,分别; ;图2),而老鼠anti-IL-27p28抗体显示处理增加了23.6%主动脉窦动脉粥样硬化病变大小( vs ,分别; ;图2)。

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图2
重组IL-27抑制动脉粥样硬化的进展。(a)、(b)和(c),代表显微照片显示油红O和苏木精染色主动脉根部分组接受IL-27 anti-IL-27p28-Ab,或PBS为另一个8周后8周的西方饮食消费,分别。(g)的数据组(a)、(b)和(c)所示。一个黑条代表200人μm。(d, e, f),代表显微照片显示油红O染色组接受IL-27降主动脉,anti-IL-27p28-Ab,或PBS为另一个8周后8周的西方饮食消费,分别。(h)的数据组(d), (e)和(f)。 , , 。
4.3。重组IL-27对体重的影响和血浆脂质水平

没有不利影响被观察到经常与治疗相关,体重和血浆脂质未受影响。这些发现表明,政府重组IL-27或anti-IL-27p28抗体并不显著影响体重和血浆总胆固醇水平。

4.4。Foxp3的生成+和腿上+亚群在ApoE- / -老鼠被重组IL-27升高,减少了Anti-IL-27p28抗体

我们确定重组IL-27政府ApoE小鼠的影响。使用流式细胞仪,我们计算出具体的分数+亚群和腿上+亚群在脾脏和外周血的载脂蛋白e- / -老鼠。在动脉粥样硬化的起始,一代的大腿上+亚(脾: vs ,分别; ;图3)(血: vs ,分别; ;图4),具体+亚(脾: vs ,分别; ;图3)(血: vs ,分别; ;图4)是调节小鼠IL-27处理与对待PBS。在小鼠抗体,腿上+Treg(脾: vs ,分别; ;图3)(血: vs ,分别; ;图4),具体+Treg(脾: vs ,分别; ;图3)(血: vs ,分别; ;图4)频率低于小鼠接受PBS。在组织建模动脉粥样硬化的进展,大腿上的比例+Treg(脾: vs ,分别; ;图3)(血: vs ,分别; ;图4),具体+Treg(脾: vs ,分别; ;图3)(血: vs ,分别; ;图4)是调节小鼠IL-27处理与对待PBS。在小鼠抗体,腿上+Treg(脾: vs ,分别; ;图3)(血: vs ,分别; ;图4),具体+Treg(脾: vs ,分别; ;图3)(血: vs ,分别; ;图4)人数低于小鼠接受PBS。这些数据表明,IL-27可能影响动脉粥样硬化的发生和发展,通过增加的百分比的大腿上+和具体+Treg。

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图3
重组IL-27高架Foxp3的一代+和腿上+亚群ApoE的脾脏- / -老鼠。(一)在脾脏,Foxp3的分数+和腿上+亚通过流式细胞仪测定。(a)和(b)显示具体的分数+亚(A)和大腿上+亚(B)在动脉粥样硬化的起始。(C)和(D)显示具体的分数+亚(C)和大腿上+亚(D)在动脉粥样硬化的进展。(b)组数据柱状图所示。 , , 。
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图4
重组IL-27高架Foxp3的一代+和腿上+亚群在ApoE的血- / -老鼠。(一)血液中,具体的分数+和腿上+亚通过流式细胞仪测定。(A)和(B)显示具体的分数+亚(A)和大腿上+亚(B)在动脉粥样硬化的起始。(C)和(D)显示具体的分数+亚(C)和大腿上+亚(D)在动脉粥样硬化的进展。(b)组数据柱状图所示。 , , 。
4.5。在载脂蛋白e- / -老鼠,Th1和Th17细胞的比例降低了重组IL-27和增加了Anti-IL-27p28抗体

以确定是否影响效应T细胞亚群的数量变化,Th1、Th2, Th17细胞也被测量。在脾脏和外周血中,老鼠接受IL-27在动脉粥样硬化的起始表现出较低的Th1计数(脾: vs ,分别; ;图5)(血: vs ,分别; ;图6),Th17细胞(脾: vs ,分别; ;图5)(血: vs ,分别; ;图6比接受pbs老鼠)。脾和血,高项Th1(脾: vs ,分别; ;图5)(血: vs ,分别; ;图6),Th17细胞(脾: vs ,分别; ;图5)(血: vs ,分别; ;图6)检测抗体的小鼠比接受pbs的老鼠。组织建模的动脉粥样硬化的进展,老鼠接受IL-27表现出较低的Th1计数(脾: vs ,分别; ;图5)(血: vs ,分别; ;图6),Th17细胞(脾: vs ,分别; ;图5)(血: vs ,分别; ;图6比接受pbs老鼠)。抗体的小鼠显示项Th1更高(脾: vs ,分别; ;图5)(血: vs ,分别; ;图6),Th17细胞(脾: vs ,分别; ;图5)(血: vs ,分别; ;图6比接受pbs老鼠)。然而,Th2细胞的比例没有显著不同的组(数据没有显示)。这些结果表明,IL-27可能影响动脉粥样硬化的发生和发展,减少Th1和Th17效应T细胞的比例。

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图5
重组IL-27 Th1和Th17细胞的分数降低的脾脏的载脂蛋白e- / -老鼠。的分数(a)在脾脏,Th1和Th17细胞通过流式细胞仪测定。(A)和(B)的分数Th1 (A)和Th17细胞(B)在动脉粥样硬化的起始。(C)和(D)的分数Th1 (C)和Th17细胞(D)在动脉粥样硬化的进展。(b)组数据柱状图所示。 , , 。
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图6
重组IL-27 Th1和Th17细胞的分数降低血液的载脂蛋白e- / -老鼠。(a)在血液里,分数Th1和Th17细胞通过流式细胞仪测定。(A)和(B)的分数Th1 (A)和Th17细胞(B)在动脉粥样硬化的起始。(C)和(D)的分数Th1 (C)和Th17细胞(D)在动脉粥样硬化的进展。(b)组数据柱状图所示。 , , 。

5。重组IL-27干扰素的表达,减少γ和IL-17A同时增加TGF -的表达β、il - 10和Foxp3的主动脉

确定mRNA水平的变化、相关基因的表达在主动脉动脉粥样硬化的起始是探测到qPCR(图7(一))。TGF -β( vs ,分别; ),Foxp3 ( vs ,分别; ),和il - 10 ( vs ,分别; )水平高的老鼠接受IL-27比PBS对待。干扰素-γ( vs ,分别; ),和IL-17 ( vs ,分别; )被抑制小鼠IL-27处理与对待PBS。anti-IL-27p28-Ab管理时,TGF -β( vs ,分别; ),Foxp3 ( vs ,分别; ),和il - 10 ( vs ,分别; )水平低于检测水平在PBS管理。干扰素-γ( vs ,分别; ),和IL-17 ( vs , )水平增加小鼠anti-IL-27p28-Ab处理与对待PBS。在组动脉粥样硬化的进展进行建模(图7 (b)),TGF -β( vs ,分别; ),Foxp3 ( vs ,分别; ),和il - 10 ( vs ,分别; )显示更高水平的老鼠接受IL-27比PBS对待。干扰素-γ( vs ,分别; ),和IL-17 ( vs ,分别; )表达被抑制小鼠IL-27处理与对待PBS。TGF -β( vs ,分别; ),Foxp3 ( vs ,分别; ),和il - 10 ( vs ,分别; )水平低的老鼠接受anti-IL-27p28-Ab比PBS对待。干扰素-γ( vs ,分别; ),和IL-17 ( vs ,分别; )水平增加小鼠anti-IL-27p28-Ab处理与对待PBS。总之,这些数据表明,重组IL-27增加Treg-associated细胞因子表达和减少Th1和主动脉Th17细胞因子的表达有关。

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图7
重组IL-27干扰素的表达,减少γ和IL-17A同时增加TGF的表达-β1,il - 10, Foxp3在主动脉。相关基因的表达在主动脉起始(a)和(b)动脉粥样硬化的进展被qPCR检测。组数据柱状图所示。 , , 。
5.1。重组IL-27降低干扰素-的水平γ和IL-17A外周血血浆同时增加TGF -的水平β和il - 10

相关的细胞因子被ELISA检测(图8)。在动脉粥样硬化的起始,(图8(一个))TGF -β1( vs ,分别; )和il - 10 ( vs ,分别; )表达式是在小鼠接受IL-27晋升与PBS处理相比,而干扰素-γ( vs ,分别; )和IL-17 ( vs ,分别; )水平降低。TGF -β1 ( vs ,分别; )和il - 10 ( vs ,分别; )水平降低,而干扰素-γ( vs ,分别; )和IL-17 ( vs ,分别; )水平增加anti-IL-27抗体的小鼠比PBS对待。在动脉粥样硬化的进展,(图8 (b))TGF -β( vs ,分别; )和il - 10 ( vs ,分别; )是表现出更高的水平在小鼠IL -处理27比PBS,对待干扰素-γ( vs ,分别; )和IL-17 ( vs ,分别; )显示较低的水平。与那些在PBS组相比,TGF -β( vs ,分别; )和il - 10 ( vs ,分别; )水平的抗体组减少,的干扰素-γ( vs ,分别; )和IL-17 ( vs ,分别; )水平增加。总的来说,这些数据显示,重组IL-27增加Treg-associated细胞因子水平和减少Th1和Th17细胞因子水平有关。

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图8
重组IL-27降低干扰素-的水平γ和IL-17A外周血血浆同时增加的水平TGF -β和il - 10。相关细胞因子在小鼠血浆被ELISA检测。数据从起始(a)和(b)动脉粥样硬化的进展是柱状图所示。“TGF-b1/100”的意义的水平TGF -β除以100。因为的水平TGF -β都远高于的水平il - 10,干扰素,γ,IL-17A,我们使用“TGF-b1/100”这个数字。 , , 。
5.2。IL-27-tDCs耐受性表型

DC成熟特征是由扩张的抗原递呈分子(如MHC II、CD40和CD86)。DCs沾染了同形像控制抗体,anti-MHC-II抗体,anti-CD40,和anti-CD86抗体,紧随其后的是流式细胞仪分析( ,图9(一个)),然后平均荧光强度(MFI)检测。与争取民主变革运动组相比,IL-27-tDC组显示低MFI的mhc ii, CD40和CD86 ( ,图9 (b))。如图9 (c),DCs加载IL-27和有限合伙人产生干扰素- mRNA水平较低γ和il - 12、il - 10的mRNA水平较高,TGF -β比mDCs,被罩。这些结果共同表明IL-27 + LPS-treated DCs显示耐受性表型。

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耐受性树突状细胞(tDCs)增加的百分比调节性T细胞亚群)体外。(一),脾脏CD4+T细胞( 细胞/毫升)培养3天的媒介单独或结合未成熟dc (imDCs),成熟的DCs (mdc),或IL-27-tDCs ( 细胞/毫升)。这些细胞被标记与anti-CD4 72小时后,anti-CD25, anti-Foxp3并通过流式细胞仪分析。流式细胞仪数据代表1 6到8个独立的实验(每个coculture准备准备从不同的鼠标)。(b)图形代表CD4细胞亚群的平均百分比+脾T细胞不同的组。(c)的mRNA水平分析干扰素-γ(IFN -γ)、IL-17A Foxp3,白介素(IL) -10,转化生长因子-β(TGF -β在不同的组)。没有DCs组 ,imDCs集团 ,mDCs集团 ,和tDCs集团 。 。
5.3。IL-27-tDCs显示诱导宽容与CD4 Cocultured时的能力+T细胞

调查的影响IL-27-tDCs Treg细胞、CD4细胞+T细胞与不同类型的DCs cocultured体外,分别。而没有DCs, imDCs和mdc IL-27-tDCs说增加CD4的百分比+CD25+Foxp3+在CD4细胞亚群+细胞( ,数据10 ()和10 (b)),Foxp3的mRNA水平IL-27-tDC组显著高于其它三组( ,图10 (c))。此外,IL-27-tDCs显著抑制干扰素-γ和IL-17A mRNA水平与mDCs相比。相比之下,mRNA水平的il - 10和TGF -βIL-27-tDC组显著提高( ,图10 (c))。总之,上述结果表明,IL-27-tDCs展出引起宽容与CD4 cocultured时的能力+T细胞。

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图10
白介素(IL) -27 +脂多糖(LPS)治疗耐受性树突状细胞(dc)显示属性。(一)骨骨髓来源dc ( 细胞/)培养缺乏刺激(不成熟的DCs [imDCs])或100 ng / mL的存在有限合伙人(成熟的DCs (mdc)或100 ng / mL有限合伙人和30 ng / mL IL-27(耐受性DCs (tDCs))。DCs与同形像彩色控制抗体或与特定的抗体主要组织相容性复合体II级(mhc II), CD40、CD86和分析fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)。(b)平均荧光强度(小额信贷机构)对mhc ii, CD40和CD86调查。(c)的mRNA水平不同的DCs组的分析。 每组。 。
5.4。ApoE IL-27-tDCs缓解动脉粥样硬化- / -老鼠

为了测试IL-27-tDCs在动脉粥样硬化的作用,6周大的老鼠给为10周高脂饮食诱导斑块形成主动脉根,然后没有DCs(图(11日)),imDCs(图11 (b)),IL-27-tDCs(图11 (c)),mdc(图11 (d))过继转移到动脉粥样硬化小鼠。部分从主动脉根部沾油红O和苏木精观察斑块。正如所料,过继转移的IL-27-tDCs显著降低动脉粥样硬化斑块大小与mdc(图11 (e))。然而,争取民主变革运动组的斑块大小甚至与imDC和IL-27-tDC组相比显著增加(图11 (e))。这些结果表明,过继转移IL-27-tDCs可以显著改善动脉粥样硬化,虽然过继转移mDCs说可以加重动脉粥样硬化。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图11
ApoE IL-27-tDCs改善动脉粥样硬化- / -老鼠。(一)动脉粥样硬化病变的大小没有直流组。(b)动脉粥样硬化病变大小imDC组。(c)动脉粥样硬化病变大小IL-27-tDC组。(d)争取民主变革运动组的动脉粥样硬化病变大小。(e)动脉粥样硬化病变的大小是统计的专业形象。 每组。黑条代表100人μm。 。

6。讨论

动脉粥样硬化,动脉壁的慢性炎症性疾病,据报道与各种炎性细胞因子,如il - 10和TGF -β,这与亚(25)以及干扰素-γ,肿瘤坏死因子-α,和IL-17 Th1和Th17细胞(26]。令人信服的实验数据表明,将Treg /效应T细胞平衡向亚群是一个可能的治疗动脉粥样硬化疾病的方法。例如,我们以前报道,鼻内接种热休克蛋白60-induced treg抑制早期动脉粥样硬化(14]。我们还报道,引起的亚群nasal-oxidized低密度脂蛋白抑制效应T细胞反应和减毒动脉粥样硬化15]。然而,亚群的作用在人类动脉粥样硬化疾病尚未完全阐明。

一些免疫疗法,如使用FcR-nonbinding anti-CD3单克隆抗体(27,28),一个/ anti-IL-2单克隆抗体复杂[- 229日),他们的组合30.,活动形式的维生素D3,已被证明是有效的方法来防止动脉粥样硬化,增加Treg数字(31日]。然而,传统的免疫学方法减弱动脉粥样硬化的immunoinflammatory分量有限,尤其是在建立动脉粥样硬化。例如,anti-CD3治疗小鼠诱发CD4+腿上+亚群和减弱动脉粥样硬化的起始,但不是建立了动脉粥样硬化的进展29日]。根据Dinh研究et al .,我们修改发表短期治疗方案治疗适合诱导长期海拔Treg数字(29日]。Koltsova等人的以前的报告表明,ldlr−−/小鼠移植IL27ra−−/骨髓发育明显增大升主动脉粥样硬化病变的根,主动脉拱门,和腹部主动脉比与野生型骨髓移植(32]。这些发现表明,IL-27衰减动脉粥样硬化可能是一个有前途的治疗方法。事实上,我们的研究结果显示,政府的重组IL-27抑制起始和进展ApoE的动脉粥样硬化斑块- / -老鼠。老鼠接受了重组IL-27治疗显示主动脉斑块负担小,我们是第一个报告,老鼠收到一封anti-IL-27p28抗体增长更大的斑块。基于这些研究结果,针对IL-27-IL27受体轴可能是一个潜在的策略来预防或治疗动脉粥样硬化。

IL-27功能在生理和病理条件下的多效细胞因子。IL-27生产是由各种toll样受体激动剂,包括脂多糖(LPS),聚(我:C), CPG,革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌。干扰素-γ监管因素(irf),包括IRF1 IRF3, IRF7 IRF8,增强IL-27生产(33- - - - - -37]。IL-27首先是公认的促炎细胞因子(38- - - - - -40]。IL-27 Th1反应对被观察到重要的寄生虫。此外,研究发现,IL-27抑制Foxp3的表达,CD25,因此CTLA4通过抑制STAT3和抑制亚群的生成(41,42]。CD4 IL-27转基因小鼠+CD25+T细胞模型和骨髓转移模型显示缺陷Treg分化(41]。

然而,最近的研究显示IL-27函数的复杂性。随后的研究表明,IL-27是- 2体外的负调节,可以限制免疫反应的发展43- - - - - -45]。此外,在体内寄生虫感染模型,IL-27抑制干扰素-γ生产和减弱疾病病理与刚地弓形虫,鲁兹锥体,鼠疟原虫(和疟疾杜氏利什曼(46- - - - - -49]。亚群的观察同样的趋势。在弓形虫感染,IL-27提升T-bet通过STAT1和CXCR3表达在亚群,STAT3和STAT5 [44]。在我们的研究中,IL-27导致的抗炎特性增加Foxp3的一代+和腿上+亚群的数量和减少Th1和Th17细胞的载脂蛋白e- / -老鼠。这一结果符合的一项研究的发现Koltsova et al .,那些报道,缺乏抗炎IL-27信号导致较低的Treg和更高的Th1和Th17细胞计数ldlr的模型中−−/小鼠移植Il27ra−−/骨髓(32]。此外,据报道,在缺乏IL-27受体的情况下,巨噬细胞在体外活化改性低密度脂蛋白增加吸收和促炎细胞因子的生产(50]。值得注意的是,我们的研究是第一个评价的影响政府的ApoE anti-IL-27p28抗体- / -老鼠和重组的作用IL-27在大腿上+亚群。

重要的是,针对经典亚治疗受限于Foxp3在激活细胞的检测(51]。除了Foxp3,很少有可靠的和特定的标记报告区分Treg亚种。Foxp3的开发和维护是至关重要的抑制Treg血统。然而,据报道,赫利俄斯应该是一个更好的标志激活treg表达糖蛋白重复主要(GARP / LRRC32)比Foxp3[/圈52]。圈和TGF -β形成活性复合物称为潜在TGF -β复合物表面的T细胞。这些复合物可以裂解释放活性TGF -β(53]。GARP中起关键作用的形成和表达潜在的TGF -β复合物锚定复合物在细胞表面的细胞膜(52]。这些新的标记都是位于细胞膜上的特点,使他们比Foxp3在转化医学更有价值。然而,在不同的情况下更多的实验和疾病是必要的。

我们最近的研究表明,CD4细胞+腿上+和CD4+CD25+亚被抑制在ACS (13),CD4+腿上+和CD4+CD25+Foxp3+T细胞nasal-oxidized低密度脂蛋白诱导的抑制效应T细胞反应和减弱ApoE的动脉粥样硬化- / -老鼠(15]。此外,gabriele等人报道,anti-LAP抗体代表一个潜在的方法对癌症免疫疗法通过减少大腿上+Treg数字(54]。所有这些研究表明,腿上作为一个可靠的标志在许多情况下亚群。因此,CD4+腿上+亚群是我们感兴趣的。CD4+腿上+亚亚(之前被确认为一种新的子集12]。腿上+人口相对较少,然而,一些研究提到CD4细胞+腿上+亚与Foxp3分享许多属性+亚[15,16,55]。之前的数据显示,TGF -β起着关键作用的抑制功能自然亚(nTregs)和CD4+腿上+亚[12,56,57]。我们是第一个地址是否IL-27-induced CD4+腿上+亚群和CD4+腿上+亚群在动脉粥样化形成中发挥关键作用。然而,准确的机制描述IL-27如何影响T细胞体内仍然是难以捉摸的。

众所周知,天真的CD4细胞+T细胞分化成效应T细胞如Th1、Th2, Th17细胞,这些都严重影响人类和老鼠的血管硬化后抗原表达或激活巨噬细胞或DCs (26]。Th1细胞产生大量的干扰素-γ和Th17细胞产生大量的IL-17是最常见的致病性T细胞在动脉粥样硬化。干扰素-γ据报道,启动激活单核细胞/巨噬细胞和DCs,导致致病性Th1反应[延续58]。proatherogenic Th17细胞的作用也被证明(59]。我们的数据显示,政府的重组IL-27导致较小的Th1和Th17细胞的比例。这些proatherogenic T细胞数量的下降应该负责的动脉粥样硬化。此外,我们的数据表明,政府重组IL-27抑制干扰素-γ和IL-17分泌效应T细胞。我们的研究结果证实,Th1和Th17细胞通过干扰素的生产——扮演proatherogenic角色γ分别和IL-17。此外,我们的数据显示,体重和血脂水平没有显著不同IL-27-treated老鼠和老鼠接受pbs。这些结果表明IL-27抑制动脉粥样硬化的发展独立的老鼠的体重指数和血脂水平。

每个硬币有两面,DCs专业抗原递呈细胞,调节免疫和宽容17,18]。成熟的dc免疫原性,而semimature DCs耐受性(19]。心肌梗死后,由于继发心肌损伤、自身免疫反应心脏肌球蛋白和肌钙蛋白I是关心不良临床结果(60,61年]。之前的报告显示,myosin-loaded tDCs减弱自身免疫性心肌炎(22]。符合本研究,我们的研究发现,通过诱导胸腺基质lymphopoietin-conditioned DCs改善动脉粥样硬化发展亚群的分化16]。总之,上述出版物表明tDCs在这些模型发挥保护作用。值得注意的是,在hypercholesterolemic老鼠,动脉粥样硬化加速了政府与DCs LDL-induced DCs和减毒免疫疗法治疗ApoB100和il - 10,表明动脉粥样硬化可以调制通过修改dc的成熟23,62年]。在目前的研究中,CD40的小额信贷机构,mhc ii,和CD86 IL-27-tDC组相比,mDC组明显减少,表明IL-27阻碍了DCs的成熟过程。体外,我们也证明了IL-27-tDCs展出诱导的能力。此外,收养IL-27-tDCs ApoE的传播- / -老鼠显示动脉粥样硬化斑块被降低。这个结果表明IL-27可以改善动脉粥样硬化tDCs的感应。然而,有IL-27诱导DCs的确切机制仍需要阐明。

7所示。结论

总之,我们的研究是第一个突出,腿上+亚群IL-27信号中扮演着重要的角色限制了动脉粥样硬化。我们报道了政府IL-27阻止动脉粥样硬化的起始和进展诱导的大腿上+和具体+亚群。我们还证明了DCs治疗IL-27显示耐受性表型,IL-27-treated tDCs很可能在动脉粥样硬化中发挥保护作用,这表明IL-27或过继转移IL-27 tDCs加载可能会提供一个新颖的方法在未来治疗动脉粥样硬化。

缩写

IL: 白介素
ACS: 急性冠脉综合征
Treg: 调节性T细胞
圈: Latency-associated肽
Th: 辅助T
肿瘤坏死因子: 肿瘤坏死因子
TGF: 转化生长因子
干扰素: 干扰素
EBI3: 巴尔gene3占据
NK: 自然杀伤细胞
Tfh: T卵泡辅助
SAP: 稳定心绞痛
PMBC: 外周血单核细胞
PBS: 磷酸盐
10月: 最佳切削温度
DC: 树突细胞
tDCs: 耐受性树突状细胞
mDCs: 成熟的树突状细胞
GARP: 重复的糖蛋白。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

Wenbin徐、朱Ruirui Zhengfeng朱贡献同样这项工作。Wenbin徐和Ruirui朱镕基写手稿。海盐县钟,曾庆红Qiutang Kunwu Yu, Zhengfeng朱镕基设计研究中,分析了数据,并回顾了手稿。Ruirui朱Kunwu Yu,剑,王曰,燕叮了采集数据并进行研究。剑于执行统计分析。红霞唐进行生化分析。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(没有。81270354,没有。81300213,没有。81900270)。

补充材料

图S1:喂高脂肪饮食8周后,主动脉窦动脉粥样硬化病变大小(a)在166年,500年,1500 ng / mL IL-27和PBS组。具体的分数+亚(B),大腿上+亚(C), Th1 (D), Th17细胞(E)的外周血的载脂蛋白E- / -老鼠计算在166、500、1500 ng / mL IL-27和PBS组。主动脉窦动脉粥样硬化病变的大小(F) 16.6, 50和150μg / mL anti-IL-27p28抗体和PBS组。具体的分数+亚(G),大腿上+亚(H), Th1 (I), Th17 (J)的外周血细胞的载脂蛋白e- / -老鼠在16.6计算,50和150μg / mL anti-IL-27p28抗体和PBS组。 每组。 和 。(补充材料)