文摘

产前阿片样物质接触可能会干扰大脑中的表观遗传编程与各种影响新生儿的后代基因表达和行为。本研究决定是否改变trimethylation赖氨酸组蛋白3的4 (H3K4me3)在肿瘤坏死因子启动子-α(tnf-α)基因与神经细胞凋亡参与了腹中下丘脑纹状体,戒断症状的重要脑区,morphine-addicted母亲的新生儿的老鼠的后代。成年女性老鼠注射吗啡在妊娠和直到产后14天。在产后一天14(好),老鼠的后代从morphine-addicted母亲受到一个opioid-withdrawal协议,分析了2或8 h后政府的协议。TNF的表达α蛋白质,H3K4me3tnf-α启动子基因,神经细胞凋亡在腹中下丘脑新生儿鼠纹状体后代进行评估。没有显著的阿片类戒断(2 h后开始opioid-withdrawal协议好),产前吗啡暴露导致的H3K4me3水平增加tnf-α的启动子基因,肿瘤坏死因子-α蛋白质,腹中下丘脑内的神经细胞凋亡新生儿鼠纹状体的后代。阿片类戒断后(8 h后开始opioid-withdrawal协议好),H3K4me3的微分表达式tnf-α启动子的基因位点和upregulation TNF -水平α蛋白表达是进一步加强在这些后代。此外,水平的提高caspase-3和神经细胞凋亡也被观察到。综上所述,本研究表明产前阿片类药物暴露可以激活一种表观遗传组蛋白机制调节促炎因子的生成,因此,导致细胞凋亡损伤腹中下丘脑内纹状体morphine-addicted母亲的新生儿的老鼠的后代。opioid-withdrawal集更重要的是,可以提供增强效果的上述变化,可能导致新生儿的大脑有害影响的后代。

1。介绍

早期生活逆境相关风险增加发展中许多行为和精神障碍(1]。一系列的产前、产时和产后通过交互集可能会导致神经发育与个体的基因型破坏特定的神经和心理生理系统相关的认知功能,从而提高精神疾病的风险在以后的生活中(2,3]。实际上,儿童接触到围产期阿片类药物在出生后会有更高的死亡率和患有神经发育的后果和行为问题(4,5]。

在胎儿和新生儿时期,中枢神经系统(CNS)显示高度显著的可塑性和容易改变等产前影响产前阿片类药物暴露(6- - - - - -8]。生命早期暴露的机制发挥着重要作用,晚年精神疾病仍然待定,但表观遗传机制代表了一种合理的候选人9,10]。哺乳动物大脑的腹中下丘脑纹状体作为协调目标导向行为(即集成中心。,药物渴求和药物成瘾的奖励)11]。先前的研究表明,吗啡暴露可以触发促炎细胞因子的生产,包括肿瘤坏死因子(TNF)α、白介素- 1 (IL)和IL - 6 (12- - - - - -14]。长期阿片类药物管理导致增加信使RNA (m)中il - 1和il - 6水平腹中下丘脑的大鼠纹状体在活的有机体内(15]。此外,吗啡戒断neuro-behaviors可以诱发肿瘤坏死因子-α从神经细胞释放13]。最近,肿瘤坏死因子-α表达水平被发现增加在杏仁核morphine-withdrawal集(14]。事实上,大脑炎症不仅直接阿片类药物暴露和撤军,但经胎盘的发生影响新生儿的后代;例如,后代患上产前阿片类药物暴露增加TNF -展出α在海马体(生产16]。产前强调,如慢性毒品滥用,也许可以母体免疫功能障碍,导致促炎细胞因子水平升高在新生儿的大脑的后代17]。综上所述,这些研究表明,产前阿片类药物暴露可以生成经胎盘的炎症级联在早期的生活。

表观遗传组蛋白调控目标启动子基因位点可能发挥作用在哺乳动物药物成瘾性和成瘾的分子基础18,19]。最近,trimethylation组蛋白H3赖氨酸4 (H3K4me3),提出一种组蛋白调节,作为转录的助推器tnf-α基因表达启动子区域内(18,20.]。此外,早期生活压力或药物暴露也可以诱导组蛋白修饰在腹侧被盖区导致信号传导(特异表达21]。然而,对组蛋白甲基化由于围产期阿片类药物暴露和细胞凋亡在大脑的后代。因此,本研究的目的是检验假设产前阿片类药物暴露的H3K4me3激活trimethylationtnf-α启动子基因和与腹中下丘脑纹状体神经细胞凋亡的新生儿的老鼠的后代(产后一天14;好)。

2。材料和方法

2.1。实验动物协议

成年女性Sprague-Dawley (SD)大鼠接受opioid-withdrawal协议被安置在12 h光/暗周期与湿度保持在60% ~ 70%,最初注射盐酸吗啡(2毫克/公斤体重(BW),每天两次皮下注射的剂量逐渐增加的速度1毫克/公斤体重每7天的最大剂量7毫克/公斤体重)(6- - - - - -8,22]。这些雌性老鼠交配对天7或8。在怀孕期间和之后的老鼠的后代出生时,吗啡还是按计划定期管理直到后代14天。最后阿片类药物注射是在产后一天13 (P13)。整个实验过程,没有明显的阿片戒断症状之间的孕产妇阿片类药物注射。车辆控制小组由孕产妇SD大鼠注射生理盐水在同一剂量和时间间隔作为实验组。

我们评估BW的老鼠的后代的生长在产后7天(P7)、好(一个年龄视为人类寿命的新生儿)(23]。好,老鼠的后代从孕产妇老鼠被转移到一个观察室保持在33°C与温暖的光和观察2 h和延迟的累积集展示opioid-withdrawal行为,如饲养,牙齿打颤,向后运动,震动,湿狗摇动。老鼠的后代从morphine-addicted母亲被分成两组:早期组代表鼠后代为阿片类戒断行为观察2 h后立即转移,之后,他们牺牲了生化实验(早期组, 老鼠);和后期集团代表鼠后代为2 h opioid-withdrawal行为的观察从6小时后转移。这些老鼠的后代被牺牲了生化实验(组末期, 老鼠)。老鼠的后代从车辆控制集团被转移到一种观察室好和观察为2 h opioid-withdrawal行为从6小时后转移。这些老鼠的后代被牺牲了生化实验(对照组, 老鼠)。没有性别的差异在三组。

所有实验协议批准的动物保健和使用委员会国防医学中心,台湾世- 04 - 088和iacuc - 04 - 085)的所有操作进行设计来减轻痛苦和减少实验用动物的数量。

2.2。准备腹中下丘脑切片的纹状体区域

好opioid-withdrawal协议完成后,小狗被牺牲,和脑片(400μ米)包含腹中下丘脑纹状体脑区都被立即收获与vibro-slicer(登乐器,Sileby Loughboroug,英国)。大脑切片与含氧灌注选择性转移到一个孵化室人工脑脊液(95%啊₂/ 5%股份有限公司₂气体,在 °C) 1 h。人工脑脊液由(mM)氯化钠(124),MgCl₂(1)CaCl₂(2)、氯化钾(3.5),不₂阿宝₄(1.25),NaHCO₃(26)和葡萄糖(10)在pH值7.4和渗透性的 mOsm。

2.3。免疫印迹

腹中下丘脑细胞纹状体是细胞溶解在缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷在液pH值7.4,150毫米氯化钠,1毫米PMSF,特里同x - 100 0.2%, 2毫米EDTA,和1×蛋白酶抑制剂混合物)。蛋白质浓度与BCA澄清试验(美国热科学,罗克福德,IL)。细胞溶解产物排序在钠dodecylsulfate聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page),后来被调到硝化纤维膜,然后用抗体对肿瘤坏死因子-α(sc - 1351;圣克鲁斯)和裂解caspase-3(没有。9662;细胞信号)。根据不同类型的主要抗体,兔子anti-mouse免疫球蛋白G(免疫球蛋白)或山羊anti-rabbit免疫球蛋白G(1: 3000)被选为二级抗体。免疫反应性的蛋白质被发现使用BioSpectrum 810成像系统(UVP)。

2.4。实时聚合酶链反应(PCR)

RNA的隔离,包括合成互补(c) DNA,并使用Transcriptor DNase治疗完成第一个链cDNA合成装备rt - pcr系统™(美国罗氏,印第安纳波利斯)后,制造商的指示。的两步实时PCR LightCycler™系统(罗氏)和Sybr绿色我染料用于监控PCR。由于“快速上手”项目DNA主人SYBR绿色我(罗氏)是根据制造商的指示执行,用于实时PCR。本研究利用以下组引物:TNF -α:远期(5 - - - - - -CCCTACGGGTCATTGAGAGA-3 )和反向(5 - - - - - -GGTTGTGGACTGCCTTTTGT-3 );和18 s核糖体RNA (r): (5 - - - - - -CCAGTAAGTGCGGGTCATAA-3 )和反向(5 - - - - - -TAGTCAAGTTCGACCGTCTTC-3 )。PCR的热协议设置为95°C(4分钟),紧随其后的是30放大周期的94°C(30岁),62°C(1分钟),和72°C(1分钟),最后融化曲线分析。扩增子被融化曲线分析(光周期计软件)和琼脂糖凝胶电泳;LightCycler分析系统应用于决定周期阈值(CT)值,和相对信使RNA (m)的每个实验评估了一个实时PCR其次是由相对CT测量方法(ΔΔCT)(目的是归一化的表达一个内生的标准(18 s rRNA),而校准器(cDNA从合并样本)。

2.5。染色质免疫沉淀反应(芯片)的测定

如前所述(执行芯片分析24,25]。简单地说, 细胞用1%甲醛在室温下(10分钟)伴随着一夜之间声波降解法DNA和染色质免疫沉淀反应的抗体trimethylated H3K4 (2μg 25μ染色质的g;antihistone H3K4me3抗体芯片级;ab8580;Abcam)和芯片后净化设备(没有。17 - 295;美国纽约北部的生物技术,普莱西德湖)。探针和引物被探索近端启动子计划,intronic增强器的区域tnf-α基因(24,25),包括下列条件如下所述相对于转录开始网站:tnf-α1(-2686年至-2667年);向前,5 - - - - - -CCCTAGTCCTCCTGGGATGT-3和反向,5 - - - - - -GCCTGCTGCAACAGAGAGA-3 ;tnf-α2(-2202年至-2183年);向前,5 - - - - - -CGTCTCACTATGCCTGGGTCT-3和反向,5 - - - - - -AAGCAAAGCACTTCTACCAAAT-3 ;tnf-α3(-1672年至-1653年);向前,5 - - - - - -AAACTCAGACCAGGCTGCAT-3和反向,5 - - - - - -CAGGTCATCTCTTGACGTGGT-3 ;tnf-α4(-502年至-480年);向前,5 - - - - - -GAGTTCTGCATGTATTGGATAGG-3和反向,5 - - - - - -TGCTACCAAGCCTAAAGACC-3 ;和tnf-α5(-230年至-213年);向前,5 - - - - - -GGTTCAGTTCCCAGCACCTA-3和反向,5 - - - - - -ATGGGCATATCTGCACAGCA-3 。PCR进行AmpⓐABI基因PCR系统(应用生物系统公司)。免疫沉淀反应的数量相比,DNA计算和总输入DNA的数量。

2.6。细胞凋亡的评估

双重免疫荧光调查,运用激光扫描共焦显微镜检查细胞凋亡在腹中下丘脑的大脑部分纹状体神经元,这是减少在冠状面和测量30μ米,然后沾antineuronal核(NeuN)抗体(克隆室A60 MAB377;美国Chemicon泰梅库拉,CA)来确定神经元细胞的存在与否终端尿苷缺口末端标记(TUNEL);11684795910,Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),免疫染色是用来检测DNA崩溃。一个Cy3-conjugated anti-mouse抗体染色TUNEL染色NeuN和fluorescein-conjugated抗体被用于一个二级放大可视化与蔡司LSM510激光显微镜(美国纽约Thornwood)。NeuN-sensitive细胞密度的定量分析,TUNEL-sensitive细胞密度和NeuN / TUNEL-sensitive腹中下丘脑细胞密度进行了纹状体脑图谱显示(26]。每组的平均结果被从6片/动物。

2.7。统计分析

数据显示为 (SEM)。数据分析使用SigmaPlot 10.0和3.5 Sigmastat。单向方差分析(方差分析)与Bonferroni事后比较的测试是将应用的意义 。

3所示。结果

3.1。Opioid-Withdrawal行为

我们观察到产前阿片类药物暴露是否扰乱了BW出生后的增长。在图1BW的老鼠的后代先天opioid-exposure组在统计学上显著降低(P7:产前opioid-exposure组: 克, , 老鼠与车辆控制集团: 克, 大鼠;好:产前opioid-exposure组: 克, , 老鼠与车辆控制集团: , 老鼠)。

早期组老鼠的后代没有表达显著opioid-withdrawal行为,相对于对照组( , 老鼠在每组数据未显示)。相比之下,如图2后期集团表现出较短的延迟在展示opioid-withdrawal行为(例如,饲养,牙齿打颤,向后运动,震动,或湿狗摇动)和有更多的opioid-withdrawal行为在一段2 h,而对照组的老鼠的后代出生6小时后传输( , 在每组8老鼠)。

3.2。产前阿片类药物暴露和TNF -α表达式

图3显示了TNF -的水平α信使rna和蛋白质新生儿腹中下丘脑纹状体的老鼠的后代(好)morphine-addicted母亲。有显著增加的mRNA和蛋白水平TNF -α早期表达组与对照组( , 在每组大鼠)。此外,信使rna和蛋白质水平的TNF -α表达式是进一步提高晚期组相比早期组( , 在每组大鼠)。

3.3。产前阿片类药物暴露和H3K4me3修改肿瘤坏死因子- - - - - -α启动子

以决定是否H3K4me3的激活肿瘤坏死因子- - - - - -α启动子基因与肿瘤坏死因子水平的增加有关α见图3使用PCR引物,芯片分析匹配的五个亚区tnf-α启动子基因进行新生儿腹中下丘脑纹状体的老鼠的后代。如图4产前阿片类药物暴露水平的提高H3K4me3条件2、3和4tnf-α启动子基因( , 在每组大鼠)。此外,集团,后期有进一步增加H3K4me3水平活动的条件3和4tnf-α启动子基因位点相比早期组( , 在每组大鼠)。

3.4。产前阿片类药物暴露和凋亡Caspase-3活动

观察是否产前阿片类药物暴露引起的上述TNF -α增强结合细胞凋亡,裂解caspase-3活动评估新生儿腹中下丘脑纹状体的老鼠的后代(好)morphine-addicted母亲。如图5,有一个增加的裂解caspase-3表达式组相对于对照组(初 )。此外,裂解的水平caspase-3表达式后期组相比没有统计学差异早期组( , 在每组大鼠)。

3.5。产前阿片类药物暴露和神经细胞凋亡

确认上述水平的增加caspase-3活动,共焦激光扫描显微镜应用于研究新生鼠的后代(好)morphine-addicted母亲。数据6(一)- - - - - -6 (c)和数字,代表形态插图吗7(一)- - - - - -7 (c)展示了数据。显示在图7(一)细胞数量的增加,TUNEL-sensitive腹中下丘脑内纹状体早期组相对于对照组( , 在每组大鼠)。此外,进一步增加TUNEL-sensitive细胞观察组相比早期组(末 , 每组大鼠(图)7(一))。图7 (b)显示产前阿片类药物暴露导致少的NeuN-sensitive细胞早期组相对于对照组( )。NeuN-sensitive细胞的数量在组没有统计学差异相比早期组( , 每组大鼠(图)7 (b))。在图7 (c),细胞的数量显示colocalization NeuN和TUNEL反应腹中下丘脑内纹状体在新生儿的风险高的老鼠的后代(好)morphine-addicted母亲相比对照组( , 在每组大鼠)。这些结果表明,产前阿片类药物暴露能引起神经细胞凋亡在腹中下丘脑纹状体morphine-addicted母亲的新生儿的老鼠的后代。

4所示。讨论

本研究的主要结果表明,产前阿片类药物接触激活微分trimethylation H3K4修改的子轨迹肿瘤坏死因子- - - - - -α基因与细胞凋亡有关新生儿腹中下丘脑纹状体的老鼠的后代从morphine-addicted母亲,暗示可能的早期生活逆境腹中下丘脑内的哺乳动物大脑纹状体。

先前的研究表明,表观遗传组蛋白修饰调控基因表达式通过一个特定的网站启动子在不同刺激反应(27]。然而,大多数研究评估全球变化的表观遗传修饰,而不是采取一种方法来研究一个特定的基因。先前的研究表明高位于特定位点的DNA甲基化的可能性tnf-α启动子基因与牙周炎(检测到从人类齿龈28,29日];另外,暴露在脂多糖诱导组蛋白修饰不同但集中地区包括在启动子区域的甲基化tnf-α基因(27]。本研究进一步披露微分增强H3K4me3修改的tnf-α启动子基因位点的腹中下丘脑纹状体morphine-addicted母亲的新生儿的老鼠的后代,这增强了不同启动子的轨迹肿瘤坏死因子- - - - - -α基因意味着各自转录因子可以招募到转录,成为受产前阿片类药物暴露的影响。例如,传感器信号和转录激活6 (STAT6)(位于tnf-α2区)据报道调解神经炎症小鼠乙醇造成的创伤性脑损伤(30.]。十字的同源框1 (En1)(位于肿瘤坏死因子- - - - - -α3区)和垂体同源框3 (Pitx3)(位于肿瘤坏死因子- - - - - -α4区)参与多巴胺能神经元的发展,这是和毒品成瘾和奖励的行为(31日]。在这项研究中,我们演示了水平的提高H3K4me3条件2、3和4肿瘤坏死因子- - - - - -α启动子基因新生儿老鼠的后代从morphine-addicted母亲的腹中下丘脑纹状体(图4),伴随着TNF -水平上升α信使rna和蛋白质(图3)。这些结果暗示可能改变激活转录因子负责促炎因子生成(例如,TNF -α)。然而,转录因子参与和影响表观遗传组蛋白修饰在后代由于产前阿片类药物暴露仍不清楚。

表观遗传组蛋白修饰不仅持续出现在急性或慢性暴露,也持久,即使退出事件(32,33]。甲基苯丙胺的表达增加H3K4me3成瘾中背侧纹状体的动物,它是全球表示即使终止冰毒接触(34]。相似,产前的H3K4me3阿片类药物暴露水平上升肿瘤坏死因子- - - - - -α启动子基因在这个研究。和作为后期群体opioid-withdrawal行为,有进一步增强H3K4me3活动特定的条件。综上所述,表观遗传组蛋白修饰似乎与中介的特定基因启动或脱敏毒品曝光,和这种表观遗传组蛋白修饰可以潜伏,而持续改变染色质结构撤军集后(35]。然而,我们主要评估H3K4me3表达式在腹中下丘脑纹状体从新生儿急性期的老鼠的后代产前暴露和/或吗啡戒断在这项研究中,这可能模拟新生儿禁欲综合症的临床状态。未来的研究还应该调查组蛋白修饰在额外的时间点以评估产前阿片类药物的长期影响曝光。

增强TNF -α生产在腹中下丘脑纹状体与细胞凋亡相关的产前阿片类药物暴露增加风险神经精神疾病的神经生物学基础。这种增强的肿瘤坏死因子-α释放表明早期炎性反应导致激活凋亡通路如caspase-3信号(36- - - - - -38]。然而,在这项研究中,没有明显的减少神经元凋亡晚期组(图7)。事实上,吗啡可以直接诱导小胶质细胞和神经元的凋亡在体外,但似乎慢性吗啡暴露可能不会影响胶质细胞在早期在活的有机体内从动物模型36,37]。因此,细胞凋亡在产前阿片类药物暴露中发挥作用,但具体参与特定的细胞类型还有待调查。在这项研究中,产前阿片类药物暴露和诱导肿瘤坏死因子-撤军α生产可能导致腹中下丘脑纹状体神经细胞凋亡。此外,阿片类药物暴露也可能增强细胞凋亡在选定的,特定的大脑区域,如杏仁核,腹中下丘脑纹状体,或者前额叶皮层在活的有机体内(36,38]。产前海洛因曝光增强海马的细胞凋亡和结果在学习和记忆障碍(39]。这些结果表明,产前阿片类药物暴露和撤军可能诱导细胞凋亡在其他特定的大脑区域,导致神经系统损伤。

最近,一位密切互动及相关炎症和神经精神障碍之间的关系,提出了在哺乳动物的大脑40]。例如,促炎细胞因子可以影响认知和情绪行为通过促进neuroexcitatory反应和损害神经元可塑性(41]。此外,在这项研究中,表观遗传H3K4me3机制的upregulation TNF -α表达在腹中下丘脑神经细胞凋亡增加纹状体,这可能导致神经损伤。这些神经细胞凋亡损伤腹中下丘脑内纹状体在早期生活可能导致剂量阿片类药物来满足要求需要增加剂量,实现药物成瘾性和成瘾行为。此外,产前阿片类药物暴露可能发起持久改变的基因表达式腹中下丘脑纹状体突触结构的老鼠的后代(8,22]。存在这样的产前阿片类药物暴露的影响似乎比预期更长的时间。我们目前的结果表明,产前阿片类药物暴露诱导神经细胞凋亡在腹中下丘脑内纹状体在早期的生活。然而,神经细胞凋亡是否持续出现在以后的生活或者下一代仍未知,这促使我们进行进一步的实验的长期影响产前阿片类药物暴露和撤军。

5。结论

总之,本研究表明产前阿片类药物暴露可以激活一个表观遗传组蛋白调控机制促炎因子生成,从而导致细胞凋亡损伤腹中下丘脑内纹状体morphine-addicted母亲的新生儿的老鼠的后代。opioid-withdrawal集更重要的是,可以提供增强效应等上述改变,可能导致新生儿大脑这些不利影响后代。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

PLW导致了数据管理、原创作品草案,和资金收购。JLS导致了资源、writing-review和编辑和可视化。水文学委员会的调查和数据管理。KCK促成了方法和可视化。YCY和后导致了概念化、方法writing-review和编辑、监督和资金收购。所有作者的手稿修改和阅读和批准提交的版本。

资金

这项研究被研究经费支持部分San-Nan杨(EDPJ107068, EDPJ108057 EDPJ109059)和裴凌吴(EDAHI 107004年,EDAHP108015 EDAHP105030, EDCHP106007)。