文摘
的微rna (microRNA)在妊娠期糖尿病中的作用已被广泛研究在过去的十年。然而,mir - 6869 - 5的改变效果- p在妊娠期糖尿病免疫力和胎盘微环境在很大程度上是未知的。在我们的研究中,mir - 6869 - 5 - p的表达被记录在placenta-derived单核巨噬细胞明显减少,这也是PTPRO负相关。此外,PTPRO是负面受mir - 6869 - 5 - p placenta-derived单核巨噬细胞。在体外,mir - 6869 - 5 - p抑制巨噬细胞增殖EdU和CCK-8实验证明了这一点。巨噬细胞的炎症反应也显著地抑制了mir - 6869 - 5 - p,它可以调节PTPRO作为目标记录的荧光素酶记者分析。此外,mir - 6869 - 5 - p提升M2巨噬细胞极化,从而抑制炎症。因此,mir - 6869 - 5 - p是参与维持胎盘微环境平衡,防止炎症和诱导M2巨噬细胞在妊娠期糖尿病。
1。介绍
妊娠期糖尿病是一种常见的并发症在怀孕的女性,通常有正常的葡萄糖代谢糖耐量异常(或潜在的1]。妊娠期糖尿病的发病率在过去的几十年里一直在增加。大多数妊娠糖尿病患者可以恢复正常葡萄糖代谢产后,但它们在高架将来患II型糖尿病的风险。妊娠期糖尿病的发病机制还不清楚。怀孕期间最重要的是,葡萄糖代谢异常可导致妊娠失败,难产,死胎、胎儿死亡,胎儿巨大胎儿增加由于复杂的因素(2]。因此,识别有用的方法对妊娠期糖尿病预防和治疗迫在眉睫。
单核巨噬细胞是主要参与调节胎盘免疫细胞和体内平衡。巨噬细胞可以诱导分化成经典激活细胞M1和M2或者激活细胞在特定的监管机构和微环境在胎盘3,4]。2型巨噬细胞(M2)发挥重要作用在维持胎盘微环境平衡(5]。积累的研究表明,小分子核糖核酸(microrna)参与调节妊娠糖尿病的发病机制β细胞发育、胰岛素敏感性和电阻(6,7]。众所周知,一些microrna能影响巨噬细胞分化和极化,如mir - 657, mir - 145, mir - 221 - 3 - p (8- - - - - -11]。我们曾发现mir - 657可以诱导巨噬细胞M1在妊娠期糖尿病,这是一种很有前途的疾病诊断和治疗的目标(8,12]。mir - 6869 - 5 - p被首先发现作为一个肿瘤抑制基因(13]。没有证据显示,mir - 6869 - 5 - p是由于妊娠期糖尿病发病机制。我们曾发现mir - 6869 - 5 - p的表达明显减少placenta-derived单核巨噬细胞,也是PTPRO负相关。生物信息学分析表明,PTPRO是一个潜在的目标mir - 6869 - 5 - p。然而,很少有人知道mir - 6869 - 5 - p的影响在胎盘巨噬细胞分化和功能。在这项研究中,我们的目标是阐明改变效应和潜在的分子机制mir - 6869 - 5 - p在妊娠期糖尿病免疫力和胎盘微环境,这将提供深入了解疾病的发病机理和获得有前途的疾病预防和治疗策略。
2。材料和方法
2.1。参与者和样品制备
妊娠期糖尿病患者(26例)和正常妊娠(控制)23日录取。包含和排除标准如下:与GDM孕妇足月剖腹产入学率为病例组,而健康的女性在怀孕足月作为对照组。那些怀孕的过早或逾期分娩都排除在外。表1列出了参与者的特征。这项研究是医院的机构伦理委员会批准的孕产妇和儿童健康的附属医院,潍坊医科大学。参与者签署了知情同意。巨噬细胞是新鲜胎盘组织分开,分成小块分离之前。胎盘组织悬架是用于通过密度梯度离心法分离细胞。然后,我们使用CD14积极微(美国Biolegend)巨噬细胞净化。
2.2。细胞系
人类THP-1细胞培养在RPMI 1640年10 - 20%胎牛血清(美国Gibco)。美国σPMA(100海里)是用来刺激细胞48 h,使它们分化成巨噬细胞。mir - 6869 - 5 - p模仿和mir - 6869 - 5模拟控制用于coculture与巨噬细胞,它们从Genechem购买公司(上海,中国)。慢病毒质粒有或没有超表达的蛋白质酪氨酸磷酸酶O型受体(PTPRO)是用来使转染巨噬细胞。
2.3。CCK-8和EdU
CCK-8工具包(Vazyme生物科技南京,中国)是用来评估细胞增殖。总之,巨噬细胞( 每)有或没有过度PTPRO播种到96孔板12 h,然后,被mir - 6869 - 5 - p模仿和mir - 6869 - 5 - p模拟控制24小时和48 h。10μl CCK-8试剂溶液管理进入细胞,这是2 h的孵化。最后,光密度(OD)在450 nm确定计算和数据从三个独立的测试。EdU试验也可以执行估计基于协议的巨噬细胞增殖。细节已被证明在一项研究8]。
2.4。实时聚合酶链反应
试剂盒试剂(美国表达载体)用于分离从胎盘组织中巨噬细胞rna, THP-1细胞根据协议。RNA (0.5μg)是用作互补脱氧核糖核酸合成基于模板的协议PrimeScriptTM RT工具包(豆类,北京)。互补脱氧核糖核酸是申请使用PCR扩增的豆类SYBR预混料。TaqMan PCR分析工具包(美国ThermoFisher科学)是用来确定mir - 6869 - 5 - p的表达在细胞。引物如下:人类PTPRO F TATTGTGAGCCTCCGTGTGT;R, GCCAAGCCTTTTCAGTGACA。人类il - 1β、F ACGATGCACCTGTACGATCA;R, TCTTTCAACACGCAGGACAG。
人类肿瘤坏死因子-α、F CCCTGAAAACAACCCTCAGA;R, AAGAGGCTGAGGAACAAGCA。人类GAPDH, F, ACCACAGTCCATGCCATCAC, R, TCCACCACCCTGTTGCTGTA。
2.5。酶联免疫吸附剂测定(ELISA)
如前所述(12),THP-1巨噬细胞有或没有过度PTPRO孵化在无血清培养基12 h。随后,巨噬细胞转染了mir - 6869 - 5 - p模仿或模拟控制48小时。il - 1β和肿瘤坏死因子-α在细胞培养上清液是由ELISA试剂盒的指令(R & D系统,美国)。最优密度终于发现。
2.6。荧光素酶报告实验
pGL3向量携带荧光素酶报告基因用于克隆3 ' untranscriptional区域(3 'utr) PTPRO(野生和突变类型)。荧光素酶活性估计使用双荧光素酶报告系统的分析。细节已经呈现在我们之前的研究8]。
2.7。流式细胞术
从胎盘组织中巨噬细胞的妊娠期糖尿病患者的高或低表达mir - 6869 - 5 - p与FITC-conjuncted CD14 Ab孵化,PE-HLA-DR-conjuncted Ab,或者PE-CD206-conjuncted Ab(美国Biolegend,圣地亚哥,CA)在室温下30分钟。然后利用离心力分离细胞和收获通过流式细胞仪检测。THP-1巨噬细胞( )有或没有过度的PTPRO一夜之间被播种到24-well板。然后,细胞由mir - 6869 - 5 - p模仿或模拟控制另一个24小时。孵化后PE-HLA-DR-conjuncted Ab或PE-CD206-conjuncted Ab(美国Biolegend,圣地亚哥,CA)在室温下30分钟,我们收获细胞,应用流式细胞仪测定。
2.8。统计分析
用于计算数据。所有的结果是正态分布的。使用GraphPad软件和SPSS软件。两组之间的差异是由使用统计分析学生的独立样本 - - - - - -测试参数数据,而差异超过三组是由方差分析估计的。 被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。mir - 6869 - 5 - p从胎盘巨噬细胞明显减少,与M2巨噬细胞极化有关
mir - 6869 - 5 - p的表达placenta-derived巨噬细胞在妊娠期糖尿病患者比较时显著降低,在placenta-derived巨噬细胞从正常妊娠(图1(一))。相对地,增加表达PTPRO placenta-derived巨噬细胞中发现了妊娠期糖尿病患者(图1 (b))。负关联mir - 6869 - 5 - p和PTPRO证明关于胎盘tissue-derived巨噬细胞(图的表达式1 (c))。我们还发现CD206 +巨噬细胞的表达和HLA-DR+巨噬细胞在胎盘组织中巨噬细胞。有趣的是,CD206+巨噬细胞而不是HLA-DR+巨噬细胞显著增加患者的高表达mir - 6869 - 5 - p在胎盘tissue-derived巨噬细胞,而CD206+巨噬细胞而不是HLA-DR+巨噬细胞显著减少患者的低表达mir - 6869 - 5 - p在胎盘tissue-derived巨噬细胞(图2)。因此,我们假设mir - 6869 - 5 - p可能在胎盘免疫微环境调节巨噬细胞极化和诱发巨噬细胞对M2极化妊娠(期)糖尿病。
(一)
(b)
(c)
3.2。mir - 6869 - 5 - p针对PTPRO抑制巨噬细胞增殖
确保mir - 6869 - 5 - p是否可以调节PTPRO作为一个目标,我们筛选Targetscan数据库,发现mir - 6869 - 5 - p可以认识到3 'utr PTPRO序列。目标区域的预测重要的配对(上)和microrna(底部)如图3(一个)。荧光素酶报告实验进一步证明了我们的假设,PTPRO的目标基因mir - 6869 - 5 - p在THP-1巨噬细胞(图3 (b))。在接下来的实验中,改变mir - 6869 - 5 - p对巨噬细胞增殖是估计的。就是明证CCK-8(图3 (c))和EdU(图3 (d)),THP-1巨噬细胞的增殖可以有效地增强PTPRO在巨噬细胞时,虽然mir - 6869 - 5 - p模仿成功救援效果因为THP-1巨噬细胞的增殖显著抑制mir - 6869 - 5 - p模拟治疗组相比,mir - 6869 - 5 - p模仿对照组。
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(c)
(d)
3.3。mir - 6869 - 5 - p阻止炎症巨噬细胞诱导M2巨噬细胞
估计mir - 6869 - 5 - p的影响巨噬细胞,THP-1巨噬细胞被mir - 6869 - 5 - p处理模拟,同时刺激有限合伙人。如数据所示4(一)- - - - - -4 (d),PTPRO超表达可以诱导高表达的肿瘤坏死因子-α和il - 1β在这两个层次的信使rna和蛋白质在巨噬细胞。此外,CD206率降低+巨噬细胞和HLA-DR率升高+巨噬细胞是观察当PTPRO在巨噬细胞(图中5)。然而,降低TNF的表达α和il - 1β在观察巨噬细胞PTPRO-overexpressed细胞治疗mir - 6869 - 5 - p模拟(数字4(一)- - - - - -4 (d))。此外,mir - 6869 - 5 - p mimic-treated巨噬细胞更容易分化成CD206+巨噬细胞(图5)。因此,mir - 6869 - 5 - p可以挽救PTPRO引起的巨噬细胞的炎症反应。综上所述,mir - 6869 - 5 - p能够防止炎症巨噬细胞诱导巨噬细胞对M2。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
妊娠期糖尿病是妊娠的并发症,造成了高风险的母亲和胎儿。非编码RNA在妊娠期糖尿病中的作用已经吸引越来越多的关注在过去的几年中,如长非编码RNA和microrna的(14- - - - - -16]。虽然他们不编码活性蛋白质或多肽,许多非编码rna参与妊娠糖尿病的发病机理RNA-RNA或rna蛋白质交互。一些循环非编码rna可以作为有用的疾病生物标志物对妊娠期糖尿病的发病和进展17]。
microrna是一个小的非编码RNA,针对特定功能的mrna。许多microrna被证实为妊娠期糖尿病,保护胰腺的关键角色β细胞功能,影响胰岛素抵抗,胰岛素敏感性以及肝醣类,例如,mir - 143, mir - 351, mir - 96 (18- - - - - -20.]。燕等人的研究报道,mir - 6869 - 5 - p在结直肠癌特异表达,导致了癌症细胞增殖,入侵,迁移负调控TLR4 / NF -κB信号通路(13]。Exosome-encapsulated mir - 6869 - 5 - p也被证明参与癌症(21]。然而,mir - 6869 - 5的修改效果- p在巨噬细胞介导的妊娠期疾病还没有评估。在这项研究中,我们的目标是探讨mir - 6869 - 5 - p参与妊娠(期)糖尿病。mir - 6869 - 5 - p是显著下调胎盘巨噬细胞来自妊娠糖尿病患者。它是参与调节胎盘免疫微环境,诱导巨噬细胞对M2。mir - 6869 - 5 - p阻止针对PTPRO从巨噬细胞增殖和炎症,促进巨噬细胞极化M2细胞。因此,mir - 6869 - 5 - p可以作为抑制巨噬细胞介导的炎症和免疫反应妊娠(期)糖尿病。然而,精确的分子机制对于mir - 6869 - 5 - p调节巨噬细胞增殖和极化认股权证来阐明更多未来的研究。
当地安装数据有牵连,巨噬细胞介导免疫中发挥着重要作用保持平衡的免疫微环境在胎盘22- - - - - -24]。另外,巨噬细胞在脂肪组织炎症和免疫发挥重要作用[3,25,26]。我们所知,巨噬细胞可分为两个常见的细胞类型,即经典激活M1和M2或者激活(3,27]。M1细胞通常具有proinflammation活动,而M2细胞起到抗炎作用。巨噬细胞M1的经典标记CD11c, HLA-DR, TNF -α。的典型标记M2巨噬细胞CD206, CD163, il - 10。抗炎M2巨噬细胞表型是必不可少的控制妊娠糖尿病(28]。以前,我们发现M1和M2的平衡是至关重要的维护母胎界面的免疫平衡(8]。M1 / M2失衡会导致持续的炎症和免疫紊乱在母胎界面的微环境,这可能导致早产、死胎等。积累的数据表明microrna参与调节巨噬细胞增殖,分化,极化,从而导致糖尿病(29日- - - - - -31日]。尽管如此,microrna在巨噬细胞极化的影响妊娠期糖尿病在很大程度上是未知的。在我们的研究中,mir - 6869 - 5 - p是首先记录与M2正相关极化和保护正常怀孕妊娠糖尿病患者。mir - 6869 - 5 - p是一个有前途的妊娠期糖尿病的标志。
PTPRO属于蛋白质酪氨酸磷酸酶家族。大量的研究已经涉及,PTPRO参与macrophage-mediated炎症反应的规定,肝缺血再灌注损伤,和肿瘤免疫(32- - - - - -35]。在我们之前的研究中,PTPRO已被证实能显著调节在子痫前期患者中,也发现是参与调节巨噬细胞炎症在子痫前期36]。目前的研究已经在placenta-derived首先建议PTPRO调节巨噬细胞从妊娠期糖尿病患者。因此,我们假设PTPRO可能影响巨噬细胞的分化和功能,因此,参与调节胎盘局部免疫平衡。的结果在体外研究涉及PTPRO可以促进炎症细胞因子TNF的表达α和il - 1β在这两个层次的信使rna和蛋白质在巨噬细胞。此外,PTPRO能够诱导巨噬细胞极化对M1和增强炎性反应。生物信息学分析,所显示PTPRO的靶向基因mir - 6869 - 5 - p。mir - 6869 - 5 - p可能负调节PTPRO巨噬细胞转录后的水平。有趣的是,mir - 6869 - 5 - p可以防止炎症诱导高表达CD206 Arg-1但低HLA-DR CD11c巨噬细胞。荧光素酶报告实验证明,完善的目标mir - 6869 - 5 - p是PTPRO,一个关键因素在调节巨噬细胞介导的炎症和免疫紊乱。一般来说,mir - 6869 - 5 - p具有抗炎活动目标最终调节PTPRO和诱导M2巨噬细胞。然而,mir - 6869 - 5 - p是否会产生同样的效果在活的有机体内需要在将来的研究中调查。
总之,目前的研究已经确定了mir - 6869 - 5 - p签名参与妊娠糖尿病,这可能有助于保持平衡针对PTPRO和胎盘免疫微环境的诱导巨噬细胞极化对M2。
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的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
记者Wang Zhenzhi马,王Zengyan cofirst作者。
确认
支持这项工作由医疗卫生科技发展项目的潍坊yx048 (wfwsjk2019 - 031年和2020年)。