文摘

破骨细胞之间的骨体内平衡是一个动态平衡(OCs)和成骨细胞(观察)。然而,过度激活口服避孕药可能会扰乱骨内稳态。因此,有效的医疗干预对患者极大的要求。没有/鸟苷酸环化酶(GC) / cGMP信号级联之前已经报道过调节骨代谢,和GC起着明显的重要作用。Vericiguat作为小说口语可溶性鸟苷酸环化酶(国网公司)刺激器,已经在2020年首先报道治疗心力衰竭患者。然而,生物效应的Vericiguat商务尚未探索的功能。在本研究中,我们发现Vericiguat浓度介于0和8μM是noncytotoxic骨骨髓来源monocyte-macrophage血统(桥梁养护管理系统)。Vericiguat可以提高商务的分化在500 nM的浓度,而它抑制OC分化8μm .此外,Vericiguat还显示双重影响OC融合和骨吸收剂量依赖性的方式。此外,分子试验表明,双重监管Vericiguat对商务的影响是由我的双向激活κB -α/ NF -κB信号通路。综上所述,我们的研究证明了双重Vericiguat对功能性OCs的形成的影响。监管Vericiguat对商务的影响是通过我的双向调制κB -α/ NF -κB信号通路,一个潜在的我之间的平衡κB -α/ NF -κB信号通路和国网公司/ cGMP / VASP可能存在。

1。介绍

骨组织发生动态变化,通过新骨形成成骨细胞老化(突发)和骨消除由破骨细胞(OCs) [1,2]。相反,过度激活OCs将触发口服观察之间的不平衡,从而导致溶骨的骨疾病,如骨质疏松症(3]。集体、代理商针对商务仍抑制活化的临床要求。

Osteoclastogenesis明显骨吸收所必需的。通常,口服避孕药与骨骨髓来源进行了区分monocyte-macrophage血统(桥梁养护管理系统)、巨噬细胞集落刺激因子的刺激下(MCSF)和受体激活核因子-κB配体(RANKL) (3,4]。MCSF结合RANKL将进一步激活下游信号通路,增殖蛋白激酶(MAPK), NF -κB通路,PI3K / AKT通路(5,6]。然后,激活途径可以激活核转录因子的激活T细胞胞质1 (NFATc1)和c-Fos。这两个因素诱导的表达OC-specific标记,包括抗酒石酸酸性磷酸酶(陷阱),组织蛋白酶K (CTSK)、降钙素受体(CTR),和树突特异性跨膜蛋白(DC-STAMP) [7]。因此,成熟的商务会产生一个紧密密封区通过f -肌动蛋白和分泌相关酶的形成到其密封区完成骨吸收(7]。因此,代理商针对RANKL /等级信号级联是有效的策略来治疗OC-related骨骼疾病。

先前的研究已经表明,没有被广泛参与调节骨代谢通过直接激活鸟苷酸环化酶(GC)。Rangaswami等人曾经报道,机械刺激可以诱发OB扩散通过NO /国网公司/ cGMP (cGMP)信号级联8]。此外,没有证明规范的流动性和超然OCs浓度的方式通过cGMP [9]。然而,激活氧化应激介导的没有限制了它的临床应用(10]。因此,调节细胞的活动GC可能治疗骨质疏松症提供了一个新颖的视角。事实上,动物实验由约书亚等人建议用可溶性GC治疗(国网公司)活化剂可以减弱雌激素deficiency-induced骨质流失(11]。最近的一项研究报告称,药物激活国网公司在一个没有——或者heme-independent方式可能是一个新的治疗策略抑制牙骨质损失(12]。Vericiguat,小说口服可溶性鸟苷酸环化酶(国网公司)刺激器,已经首先报道能减少心血管疾病的死亡发生率或住院治疗心脏衰竭患者(2020年13,14]。然而,Vericiguat对口服避孕药的作用的影响仍然是难以捉摸的。

因此,本研究旨在调查在OC Vericiguat分化的生物效应和潜在的分子机制,这将为未来的骨相关疾病的治疗提供新的参考。

2。材料和方法

遵守所有动物实验研究来指导原则和依法进行国家研究委员会的指导护理和使用实验动物。

2.1。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMM)隔离

这种方法已经详细描述了在我们之前的研究15]。简单地说,整个骨髓液使用无菌小鼠股骨和胫骨的刷新5毫升注射器与完成αmem (30 ng / ml - csf),然后在T-25厘米长大的²瓶为5天。贴壁细胞的桥梁养护管理系统。收获的桥梁养护管理系统被用于后续的实验。

2.2。细胞生存能力分析

这种方法已经详细描述了在我们之前的研究15]。Vericiguat用于本研究这是购自MedChemExpress (hy - 16774)。Vericiguat细胞毒性的桥梁养护管理系统被使用CCK-8化验检查工具包(Dojindo生物技术研究所、熊本、日本)。简而言之,桥梁养护管理系统被播种在96孔板(4 - 细胞/ 24小时)。然后,桥梁养护管理系统添加Vericiguat(0、10、20、50、100、200和500 nM和1,2,4,8和10μ米)另一个24小时。随后,桥梁养护管理系统与100年孵化μl CCK-8测试解决方案在一个37°C 2 - 3 h的孵化器。的吸光度检测波长450 nm。

2.3。OC分化测定体外

培养了桥梁养护管理系统的密度在96 - 10000细胞/板。RANKL (50 ng / ml)无民事行为能力人或者Vericiguat (0, 100μ米、500 nM、1μ米2μ米,4μ8 M,μ米)添加在第二天6 d。重组mouse-derived csf和RANKL从Novoprotein购买科学有限公司(浦东新区,中国)。OC的识别评估陷阱染色使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色工具包(Sigma-Aldrich生物技术研究所,圣路易斯,密苏里州,美国)。TRAP-positive细胞使用光学显微镜观察和成像(尼康,东京,日本)。

2.4。f -肌动蛋白环试验和骨吸收坑试验

详细描述了这两种方法在我们之前的研究15]。简单地说,商务是用4%多聚甲醛固定成熟10分钟,其次是透化作用在0.1% Triton x - 100的另一个10分钟左右,然后孵化phalloidin稀释溶液(G1028 Servicebio,武汉,中国)在黑暗中2 h。核与DAPI染色法染色。f -肌动蛋白带使用荧光显微镜检测。

骨吸收试验、桥梁养护管理系统融合后,同等数量的商务被移植到康宁骨的融合分析表面多个好板(美国纽约康宁,Inc .,康宁)。OC粘附后,细胞接受0和500海里和8μM Vericiguat 2 - 3天。随后,盘子上的细胞被消除。再吸收区域的百分比在完全随机测量三个吸收网站使用ImageJ从三个独立的实验(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。

2.5。实时定量PCR(存在)

这种方法已经详细描述了在我们之前的研究15]。使用RNA提取细胞总RNA是收获工具包(Magen, Inc .,广州,中国)。后天mRNA当时逆转使用HiScript®三世RT SuperMix为qPCR工具包(R323-01 Vazyme,南京,中国)。随后,信使rna表达水平检测到存在使用SYBR qPCR大师混合(Q711-02 Vazyme,南京,中国)。反应条件是在我们之前的研究报告如下:一个周期为30年代在95°C(步骤1),紧随其后的是40周期在95°C 10年代和60°C 30年代(步骤2)。所有的实验都重复3次,和GAPDH被用来作为内部参考。使用的引物序列中存在分析如表所示1。

2.6。免疫印迹

调查在osteoclastogenesis-related Vericiguat信号通路的影响,pre-OCs被使用αmem (nonserum和csf) 2小时后跟Vericiguat (0, 100 nM 200 nM 500 nM, 2μ8 M,μ米)3 - 4小时,然后BMM细胞孵化和RANKL (50 ng / ml) 30分钟。的蛋白表达水平的c-Fos NFATc1, RANKL与Vericiguat (50 ng / ml) (0、100 nM、500 nM, 1μ米2μ米,4μ米,6μ8 M,μ米)被添加到桥梁养护管理系统3天。此外,确认Vericiguat(500海里和8的影响μ米)的蛋白表达NFATc1 c-Fos,我们也评估了细胞质和核蛋白质表达的NFATc1 0, 2和4天。

蛋白质提取的方法已经详细描述了在我们之前的研究15]。细胞溶解在桥梁养护管理系统,在冰里帕,和使用蛋白质的蛋白量量化测量工具(Beyotime理工学院,上海,中国)。总共有20 - 30μg蛋白每车道通过电泳分离(10%钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶,80 V, 110分钟)。随后,分离蛋白乐队被转移到聚偏二氟乙烯膜(美国马EMD微孔,Billerica)为100分钟,100 V的电压。接下来,阻塞是由使用5%脱脂牛奶(美国表达载体,圣地亚哥,CA)溶解在Tris-buffered saline-Tween 3小时适当28°C。然后,PVDF膜洗了三次使用TBST(5分钟/时间)。膜被沉浸在特定主要抗体在4°C的一个晚上。第二天,膜被淹没在二级抗体(山羊对兔子和老鼠,1:1000 - 5000)在适当的为2 - 3小时28°C。最后,乐队被抓获的蛋白质使用成像系统(5200年版本,Tanon科技有限公司,有限公司,上海,中国。

具体主要抗体在本研究中主要包括伯灵顿(342772年,17 kDa;Zenbio,成都,中国,1:500),bcl - 2(250198年,26 kDa;Zenbio,成都,中国,1:500),NF -κ# 8242,B p65 (D14E12细胞信号技术,Inc ., 3查斯克巷,丹佛,美国),p-p65 (Ser536;# 3033,细胞信号技术,Inc ., 3查斯克巷,丹佛,美国),Ik-Ba(380682年,35 kDa;Zenbio,成都,中国,1:1000),p-Ik-Ba(340776年,35 kDa;Zenbio,成都,中国,1:1000),ERK1/2 (201245 - 4 - a4, 42/44 kDa;Zenbio,成都,中国,1:1000),p-ERK1/2 (301245 kDa 42/44;Zenbio,成都,中国,1:1000),p38(200782年,43 kDa;Zenbio,成都,中国,1:500),p-p38(310069年,43 kDa;Zenbio,成都,中国,1:1000)、物(381100 kDa 46/54;Zenbio,成都,中国,1:1000),p-JNK (380556 kDa 46/54;Zenbio,成都,中国,1:1000),c-Fos (9 f6, # 2250,细胞信号技术,Inc ., 3查斯克巷,丹佛,美国),NFATc1 (# 8032; D15F1, Cell Signaling Technology, Inc., 3 Trask Lane, Danvers, USA), AKT (#4691; D15F1, Cell Signaling Technology, Inc., 3 Trask Lane, Danvers, USA), p-AKT (#4060; D15F1, Cell Signaling Technology, Inc., 3 Trask Lane, Danvers, USA), mTOR (380411, 289 kDa; Zenbio, Chengdu, China, 1 : 500), p-mTOR (381548, 289 kDa; Zenbio, Chengdu, China, 1 : 500), GAPDH (#5174, D16H11, Cell Signaling Technology, Inc., 3 Trask Lane, Danvers, USA), and histone H3 (250182, 15 kDa; Zenbio, Chengdu, China, 1 : 1,000).

2.7。核易位的NF -κB p65化验

这种方法已经详细描述了在我们之前的研究15]。简而言之,潜伏在桥梁养护管理系统αmem(无血清和csf) 2小时,然后,井与Vericiguat添加(0、500 nM和8μ米)为3小时,其次是刺激有或没有RANKL (50 ng / ml) 30分钟。随后,桥梁养护管理系统是用4%多聚甲醛固定30分钟,permeabilized 30分钟特里同x - 100年的0.1%。接下来,细胞被综合在脱脂牛奶(5%)PBST 2 - 3小时,其次是孵化与p65主要抗体在4°C的一个晚上。最后,细胞加上FITC-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白(Servicebio,武汉,中国)50分钟,然后,细胞核与DAPI染色(σ;圣路易斯,密苏里州,美国)5分钟。细胞被洗了三次用PBS和使用激光扫描共焦显微镜成像。

2.8。转染的si-VASP

的siRNA VASP设计并从GenePharma购买(上海,中国)。si-RNA转染到细胞通过Lipofectamine 3000(美国热费希尔科学)。信使rna和蛋白质的表达是评估24小时和48小时后,分别。击倒的最高效率的VASP如下:正向(GAGCCAAACUCAGGAAAGUTT)和反向(ACUUUCCUGAGUUUGGCUCTT)。

2.9。分子建模实验

分子建模实验使用Schrӧdinger大师9.0包。受体对接(滑移),结合蛋白质结构预测,用于分析配体和受体的灵活性是基于程序'。为了准备蛋白质,蛋白质制备向导程序被用来准备IKKβcocrystal结构通过薛定谔大师套件之前执行对接实验。水分子是首先从晶体结构中删除,其次是添加氢原子,然后,使用OPLS_2005力场精制合成结构。最小化结束与氢。随后,受体电网准备选项出现在滑翔是利用生产蛋白质的网格,网格和蛋白质随后应用于对接实验。范德瓦耳斯半径比例因子设置为1.0(0.25部分电荷截止)。配体的制备与LigPrep大师9.0和OPLS_2005力场。Epika用于生产可能状态的目标 。配体对接选项用于滑翔了第一轮对接实验。在设置方面,XP(额外精度),“码头灵活,”“样品氮倒置,”“样品环构象,”和“Epik国家处罚”对接的分数被选中。

2.10。建立卵巢切除术(OVX)诱导骨质疏松模型体内Vericiguat和治疗效果的评价

这个过程已经被报道在我们之前的研究15]。根据研究设计,随机分为四组(C57BL / 6 ):虚假的集团(模拟操作和DMSO溶液注入),OVX组与DMSO溶液注入(OVX),低剂量组(OVX与低剂量Vericiguat 5μ克/公斤/天),高剂量组(OVX大剂量Vericiguat, 10μ克/公斤/天)。实验结束后,股骨收集microcomputed断层扫描(ct机)分析(15]。此外,后μCT分析,样本进一步脱钙骨EDTA溶液(10%)为另一个4周,然后嵌入在石蜡块后续的分割。部分被沾染了苏木精伊红染色或陷阱。口服避孕药的面积和数量是量化使用ImageJ软件(National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)(15]。

3所示。统计分析

统计分析进行了通过GraphPad棱镜8 (GraphPad软件有限公司;拉霍亚,CA)。提出了量化的数据 。所有的实验都重复独立至少三次。单向方差分析(方差分析)进行,其次是Student-Neuman-Keuls事后考验。一个值< 0.05被认为是表明统计差异。

4所示。结果

4.1。细胞毒性Vericiguat对桥梁养护管理系统的影响

图1显示了Vericiguat的化学结构(图1(一))。细胞生存能力检测使用CCK-8可行性分析,我们发现Vericiguat低于8μ桥梁养护管理系统显示没有细胞毒性,IC₅₀是746μ(数据1 (b)和1 (c))。此外,我们评估apoptosis-related标记物的表达,伯灵顿和bcl - 2,发现类似的结果的CCK-8试验(数字1 (d)和1 (e))。上述结果表明,浓度范围之间的Vericiguat 0和8μM noncytotoxic桥梁养护管理系统。

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图1

分子结构和细胞毒性Vericiguat骨骨髓来源monocyte-macrophage血统(桥梁养护管理系统)。(一)Vericiguat的分子结构;(b) BMM细胞生存能力被CCK-8 Vericiguat浓度检测与显示治疗后24 h。数据了 ( )。(c)集成电路₅₀值Vericiguat对桥梁养护管理系统。(d, e)的影响Vericiguat apoptosis-related标记,伯灵顿和bcl - 2,在桥梁养护管理系统和定量结果( )。 表示与对照组比较(0海里): , , ,和 。

4.2。双重影响的Vericiguat RANKL-Induced Osteoclastogenesis体外

根据上述结果,我们探讨了商务体外Vericiguat对RANKL-induced功能的影响。如图2(一个)OCs的Vericiguat增强差异化的浓度100海里,500 nM, 1μ在4米,但它抑制分化μ米和8μ米的商务(数据的数量和大小2(一个)和2 (b))。

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图2

Vericiguat双重监管RANKL-triggered体外破骨细胞的形成。(一)代表的图像TRAP-positive破骨细胞(红圈)和RANKL刺激后,表示Vericiguat浓度( )。图像作为消极的控制(桥梁养护管理系统没有RANKL)。(b)的数量和大小的陷阱⁺多核破骨细胞被量化。 三个独立的实验手段。表示与对照组比较(没有RANKL和Vericiguat): , , ,和 。#表示比较组只RANKL和组和RANKL Vericiguat:^# , ^{# #} , ^{# # #} ,和^{# # # #} 。ns:不具有统计学意义。 。

这些结果表明Vericiguat上方显示双重影响RANKL-induced osteoclastogenesis体外。

4.3。Vericiguat双重监管RANKL-Mediated OC形成和骨吸收浓度的方式

f -肌动蛋白带的形成已经成熟的商务(最典型的特征15]。如图3、成熟的商务环(图构成的典型3(一个))。然而,周围的f -肌动蛋白带OCs Vericiguat在低浓度的增加(500海里),但降低Vericiguat的浓度高时(8μ米)(图3(一个))。f -肌动蛋白的数量和大小带FITC-phalloidin染色(数据也显示出类似的趋势3 (b)和3 (c))。

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图3

Vericiguat双重监管f -肌动蛋白的形成环和破骨细胞的骨吸收。(一)代表的图像F-actin-stained破骨细胞RANKL的刺激下7 d 500 nM和8μM Vericiguat,分别。(b) f -肌动蛋白的平均数量和面积环(c) ( )。(d)代表图像的骨吸收(白色区域环绕的红色虚线)通过成熟的破骨细胞。(e)骨吸收区域被量化。给出的值 ( )。 表示与对照组比较(Vericiguat 0海里): , , ,和 。 。

此外,我们探讨Vericiguat是否能影响OCs的骨吸收。桥梁养护管理系统发展到板(csf 30 ng / ml, RANKL 50 ng / ml) Vericiguat不同浓度。作为显示在图3,骨吸收的面积扩大在低浓度(500海里),但Vericiguat减少Vericiguat的浓度高时(8μ米)(图3 (d)和3 (e))。

集体,Vericiguat显示双重影响RANKL-induced f -肌动蛋白带的形成和骨吸收浓度的方式。

4.4。Vericiguat双重监管RANKL-Mediated OC Osteoclastogenesis期间标记基因表达

治疗后与Vericiguat (0、100 nM、500 nM, 2μ米,4μ8 M,μ米),OC标记基因的mRNA表达显著调节在低浓度组(100 nM、500 nM和2μ在osteoclastogenesis M),包括c-Fos NFATc1,陷阱,DC-STAMP, CTR, CTSK。相反,这些基因的mRNA表达显著下调高浓度组(4μ米和8μ米)(图4(一))。

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图4

Vericiguat双重监管RANKL-triggered osteoclast-specific基因表达在破骨细胞的形成。(a)的相对mRNA表达破骨细胞标记基因(CTR c-Fos NFATc1,陷阱,CTSK,和DC-STAMP)在桥梁养护管理系统处理RANKL + MCSF Vericiguat浓度表示,三天被存在量化( )。给出的值 。 表示与对照组比较(Vericiguat 0海里): , , ,和 。(b, c)免疫印迹分析结果OC-related标记的蛋白质表达水平包括c-Fos和NFATc1 BMM细胞RANKL 5 d没有刺激或与Vericiguat表示浓度和定量结果( )。 表示与对照组比较(Vericiguat 0海里): , , ,和 。(d, e)细胞质和核分数的桥梁养护管理系统处理30 ng / mL - csf, 50 ng / mL RANKL和Vericiguat (500 nM和8μ0米),2,4 d,分别被免疫印迹分析和定量的结果。GAPDH和组蛋白H3被用作核和细胞质加载控制,分别是( )。 表示与对照组比较(Vericiguat 0海里)的蛋白表达后第四天的胞质内NFATc1刺激: 和 。#表示与对照组比较(Vericiguat 0海里)的蛋白表达NFATc1在细胞核刺激后第四天:^{# # # #} 。(f)免疫荧光结果的核易位NFATc1刺激后第四天表明Vericiguat NFATc1低浓度促进了核易位,而高浓度Vericiguat抑制这种作用。ns:不具有统计学意义。 。

RANKL的诱导和激活导致NFATc1 c-Fos, osteoclastogenesis[的两个关键因素16]。合成,我们探索Vericiguat的影响这两个标记的蛋白表达。免疫印迹结果显示,这两个标记的表达在低浓度(100 nM-2增强μ在高浓度(8米),但降低了μ米),与上面存在的结果(数据一致4 (b)和4 (c))。NFATc1核易位施加一个关键的角色在OC-related基因的转录的规定,如DC-STAMP、陷阱,CTR, CTSK [17]。免疫印迹建议RANKL触发NFATc1易位到原子核在OC分化时间的方式(数字4 (d)和4 (e))。Vericiguat促进了RANKL-induced核易位NFATc1低浓度组(500海里),而这种效应在高浓度抑制组(8μ米)(图4 (d)和4 (e))。免疫荧光结果的核易位NFATc1刺激后第四天显示出类似的倾向于免疫印迹(图的结果4 (f))。

因此,这些结果证实Vericiguat的双重影响RANKL-induced osteoclastogenesis体外。

4.5。Vericiguat双重监管RANKL-Induced激活的NF -κB信号级联

如图5,RANKL显著诱导激活的NF -κB信号通路,MAPK信号通路(p38、物和ERK),和一种蛋白激酶信号通路(数据5(一个)和5 (b))。识别这些信号通路的变化在OC开发与Vericiguat刺激后,我们检查了这些关键通路的激活。作为显示在图5我的激活κB -α/ p65信号通路被浓度的方式Vericiguat双重监管。我的磷酸化κB -α和p65增强低浓度组(100 nM-2μ在高浓度(8米),但降低了μ米)(图5 (c)和5 (d))。此外,初核易位后p65 RANKL刺激有或没有确定的Vericiguat immune-fluorescent染色建议增加趋势在低浓度和高浓度的下降趋势(图5 (e))。然而,MAPK (p38、物和ERK)信号通路和一种蛋白激酶信号通路被Vericiguat刺激(数据不受影响5 (f)和5 (g))。

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图5

Vericiguat双重监管RANKL-triggered激活的我κB -α/ NF -κB信号通路。(a, b)的免疫印迹结果osteoclast-related信号通路(NF -的表达κB, AKT、MAPK)有或没有RANKL刺激( )。 表示一个没有RANKL与对照组进行比较。免疫印迹结果(c, d)我的表达κB -α和NF -κ治疗后B在桥梁养护管理系统和RANKL (50 ng / ml) 30分钟后跟Vericiguat表示浓度。(e)的免疫荧光染色RANKL-induced P65核易位有或没有Vericiguat浓度表示。(f, g)免疫印迹和量化结果MAPK和AKT的桥梁养护管理系统和RANKL治疗后(50 ng / ml) 30分钟后跟Vericiguat表示浓度。 三个独立的实验手段。表示与对照组比较(Vericiguat 0海里): , , ,和 。ns:不具有统计学意义。 。

综上所述,上述结果表明,Vericiguat参与OC通过双重调节激活我的分化κB -α/ NF -κB信号通路。

4.6。OC分化VASP至关重要,Vericiguat VASP可以提升的表达

过度激活国网公司会诱导激活VASP (vasodilator-stimulated磷)18]。因此,我们评估的表达在桥梁养护管理系统,发现VASP VASP表达的增加引起剂量依赖性的方式和RANKL Vericiguat(图6(一))。为了研究潜在的双重调节Vericiguat对OC分化的影响,我们首先评估VASP在桥梁养护管理系统由RANKL的表达,发现RANKL可以剂量依赖性增加VASP(数据的表达6 (b)和6 (c))。此外,成熟的OC VASP高度表达,VASP细胞膜周围的蛋白质主要是分布(图6 (d))。然而,OC分化显著干扰后沉默的表达VASP通过核在桥梁养护管理系统,如图所示,表达下调OC-related标记基因的表达(c-FOS NFATc1,陷阱,β3-integrin)(数据6 (e)- - - - - -6 (m))。上述结果表明,VASP OC分化至关重要。然而,Vericiguat的奖励的效果只在p-p65的数量被VASP沉默(数字6 (n)和6 (o))。值得注意的是,在MCSF和RANKL VASP沉默之后,Vericiguat的奖励的效果(500μ米)在OC分化也被封锁,而Vericiguat(8的抑制效果μ米)对破骨细胞分化增强(图6 (p))。上述结果表明VASP可以调解的奖励的效果Vericiguat p65磷酸化的低浓度下有或没有MCSF和RANKL的存在。

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图6

破骨细胞分化VASP至关重要,可以由Vericiguat VASP的表达。(一)VEGT增强VASP的表达是剂量依赖性的方式( )。(b, c) RANKL的表达增强VASP是剂量依赖性的方式和定量结果( )。 表示一个没有RANKL与对照组进行比较。(d)免疫荧光VASP在桥梁养护管理系统或没有RANKL的位置。在桥梁养护管理系统(e)的mRNA表达VASP治疗后核( ); 表示与对照组比较(si-NC)。(f, g) VASP蛋白表达的桥梁养护管理系统治疗后核和定量结果( )。 表示与对照组比较(si-NC)。(h l) OC-related基因的mRNA表达在桥梁养护管理系统治疗后核( )。 表示与对照组比较: , , ,和 。#表示比较与si-NC组与si-VASP组:^# , ^{# #} , ^{# # #} ,和^{# # # #} 。(m) osteoclast-related基因的蛋白表达在桥梁养护管理系统的小干扰rna和定量结果(治疗后 )。(n, o)的表达NF -κB蛋白在桥梁养护管理系统有或没有siRNA-VASP Vericiguat处理( )。(p)的mRNA表达osteoclast-related基因(NFATc1、陷阱和β3-Integrin) siRNA-VASP-induced桥梁养护管理系统与siRNA-NC-induced桥梁养护管理系统( ); 表示与对照组比较(Vericiguat 0海里)siRNA-NC组和si-VASP组,分别为: , , ,和 。#表示比较siNC-induced组和si-VASP-induced组在同一浓度Vericiguat:^# , ^{# #} , ^{# # #} ,和^{# # # #} 。 。

4.7。双重生物效应的Vericiguat OC形成和骨吸收通过VASP和NF -之间的平衡κB

然而,大剂量对OC Vericiguat分化的抑制作用尚不清楚。此外,我们探讨了NF -的表情κ桥梁养护管理系统B信号级联处理Vericiguat只,发现Vericiguat也会调节NF -的激活κB没有MCSF和RANKL(数字7(一)和7 (b))。关于高压高浓度Vericiguat对OC分化的影响,我们推断高剂量Vericiguat可以直接打扰NF -的激活κB信号级联。因此,我们引入了分子建模实验,发现Vericiguat IKK的配体具有相似的分子结构β,可以直接绑定到ATP结合IKK的口袋里β通过氢键激酶结构域的功能。然而,Thr23结合位点,但不激活站点,Cys99,这可能是抑制作用的原因的Vericiguat OC分化在高浓度(图7 (c))。此外,阻塞p65的激活也可以扰乱奖励的Vericiguat对OC分化的影响,提高对OC Vericiguat分化的抑制效果(数字7 (e)和7 (f))。在这里,我们假设Vericiguat可能调节通过VASP / NF - OC分化κB信号串扰。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

图7

双重Vericiguat对破骨细胞分化和骨吸收的影响通过VASP和NF -之间的平衡κb (a, b)的表达NF -κB蛋白在桥梁养护管理系统只接受Vericiguat ( )。 表示与对照组比较(Vericiguat 0海里)。(c) (A)的预测最优绑定方式Vericiguat IKK的ATP结合位点β蛋白质;氢键(黄线)。(B) MOLCAD表示显示表面分子的亲脂性的潜在的生物活性造成Vericiguat IKK的ATP结合位点β。蓝色代表亲水,红色代表亲脂性的,灰色代表中立的一部分。氢键是显示为黄线。(C)的重叠分析Vericiguat IKK的配体β和参与氨基酸残基(Thr23)明显。桥梁养护管理系统(d)的陷阱染色RANKL-induced对待Vericiguat NF -有或没有κB抑制剂ROC-A。(e, f)的表达NF -κB在RANKL-induced桥梁养护管理系统处理Vericiguat NF -有或没有κB抑制剂ROC-A。 。

综上所述,在低浓度,Vericiguat主导性显示奖励的影响通过VASP / NF - OC分化κB信号轴,而在高浓度、IKK Vericiguat绑定的增加β激酶将导致p65的失活和抑制OC分化(图8)。

图8

双重效应的Vericiguat RANKL-induced osteoclastogenesis和分子机制。可能有一个潜在的我之间的平衡κB -α/ NF -κB信号通路和国网公司/ cGMP / VASP桥梁养护管理系统。Vericiguat在低剂量(0 - 2μmol / l)增强RANKL-induced osteoclastogenesis主导性通过upregulation VASP /我κB -α/ NF -κB信号通路,而在高剂量Vericiguat(4或8μmol / L)抑制RANKL-induced osteoclastogenesis通过直接抑制了我κB -α/ NF -κB信号通路信号级联,这可能扰乱VASP-mediated激活我的κB -α/ NF -κB信号通路。

4.8。验证的影响Vericiguat OVX-Induced骨质流失体内

如图9、BMD的ct机结果BS / BV, BV /电视,结核病。N,结核病。Th和结核病。Sp建议OVX小鼠表现出明显的骨小梁的损失,而这种效应被Vericiguat恢复管理、低或高剂量(数字9(一个)和9 (b))。然而,低浓度的奖励的效果在OC Vericiguat分化体外体内不一致的结果。我们推断,可能有两个原因。首先,Vericiguat体外的高低浓度不能被视为等于低和高剂量体内。其次,cinaciguat,同样的Vericiguat,据报道促进OB分化,提高OVX-mediated骨质流失(11]。因此,Vericiguat proosteogenic效应可能在一定程度上抵消probony吸收低浓度。皮质骨的分析参数,BMD, BV /电视,Ct。th, Ct。基于“增大化现实”技术,Th。一个r, and Ct.Ar/Th.Ar, showed that OVX decreased the amount of cortical bone, whereas Vericiguat, especially at high doses, ameliorates the effect caused by OVX compared to the OVX group and sham group (Figures9 (c)和9 (d))。共同的生物效应Vericiguat体外不等于这些体内由于复杂的体内环境。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图9

验证的影响在OVX-induced Vericiguat骨质流失体内表示通过微观结构分析。(一)代表的三维图像μCT的小鼠股骨假组(模拟操作和DMSO溶液注入),OVX组与DMSO溶液注入(OVX),低剂量组(OVX与低剂量Vericiguat 5μ克/公斤/天),高剂量组(OVX大剂量Vericiguat, 10μ克/公斤/天)( )。(b)的定量结果骨结构参数,包括小梁骨矿物质密度(BMD, g / cc),骨表面积/总量(BS /电视;%),骨体积/总量(BV /电视;毫米⁻¹),小梁数目(Tb.N;毫米⁻¹),小梁间距(Tb.Sp;毫米),小梁厚度(Tb.Th;所选metaphyseal区域(毫米) )。(c)代表的三维图像μ小鼠股骨CT(皮质骨)从上面不同的群体。(d)的定量结果骨结构参数,包括皮质骨矿物质密度(BMD;g / cc),骨体积/总量(BV /电视;毫米⁻¹),总横截面积内骨膜信封(Tt.Ar;毫米²),皮质骨区域(Ct.Ar;毫米²),皮质面积分数(Ct.Ar / Tt。基于“增大化现实”技术;%),平均皮质厚度(Ct.Th;毫米)。表示虚假的比较组: 和 。#表示比较VEGT-L / H组和OVX组在同一浓度Vericiguat:^{# #} , ^{# # #} ,和^{# # # #} 。ns:不具有统计学意义。

组织学分析,他走时染色的股骨建议收集骨小梁面积在OVX小鼠明显下降,而老鼠对待Vericiguat显示骨小梁面积(图的明显改善10 ())。陷阱染色显示明显增强总数量和面积的陷阱⁺口服避孕药在骨小梁OVX小鼠,而Vericiguat面积和陷阱的数量减少⁺商务/骨表面积(图10 (b))。

(一)

(b)

(一)
(b)

图10

验证的影响在OVX-induced Vericiguat骨质流失体内组织学分析所示。(a)代表)染色和陷阱的图像区域内所选metaphyseal染色的骗局,OVX组、低剂量组和高剂量组( )。(b)的数量和面积的陷阱⁺细胞/骨表面被量化。 , , ,和 。 。

5。讨论

过度激活的口服避孕药可能导致各种OC-related疾病,如风湿性关节炎和骨质疏松症(19- - - - - -22]。因此,及时治疗针对大一是必要的治疗OC-related疾病(23,24]。本研究首先表明Vericiguat双重监管OC分化和骨吸收鼠标通过双向影响的激活我的桥梁养护管理系统κB -α/ NF -κB信号通路和核易位NFATc1剂量依赖性的方式。据报道,事实上,有丰富的代理根据浓度(具有双重影响25]。的大一,黄芩苷被报道对OC的形成起到双重作用浓度的方式(26]。化合物具有双重效应具有重要的临床应用。因此,分析影响Vericiguat OCs的分化可能会加深我们的理解之间的关系的药理作用与剂量Vericiguat对骨代谢,还提供一些医学参考未来Vericiguat心血管疾病的临床应用。

没有/ GC / cGMP信号级联已被广泛报道在调节骨代谢,和GC中起着显著的关键作用27,28]。然而,存在争议的效果没有/ GC / cGMP OCs (27- - - - - -30.]。Yaroslavskiy等人曾经报道NO-stimulated OC运动性低浓度,而在高浓度时,没有OC超然和终止吸收造成的。这种效应是通过GC / cGMP VASP级联(9]。约书亚的另一个研究小组报道,cinaciguat(湾58 - 2667),一个原型直接国网公司的催化剂,可以反向OVX-induced骨细胞凋亡一样有效雌二醇和促进体内骨形成11]。然而,他们发现antiosteoporosis OB cinaciguat与增强功能密切相关,但不与OCs的变化(11]。然而,荷马等人发现,口服的国网公司受体激动剂可以增加口服避孕药的中轴骨骨吸收Sprague-Dawley老鼠(31日]。事实上,经过仔细研究数据呈现在约书亚的研究中,我们发现关于口服避孕药的数量下降趋势OVX侵蚀面⁺cinaciguat集团与OVX组相比,尽管他们证明无统计差异。首先,我们推断他们的小鼠模型中使用的剂量(10μ克/公斤/天)可能不会达到的关键点。事实上,剂量可以在动物(10毫克/公斤/天32]。其次,cinaciguat可以口服吸收,但他们选择了ip注入。第三,他们没有执行关于口服避孕药体外实验。此外,异常高标准差有关商务和侵蚀表面的数量也会影响真正的统计结果。因此,SC活化剂对口服避孕药的确切机制需要进一步调查。在这目前的体外研究中,我们发现Vericiguat可以增强RANKL-induced功能OC的形成在低浓度下,而这种影响是转换为抑制作用在桥梁养护管理系统与Vericiguat cocultured高浓度。更重要的是,Vericiguat也有双重监管影响RANKL-induced微能力。总的来说,这些结果表明,Vericiguat双重监管OC分化和骨吸收鼠标桥梁养护管理系统。

在pre-OCs RANKL与受体结合的等级之后,RANKL激活核受体NFATc1 c-Fos [7]。NFATc1之一RANKL-mediated OC分化的关键转录监管机构(33]。激活后,NFATc1将把进入细胞核和诱发OC-specific基因的表达,包括DC-STAMP,陷阱,CTSK, CTR [4,34]。我们的研究表明,Vericiguat双重监管RANKL-induced NFATc1表达式及其核易位在OC分化。此外,类似的趋势有关OC-specific mRNA表达变化的基因(CTSK DC-STAMP,陷阱,CTR)也证实osteoclastogenesis Vericiguat的双向调节作用。osteoclastogenesis期间,c-Fos也是一个重要的中介osteoclastogenesis [4,34]。同时,c-Fos还参与调节NFATc1[的部分功能4,34]。在现在的研究中,Vericiguat显示类似的监管影响RANKL-triggered c-Fos在mRNA和蛋白的表达水平。综上所述,上述结果表明Vericiguat的双重影响RANKL-induced成熟OC形成通过调节的转录活动c-Fos NFATc1和下游关键OC-related基因表达。

在OC分化,NF -κB, MAPK (ERK, p38和物,和一种蛋白激酶信号通路是极度RANKL刺激后激活(7]。有趣的是,在这个研究中,我们发现Vericiguat双重监管的磷酸化NF -κB和核易位p65是剂量依赖性的方式,在不影响MAPK和一种蛋白激酶信号通路。国网公司催化剂可以增加pf国网公司,将过度诱导激活VASP [18]。进一步阐述了潜在的监管机制Vericiguat NF -监管κB通路,我们发现增加VASP诱导Vericiguat只有或RANKL的表达方式存在剂量依赖的相关性。此外,体外实验表明VASP OC分化至关重要,符合最近的一项研究从胡锦涛et al。35]。此外,我们还发现Vericiguat只能双重调节NF -的激活κb .然而,Vericiguat的奖励的效果的表达式p-p65被推倒VASP,表明VASP可能参与OC通过增加激活的NF -分化κB信号级联。然而,随着剂量的增加Vericiguat对桥梁养护管理系统,这种奖励的效果消失了。分子建模实验的结果证实了我们的假设,高剂量Vericiguat可能直接扰乱NF -激活的κB信号级联。事实上,Flores-Costa等人报道,另一个国网公司刺激器,praliciguat,也可以减少我的磷酸化κB和NF -κB发挥抗炎效应(35]。我们推断Vericiguat可能主激活国网公司/ VASP /我κB -α/ NF -κB信号通路在低浓度。然而,随着剂量对桥梁养护管理系统,Vericiguat将直接绑定到IKKβ抑制核转录因子-κB (NF -κB)活动。因此,我的喜悦之间的平衡κB -α/ NF -κB信号通路和国网公司/ cGMP / VASP可能存在。

尽管有这些上面有前景的结果,本研究有一些局限性。首先,本研究证明osteoclastogenesis Vericiguat的双重影响,这是不符合大多数以前的研究,没有/国网公司/ cGMP抑制OC分化和成熟。我们提出了一种喜悦我之间的平衡κB -α/ NF -κB信号通路和国网公司/ cGMP / VASP。在低浓度,增强效果RANKL-induced osteoclastogenesis通过Vericiguat可能与激活VASP /我κB -α/ NF -κB信号通路。然而,随着Vericiguat浓度的增加,我的直接抑制作用κB -α/ NF -κB信号通路会抵消VASP的促进作用居多κB -α/ NF -κB信号通路和抑制osteoclastogenesis。然而,在OC Vericiguat分化的确切机制需要进一步调查。其次,骨质流失体内是一个复杂的生物过程与多种因素有关,如雌激素不足,炎症状态,或老化36- - - - - -38]。我们在本研究只使用一个模型,证实Vericiguat的保护作用在高剂量OVX-induced骨质流失。然而,奖励的OC分化低浓度Vericiguat体外没有验证体内。因此,将需要更多的骨质疏松模型体内实验证实双重Vericiguat对骨质疏松的影响,如LPS-induced炎症骨质疏松模型。第三,观察骨代谢中也起到了重要作用。因此,Vericiguat的生物效应观察体外和体内也需要探索,虽然其他国网公司催化剂,如cinaciguat,据报道增加增殖,分化,和生存的突发交换(11]。我们的研究将进一步关注Vericiguat对OB分化的影响体内和体外。

总之,我们现在的研究证明Vericiguat的双重效应的形成商务浓度的功能。监管Vericiguat对商务的影响是通过双向的激活κB -α/ NF -κB信号通路,一个潜在的我之间的平衡κB -α/ NF -κB信号通路和国网公司/ cGMP / VASP可能存在。然而,在OC Vericiguat分化的确切机制在体外和体内都需要进一步的调查。

数据可用性

数据请求时可用。

信息披露

预印本此前发表的链接如下:https://www.preprints.org/manuscript/202109.0151/v1(39]。然而,在这个提交内容进一步改善。

的利益冲突

所有作者没有透露任何金融和个人关系与他人或组织在这个研究。

作者的贡献

Fanqi香港Kaiqiang太阳,风林了这项研究同样也应该被视为co-first作者。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(批准/奖数字81871828和81871828)。