文摘

小胶质细胞在半影从M2转向M1表型脑缺血再灌注后3至5天,促进局部炎症和损伤。Shaoyao-Gancao汤(SGD)被发现导致的一个重要upregulation IL-13半影,已显示平方米小胶质细胞的诱导极化。有这样一个假设SGD可以发挥抗炎和神经保护作用通过激活IL-13诱导小胶质细胞极化对M2表型,本研究的目的是探索SGD对小胶质细胞表型转换的影响及其可能的机制。老鼠接受手术大脑中动脉阻塞(MCAO)处理SGD 3或6天,调查的治疗效果和底层机制SGD对脑缺血再灌注损伤(CI / RP)。结果表明,SGD改善神经行为评分和减少细胞凋亡。此外,SGD显著降低M1小胶质细胞和M1-like标记,但增加了M2小胶质细胞和M2标记。此外,更高水平的IL-13和比率的p-JAK2 / JAK2和p-STAT6 / STAT6 SGD组中发现MCAO相比。总之,它验证了SGD阻止驾驶小胶质细胞表型转换伤M1, M2,可能通过IL-13及其下游JAK2-STAT6通路。鉴于未包括在这项研究中,进一步验证测试需要进行更多的实验来证实上述结果的可靠性。

1。介绍

中风是全球最严重的疾病之一,和缺血性中风(是)是最常见的导致残疾和死亡率高,添加一个严重的社会经济负担。在临床中,重组纤溶酶原激活物被广泛认为是目前最有效的治疗,但它有一个狭窄的时间窗口和可能增加颅内出血症状的风险1]。其他常用的神经保护药物也有副作用。例如,瞬态低血压患者最常观察到人类尿道血管舒缓素(菲律宾新人民军)[2]。因此,有必要探索新的和有效的疗法治疗。

值得注意的是,是治疗后再灌注损伤是不可避免的。被更多的关注immunoinflammatory反应在脑缺血再灌注(CI / RP)损伤,特点是小胶质细胞的激活和炎症细胞因子和趋化因子的生产(3]。小胶质细胞可以激活为M1和M2表型,这取决于刺激(4]。M1小胶质细胞显示一个抑制影响大脑恢复通过释放多种促炎细胞因子。相反,M2小胶质细胞有助于一个有益的过程,如减少炎症、组织修复、细胞碎片清除(5,6]。小胶质细胞的表型转换后可以诱导损伤引起的脑缺血(7]。在急性期,M2表型小胶质细胞中大量表达的核心梗塞,而大量的M1小胶质细胞在半影聚合。随后,M1小胶质细胞增加在缺血后3天,达到14天。下降趋势平方米小胶质细胞在7天开始,一直持续到14天(8]。因此,促进一个M1, M2半影的表型转变这一时期可能是一个潜在的治疗目标的减轻炎症损伤和对CI / RP损伤起到神经保护作用。

Shaoyao-Gancao汤(SGD),一个典型的中国草药配方,来源于论述发热性疾病,由张钟京(9]。它有明显优势的生产解痉、镇痛和抗炎操作(10]。最近的临床研究证实,SGD可以改善运动能力,减少痉挛,疼痛和肿胀在中风后偏瘫患者11,12]。然而,的精确机制对CI / RP SGD损伤的保护作用并没有明确确定。我们都知道,一些研究表明SGD和活性成分,包括芍药苷、甘草酸,甘草甙,发挥神经保护作用通过抑制炎症反应在神经系统疾病(13,14]。例如,SGD已被证明是有效的在学习和认知改善阿尔茨海默氏症(通过减少神经炎症15]。的有利影响芍药甙和甘草甜素对脑复苏归功于减少促炎因子的表达,如核因子-κB (NF -κB)、白介素- 1 (IL)β和肿瘤坏死因子(TNF)α(16,17]。总之,SGD和生物活性成分提供保护作用,抑制促炎反应。对CI / RP恢复SGD-induced是否积极的影响与抗炎特性SGD仍然是未知的,需要进一步的研究。

pre-experiments,的一个重要upregulation IL-13,半影的抗炎因子,测定后日与SGD填喂法治疗。IL-13,还刺激,诱发平方米小胶质细胞,结合其受体(IL-13 Rα1)和激活Janus激酶/信号转导和activator-6通路(JAK / STAT6)、极化小胶质细胞对M2a表型[医学18- - - - - -20.]。先前的研究表明IL-13管理可以提升平方米小胶质细胞的比率,提高长期后感觉运动赤字(21]。因此,它是合理的假设IL-13可能功能在促进小胶质细胞极化的M2表型CI / RP SGD治疗后大鼠。

本研究的目的是调查SGD的抗炎作用及其可能的机制在CI / RP老鼠。具体来说,我们评估M1和M2的表达在半影SGD治疗后小胶质细胞,探讨M2极化的感应是否通过IL-13 SGD介导及其下游通路JAK2 / STAT6。

2。材料和方法

2.1。动物

Specific-pathogen-free男性雄性sd大鼠中(年龄在8 - 10周,250 - 320 g)从松弛实验动物购买公司(上海,中国)。所有动物都照顾符合立法由美国国立卫生研究院的指导方针。老鼠被分为3组,即SGD, MCAO,虚假的团体在一个随机的顺序。允许实验计划从上海交通大学的伦理委员会被授予(伦理号2019027)。

2.2。CI / RP模型

SGD和MCAO组大鼠大脑中动脉闭塞了——(MCAO)再灌注手术根据前面描述的方法(22]。在深麻醉下手术,暴露右侧颈总动脉分支,然后插入一个灯丝与硅胶的1.8 - -2.0厘米到颈内动脉(ICA)阻止血液流动。120分钟后,灯丝被允许再灌注。Zea-Longa测试(22)是在手术后24小时,只有老鼠的分数1 - 3被接受为以后研究。相同的手术发生在老鼠虚假的组中,除了被保存在ICA的灯丝。半影皮层和纹状体的分子实验如图1。

2.3。制备SGD

SGD准备从Paeoniae基数alba片(批号:2004086)和honey-fried中药片Glycyrrhizae(批号:2005072)的水煎煮法,这是来自四川Neautus中药有限公司有限公司(四川,中国)。天然药浓度为1.05 g / mL,这是储存在4°C为将来的实验。

2.4。高效液相色谱法(HPLC)分析

七个活性成分,包括oxypaeoniflorin、芍药苷,albiflorin,甘草甙、甘草甜素,isoliquiritin,和liquiritigenin用于SGD和相对量化的数量控制在一个安捷伦高效液相色谱HPLC-DAD系统。取得了最佳分离条件采用乙腈(A) -0.1%水磷酸(B)为流动相,用列温度在30°C。注射量是10μL,流动速度是1毫升/分钟。

2.5。实验设计

SGD组大鼠服用4毫升的SGD填喂法从手术后24小时一天一次,持续3天或6天,而在其他两组老鼠有盐溶液在相同的体积,频率和治疗时间。

2.6。神经学分数

3组的大鼠神经行为障碍是评估经营者忽视组分配使用修改后的神经严重程度评分(mns) [23在1天,4天,MCAO后7天。mns 18评估,包括运动、感觉、反射和平衡考试,和更高的分数预测更糟的行为表现。

2.7。定量实时聚合酶链反应(存在)的分析

从半影的过程中提取总RNA,反转录过程遵循制造商的协议。存在il - 4的内容,IL-13 IL-1a, IL-1b, il - 6和il - 10使用一个应用生物系统公司系统执行(7500实时PCR软件,沃尔瑟姆,妈,美国)。涉及的包买来Tiangen生物技术(中国,北京)。U6担任内部控制和正向引物序列表中列出1,指以前的研究的记录(24- - - - - -28]。2^−ΔΔCT法来检测目标基因的mRNA表达(29日]。

2.8。Luminex多元分析

Bio-Plex Pro™大鼠细胞因子23-Plex试验(12005641,Bio-Rad,大力神、钙、美国)采用检测多种细胞因子的浓度(il - 4、IL-13 IL-1a, IL-1b, il - 6、il - 10)在半影Luminex 200仪器(马热费希尔科学、沃尔瑟姆、美国)。单位蛋白表达的研究是pg /毫克。

2.9。西方墨点法

半影组织是对待里帕裂解缓冲(亚美、苏州)和蛋白质浓度测定。10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)用于分离目标蛋白质,然后转移到硝化纤维素膜。膜被5% BSA 1 h,然后用5% BSA包含相应的初级孵化抗体,包括JAK2(美国YT2426, Immunoway,普莱诺,TX) (1: 400), p-JAK2(3776细胞信号技术,丹弗斯、马、美国)(1:500),STAT6 (YT4454 Immunoway) (1: 400), p-STAT6 (YP0256 Immunoway) (1: 400), bcl - 2 (YT0470 Immunoway)(1: 500),伯灵顿(YT0455 Immunoway)(1: 500),和GAPDH (YM3029 Immunoway)(1: 5000)在一夜之间在4°C瓶。第二天,Tris-buffered saline-tween (TBST)是用来冲洗膜3次,然后孵化与二次抗体(RS23710、RS23920 Immunoway) (1: 10000) 1 h。观察使用一个乐队奥德赛红外成像系统3.0.29(美国内布拉斯加州LICOR)。

2.10。双重免疫荧光染色

大脑部分浸在0.1% Triton x - 100 10分钟,阻塞1 h,然后暴露于主要抗体在4°C一夜之间,包括兔子anti-Iba1(和光,019 - 19741,kouichi东京都中央区大阪,日本)(1:500)和鼠标anti-CD68 (MCA341R Bio-Rad)(1: 50)或鼠标anti-Arg-1 (sc - 271430,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国)(1:25)。随后,孵化的解决方案是取代了山羊anti-rabbit免疫球蛋白(a - 21428、热费希尔科学)(1:1000)和小鼠免疫球蛋白(a - 11029、热费希尔科学)(1:500)。最后,部分与DAPI复染色(G1012、Servicebio、武汉)。图像记录使用禅宗成像系统(蔡司,耶拿,德国)×200放大。

2.11。免疫组织化学

与PBS 3漂洗后,部分被浸泡在混合解决方案包含PBS,甲醇,30%的H₂O₂30分钟。Caspase-3 (ab2302 Abcam,剑桥,英国)(1:200)作为主要的抗体,其次是孵化与适当的二次抗体(65 - 6140年,热费希尔科学)为2 h (1: 1000)。当蔡司共焦显微镜下观察到的800年(LSM)×200放大,阳性细胞出现棕色。caspase-3阳性细胞的数量是量化使用Image-J 1.51软件(媒体控制论Inc .)有限公司)。

2.12。统计分析

数据处理是使用SPSS版本执行。26.0(美国IBM SPSS统计,芝加哥,IL),并建立了相应的图表使用GraphPad棱镜版本8.3.0 (GraphPad棱镜、圣地亚哥、钙、美国)。给出的结果 (SD)。学生的 - - - - - -测试是用于验证两组之间的任何差异。单向方差分析来确定执行3组之间的差异,以及LSD事后比较然后进行测试。一个值< 0.05被认为是一个统计上的显著差异。

3所示。结果与讨论

3.1。高效液相色谱法分析在SGD七个组件

SGD色谱建立了高效液相色谱和浓度7组件的同时测定。如图2oxypaeoniflorin albiflorin,芍药苷、甘草甙liquiritigenin,和甘草酸在230 nm,达到顶点和保留时间为13.923分钟,21.284分,22.661分钟,25.692分,44.482分,分别和55.069分钟。Isoliquiritin达到峰值360海里,和相应的保留时间为39.193分钟。根据线性回归方程7分析物(表的2),7个有效成分的相对含量SGD是列在表中3。

3.2。SGD缓解神经损伤后CI / RP的老鼠

调查SGD是否有利影响神经行为MCAO后,老鼠SGD 3天或6天处理对象。如图3,mns得分没有显著差异MCAO和SGD团体之间的第一天,在显著改善神经赤字SGD治疗后观察持续3天( )和6天( )。老鼠在虚假的组的分数是0,因为他们没有神经行为赤字。这些数据表明,SGD管理能有效地减轻功能障碍后CI / RP。

3.3。SGD刺激小胶质细胞极化M1和M2 CI / RP治疗后的老鼠

理解三天后小胶质细胞表型的变化,日SGD MCAO大鼠治疗,我们执行双重Iba1组织化学染色CD68 (M1小胶质细胞)或Iba1 Arg-1 (M2小胶质细胞)在大脑皮层和纹状体。如图4,与虚假的组相比,M1 MCAO后小胶质细胞表现出越来越明显的趋势从手术后24小时至7天在皮层( ,图4(一)在纹状体)和( ,图4 (b)),而M2小胶质细胞在大脑皮层和纹状体保持增加24小时( )4天( ),然后下降但仍高在皮层(7天 )MCAO组(数字4 (c)和4 (d))。此外,还有少数的CD68⁺小胶质细胞在大脑皮层( )和纹状体( )在6天SGD组相比MCAO组。相比之下,显著增加Arg-1观察小胶质细胞在大脑皮层( )和纹状体( )在7天SGD组相比MCAO组。一般来说,SGD抑制M1小胶质细胞,促进了M2 CI / RP后小胶质细胞。

3.4。SGD诱导M1-Like标记和海拔下降M2-Like标记

随后,M1-like标记的表达(IL-1a IL-1b, il - 6)以及M2-like标记(il - 10)被Luminex测试,存在给进一步验证所造成的表型转换SGD治疗。如数据所示5(一个)和5 (c)虚假的组相比,由Luminex IL-1a和il - 6都达到24小时( )然后展出MCAO后呈下降趋势,而IL-1b手术后4天达到最高水平( ,图5 (b))。作为一个抗炎细胞因子,il - 10浓度显著降低MCAO后24 h和4天( ,图5 (d))。最高水平的存在结果表明IL-1a出现在7 d(图5 (e)),IL-1b和il - 6似乎达到高峰在4 d ( ,数据5 (f)和5 (g))对象,而il - 10的mRNA水平仍然是降低MCAO组相比虚假的组(图5 (h))。这些趋势被逆转SGD治疗。具体而言,IL-1a的浓度明显降低,IL-1b, il - 6在为期3天的测量(IL-1a: Luminex和 中存在;IL-1b: Luminex和存在;il - 6: Luminex)和日SGD组(IL-1a: Luminex和 中存在;IL-1b和il - 6: Luminex和 存在)。相反,在il - 10的水平有显著增加后日SGD ( Luminex和存在)。结合免疫染色结果,Luminex存在,我们得出一个结论:SGD可以从M1表型驱动小胶质细胞极化对M2表型对CI / RP损伤起到保护作用。

3.5。SGD增加的表达IL-13 CI / RP的老鼠

完善,M2可以诱导小胶质细胞il - 4和/或IL-13刺激。在目前的研究中,我们发现il - 4的表达和IL-13骗局,MCAO,和SGD组1,4,手术后7天。Luminex结果显示显著增加IL-13表达发生在SGD组相比,MCAO组7天( ,图6(一)),而il - 4的表达没有明显的差异在指定的时间点( ,图6 (b))。这些发现符合存在的结果,SGD治疗6天明显升高IL-13 mRNA表达( ,图6 (c)),而不是il - 4 ( ,图6 (d))。因此认为IL-13参与SGD-evoked平方米小胶质细胞分化。

3.6。SGD激活JAK2 / STAT6通路参与IL-13-Mediated小胶质细胞极化后CI / RP的老鼠

进一步确定JAK2 / STAT6信号参与IL-13-mediated平方米小胶质细胞极化,JAK2的水平,p-JAK2, STAT6, p-STAT6被西方墨点法测量。如图7p-JAK2 / JAK2、更高水平的比率( ,数据7(一)和7 (b))和p-STAT6 / STAT6 ( ,数据7(一)和7 (c)在7天)测定SGD组相比MCAO组。这些数据暗示SGD导致IL-13表达增加,诱导小胶质细胞产生极化,可能通过JAK2 / STAT6通路。

3.7。SGD CI / RP后,凋亡细胞数量减少

发展意识SGD MCAO后细胞凋亡的影响,apoptosis-modulating蛋白bcl - 2、Bax蛋白免疫印迹和免疫组织化学caspase-3被用来标记凋亡细胞(30.]的骗局,MCAO, SGD组。如图8蛋白质水平显著下降的bcl - 2 4 d ( )和7 d ( )MCAO后相比虚假的组是在这项研究中观察到(数据8(一个)和8 (b))。同时,也有一个明显的增加,伯灵顿的表达在24小时( ),4 d ( ),和7 d ( )对象(数据8(一个)和8 (c))。SGD治疗显著升高的水平bcl - 2 d(7点 )和伯灵顿的水平下降4 d ( )和7 d ( )对象。此外,caspase-3在皮层和纹状体的表达升高在24小时,4 h, 7 h与MCAO治疗后比虚假的集团( ,图8 (d))。有统计差异caspase-3水平4 d在皮层( )和纹状体( )纹状体和7 d ( )SGD和MCAO组。总之,SGD CI / RP后治疗抑制细胞凋亡。

4所示。讨论

在目前的研究中,对脑缺血再灌注损伤SGD-induced神经保护和它的底层机制进行了探讨。目前的数据表明,SGD有利于减轻神经赤字,增加M1-to-M2小胶质细胞切换、和减少细胞凋亡。从细胞因子的浓度测量,我们证实了SGD MCAO大鼠治疗IL-13显著升高,这可能是激活下游JAK2-STAT6信号通路调节有利影响。

我们之前的研究表明,在半影SGD il - 10的表达明显增加,减少了小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,以及il - 1的生产β肿瘤坏死因子-α和单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)半影和血清,从而确认的抗炎和神经保护功能SGD CI / RP[后12]。然而,神经保护的互动SGD,小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,支持和抗炎细胞因子表达缺乏进一步的调查在我们先前的研究。与相关研究深入发展,最近已经证明活化的小胶质细胞有赞成或抗炎作用,这种双重行动是由小胶质细胞的表型改变微环境变化在受伤的大脑31日- - - - - -33]。M1-type释放促炎介质的小胶质细胞,促进神经元细胞凋亡在CI / RP,而M2表型对神经元细胞凋亡增加有抑制作用通过神经因素的生产(34- - - - - -36]。因此,促进小胶质细胞的表型转变从M1, M2是一个至关重要的因素在协助大脑恢复后CI / RP。

我们兴奋,我们观察到在这项研究中,SGD政府不仅CD68减少⁺M1小胶质细胞和M1标记(IL-1a IL-1b, il - 6),但也显著升高Arg-1的水平⁺M2小胶质细胞和il - 10 M2标志。神经学分数和细胞凋亡在SGD低组相比MCAO组。这些结果表明,SGD干预有效地诱导小胶质细胞M1, M2表型分化,从而改善功能结果。越来越多的证据表明,中药配方对CI / RP损伤发挥保护作用通过抑制M1表型和M2表型,事实上,这是中药的有效成分,从而诱导小胶质细胞极化,如人参皂苷(37,38的修改Buwang粉。在这项研究中,我们首先进行了高效液相色谱法分析SGD,提供SGD的质量控制,即揭示许多化合物在色谱概要文件。这些化合物被认为是最重要的生物活性成分SGD,和其内容决定SGD的疗效和治疗效果39),这可能有助于解释SGD治疗的疗效的差异在不同的研究。根据量化结果的高效液相色谱分析,SGD被命令的主要组件的重要性如下:芍药苷、甘草酸,甘草甙、oxypaeoniflorin, isoliquiritin albiflorin, liquiritigenin。罗等人表明芍药苷转化小胶质细胞M1, M2表现型的海马体,减少促炎介质的表达M1和M2的抗炎细胞因子的表达增加,减弱脑低灌注大鼠学习和记忆损害(40]。高等人发现,甘草甜素具有促进M2 M1小胶质细胞分化的特点促进复苏后创伤性脑损伤(41]。太阳等人在新生儿缺血大鼠模型得出同样的结论,证实了这种效应在体外(42]。Liquiritigenin降低认知障碍也被报道通过调节小胶质细胞M1 / M2过渡(43]。因此,SGD可能导致大脑修复后CI / RP通过感应平方米小胶质细胞。

正如上面所讨论的,诱导平方米小胶质细胞与il - 4 / IL-13刺激[44,45]。因此,我们测试了il - 4和IL-13表达式,根据这些结果,我们发现SGD显著增加IL-13内容,可能引发M1-to-M2表型转变参与这个保护的过程。这些发现符合几项研究显示,一个IL-13补充导致小胶质细胞的表型转换M1, M2在活的有机体内和在体外(46,47]。此外,IL-13吸引我们的是什么,而不是il - 4,参与这一过程。以前,芍药甙显示单独调节IL-13的表达减少炎症在哮喘小鼠48]。甘草甜素可能影响IL-13生产在一个LPS-induced巨噬细胞细胞系(49]。因此,IL-13 M1, M2的激活开关在大鼠MCAO后SGD处理。这个IL-13海拔可能归因于T的增强型比例helper-2 Th2细胞,IL-13的主要来源。Th2反应,分泌抗炎细胞因子il - 4和IL-13等被发现后减少CI / RP [50),导致增强的神经元死亡51,52]。Th2细胞证明改善功能障碍后CI / RP [53SGD),和一些生物活性成分,如芍药苷(54和甘草酸55已报告),调节Th2反应,从而增加IL-13的表达。值得注意的是,IL-13的表达显著差异和M1 / M2小胶质细胞发生手术后7天。因此推断,这些有益的变化引起的SGD可能调解CI / RP后长期的保护作用。

以前的研究已经表明IL-13信号是通过IL-13 Rα1和激活JAK / STAT通路,介导炎症反应和细胞生存在中枢神经系统疾病56,57]。研究建议IL-13可以激活JAK1 / STAT1途径预防创伤性脑损伤后神经元死亡和恢复脑功能(58]。统计家庭普遍认为中央开关激活M1 / M2的极化33],STAT6被认为是主要的途径参与IL-13响应(59]。在我们的研究中,我们调查了总磷酸化水平的JAK2和STAT6发现的比率p-JAK2 / JAK2和p-STAT6 / STAT6 SGD组显著上升。因此,推断,JAK2 / STAT6可能的下游效应IL-13 M1表型改变到M2表型,从而参与SGD-induced神经保护的过程。

我们的研究有一些限制。首先,高效液相色谱分析显示七成分SGD用于这项研究。在未来,我们将比较SGD Paeoniae基数和阿尔巴的影响,介绍了中药,Glycyrrhizae和单体的组件在神经功能,抗炎因子,小胶质细胞分化和细胞凋亡在活的有机体内和在体外最有效成分,从而识别SGD有助于减轻CI / RP的伤害。鉴于IL-13也可以激活Jak家庭的其他成员,如JAK1 [60),未来的研究趋向于选择IL-13敲除老鼠作为主题或外生IL-13管理在体外,为了进一步证实本研究的结论。此外,il - 10的表达也在本研究发现增强SGD治疗后。il - 10可能使M2小胶质细胞极化以及[45],目前不清楚平方米小胶质细胞极化调制的il - 4 SGD治疗后单独或与il - 10。这提供了一个新的研究方向,确定成为M2的启动子极化SGD的保护机制。

5。结论

总之,目前的研究结果显示在MCAO大鼠SGD治疗的有利影响。一般来说,SGD显著缓解神经障碍和抑制细胞凋亡。增加IL-13表达式可能激活JAK2 / STAT6信号通路改变小胶质细胞M1和M2表现型。据我们所知,这是第一个研究调查详细分子机制的抗炎效果SGD CI / RP损伤,即IL-13-JAK2 / STAT6途径诱发平方米小胶质细胞晋升。

数据可用性

本研究的所有数据都可以从相应的作者张Y。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Juanjuan陆、王杰长Yu,荣崔了同样工作。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(格兰特号码:81973612)Y.Z.和上海市自然科学基金(格兰特数量:21 zr1459200) Y.Z.