文摘

糖尿病是一个世界上最著名的代谢紊乱,并在糖尿病患者胰岛素抵抗导致一些并发症包括增加炎症和延迟伤口愈合。成纤维细胞迁移和在伤口愈合reepithelialization扮演重要的角色。在这项研究中,我们探讨il - 1的影响β信号从糖尿病患者的伤口人类成纤维细胞增殖和迁移的组织。我们观察到高浓度的il - 1β在糖尿病患者的样本相比正常伤口组织。在高浓度时,il - 1β抑制细胞增殖和迁移体外纤维母细胞的文化。此外,表达基质金属蛋白酶(MMPs)是调节和组织金属蛋白酶的抑制剂(TIMPs)是糖尿病伤口组织和细胞中表达下调。这些影响是由il - 1的含量β。此外,il - 1β诱导p38磷酸化从而激活p38 MAPK通路,进而调节基质金属蛋白酶的表达和TIMPs。在一起,我们的研究确定了一个新颖的机制背后的延迟在糖尿病伤口闭合,涉及il - 1β端依赖细胞增殖和迁移的监管。

1。介绍

糖尿病是最常见的慢性疾病之一,在世界范围内(1,2]。在中国,11%的成年人患有糖尿病的生活2010年,金额共计1.096亿人(3]。在糖尿病的患病率迅速增加,糖尿病溃疡等并发症已经成为全球畸形的主要原因(4]。不同的症状与糖尿病有关,受损的伤口愈合是最显著的影响之一中观察到病人。伤口愈合是一个进化守恒的过程涉及到时空重叠的过程,如炎症、凝固、细胞增殖和细胞外基质(ECM)改造(5- - - - - -8]。

基质金属蛋白酶(MMPs) ECM重塑蛋白发挥重要作用在伤口愈合过程的不同阶段。监管的金属蛋白酶激活和抑制损伤后级联触发有效伤口关闭(9]。最初,基质金属蛋白酶参与清除坏死组织后,在修复阶段,基质金属蛋白酶有助于血管再生,伤口收缩矩阵,迁移的成纤维细胞和角质细胞,上皮形成。最后,他们也参与了重建新合成的结缔组织(9,10]。MMP的活动是由小抑制蛋白质的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs),这也有助于启动细胞分裂和绑定到ECM的抑制血管生成和细胞凋亡的诱导11]。因此,MMP与TIMP活动之间的平衡是有效的伤口愈合的关键(12,13]。

血清水平的il - 1β糖尿病患者中升高(14]。先前的研究发现il - 1的贡献β对持续炎症慢性伤口和伤口愈合的作用受损15]。然而,il - 1的影响β信号在糖尿病伤口愈合的背景下,到目前为止还没有被研究过。因此,在这项研究中,我们探讨il - 1的作用β使用病人组织和糖尿病伤口关闭体外纤维母细胞文化和确定了小说背后的机制延迟伤口愈合中观察到糖尿病患者。

2。方法

2.1。临床标本

所有患者招募的整形手术,上海交通大学附属第六人民医院。2型糖尿病的患者特征与慢性伤口位于脚和非糖尿病的患者(对照组)一条腿伤口都参加我们的研究。患者慢性伤口溃疡造成压力,脓皮病gangrenosum,血管炎,导致缺血和其他疾病被排除在外。非糖尿病患者的血清和伤口组织样本( )和2型糖尿病( )病人被收集。本研究伦理审查委员会批准上海六人民医院隶属于上海交通大学(ys - 2019 - 010),并符合赫尔辛基宣言的原则修订。从每个参与者书面知情同意了。

2.2。细胞培养

培养成纤维细胞体外,人体组织标本切成1 - 3毫米³多维数据集,在0.15%胶原酶消化(罗氏应用科学,印第安纳波利斯,美国),和在DMEM培养基培养(美国Gibco,马里兰州)37°C 3 h (16]。单细胞悬浮体被尼龙网格和过滤离心机在1500 rpm 5分钟。颗粒含成纤维细胞在10厘米板块resuspended和播种全面补充含10%胎牛血清的DMEM(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。细胞培养在37°C和5%的公司₂。融合性的细胞通道和亚文化1:3比率。细胞收获第一段后进行分析。

2.3。老鼠的皮肤伤口样品

男性C57BL / 6 j小鼠购自南京大学模式动物研究中心。糖尿病小鼠(db / db)是由击出瘦素受体的基因编码。老鼠保持在12 h光/ 12 h暗周期和无限制的获取食物和水温度控制(25°C)。皮肤伤口样本收集如前所述。简而言之,8-week-old老鼠使用乙醚麻醉后,后面的头发皮肤被理发推子。两个圆形的全层皮肤上的伤口都是用6毫米的皮肤活检环钻(Kai行业,Inc .、岐阜、日本)。7天postwounding,小鼠安乐死颈椎脱位,2毫米周边皮肤受伤区域收集。皮肤样本立即沉浸在液氮储存在˗80°C,直到进一步的使用。所有动物实验动物保健和使用委员会批准的上海交通大学和指导方针在动物保健和使用根据国家健康研究所的随访(美国国家卫生研究院)的指导方针。

2.4。定量实时聚合酶链反应

细胞或组织的总RNA提取使用试剂盒和随后反向转录RevertAid第一链cDNA合成装备。使用SYBR绿色PCR定量实时PCR进行组合在7500年ABI棱镜ht(应用生物系统公司)与GAPDH消极的控制。使用的引物对如下:hIL-1β,ATGATGGCTTATTACAGTGGCAA GTCGGAGATTCGTAGCTGGA;hMMP2, TACAGGATCATTGGCTACACACC GGTCACATCGCTCCAGACT;hMMP9, GGGACGCAGACATCGTCATC TCGTCATCGTCGAAATGGGC;hTIMP1, AGAGTGTCTGCGGATACTTCC CCAACAGTGTAGGTCTTGGTG;hTIMP2, AAGCGGTCAGTGAGAAGGAAG GGGGCCGTGTAGATAAACTCTAT;hGAPDH, AGCCACATCGCTCAGACAC GCCCAATACGACCAAATCC;mIL-1β,GCAACTGTTCCTGAACTCAACT ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT;mMMP2, CAAGTTCCCCGGCGATGTC TTCTGGTCAAGGTCACCTGTC;mMMP9, CTGGACAGCCAGACACTAAAG CTCGCGGCAAGTCTTCAGAG;mTIMP1, GCAACTCGGACCTGGTCATAA CGGCCCGTGATGAGAAACT;mTIMP2, TCAGAGCCAAAGCAGTGAGC GCCGTGTAGATAAACTCGATGTC;mGAPDH、AGGTCGGTGTGAACGGATTTG TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。

2.5。西方墨点法

组织和细胞与细胞溶解细胞溶解缓冲区包含50 mM Tris-HCl (pH值6.8),2%十二烷基硫酸钠,10毫米二硫苏糖醇、10%甘油、0.002%溴酚蓝,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏、巴塞尔、瑞士)。总蛋白进行量化使用皮尔斯BCA蛋白质分析工具包(ThermoFisher科学)。等量的蛋白质被加载并分离钠dodecylsulfate (SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳和转移到PVDF膜(美国微孔,Billerica的)。膜被封锁在5%牛血清白蛋白或脱脂牛奶和孵化与抗体在一夜之间在4°C。主要的il - 1抗体βMMP2, MMP9、TIMP1 TIMP2,胶原酶,胶原酶III p-p38增殖蛋白激酶(MAPK), p蛋白质激酶B(一种蛋白激酶),一种蛋白激酶,p-phosphatidylinositol 3激酶(PI3K), PI3K和β肌动蛋白从细胞信号技术购买(丹弗斯、马、美国)。3 x洗TBS-Tween 20后,膜与二次孵化抗体结合辣根过氧化物酶在室温下1小时。使用化学发光蛋白乐队是可视化。

2.6。细胞生存能力分析

CCK8试验进行分析细胞的可行性。细胞被播种在五倍的96孔板的密度 细胞/好和维护在湿润的气氛中5%的有限公司₂在37°C。镀细胞与il - 1孵化β5、50或100 ng / mL浓度不同的时间。细胞被处理10μL /好CCK8解决方案(Dojindo分子技术,日本)2小时。每个是由一个微型板块中的OD450读者,反映总每个条件下可行的细胞的数量。

2.7。迁移分析

一个刮伤试验是用来评估细胞的能动性。正常健康的成纤维细胞或成纤维细胞被播种的糖尿病患者6厘米的菜肴。使用消毒200汇合的细胞被刮掉μL小费,不依从细胞和介质冲洗掉。健康的成纤维细胞被治疗剂量的il - 1表示β为72小时。细胞迁移分数使用显微镜拍摄,并覆盖总面积的百分比计算每个图像中的细胞使用ImageJ(美国国立卫生研究院)。三个独立的实验进行。

2.8。ELISA

测定il - 1β在临床样本或小鼠的血清进行了使用人类或鼠标il - 1βQuantikine酶联免疫试剂盒(研发系统),分别根据制造商的指示。

2.9。统计分析

数据被表示为 (SD)从至少三个或更多独立的实验。使用学生的统计显著性计算 - - - - - -测试或单向方差分析图基的事后测试紧随其后。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。il - 1β水平增加糖尿病患者的伤口

研究il - 1的作用β在糖尿病患者的伤口愈合,我们收集血清和伤口组织从正常和糖尿病个体和ELISA /执行西方印迹测量蛋白质水平的il - 1β在血清和组织,分别和qPCR测量il - 1β信使rna水平。我们发现,il - 1β在糖尿病患者的血清调节(图1(一))。一致,信使rna和蛋白质含量也增加糖尿病患者的伤口组织与正常组织相比(数字1 (b)和1 (c))。然后,我们评估水平的il - 1β伤口组织从db / db 2型糖尿病伤口愈合小鼠模型,观察il - 1的表达β明显高于血清和伤口从糖尿病小鼠与正常小鼠相比(数据吗1 (d)和1 (e))。在一起,这些结果表明il - 1β在伤口组织糖尿病条件下调节。

3.2。高水平的il - 1β抑制成纤维细胞的增殖和迁移

我们培养主要从正常或糖尿病患者的伤口成纤维细胞组织体外和观察到的细胞增殖减少糖尿病患者成纤维细胞(足协)相比,正常成纤维细胞(负反馈)(图2(一个))。然后,我们评估il - 1的影响β成纤维细胞增殖和观察到低剂量il - 1β没有影响或促进细胞增殖而高剂量显著地抑制成纤维细胞的增殖(图2(一个))。此外,刮伤试验被用来决定细胞的能动性和我们发现足协显示损害迁移能力相比负反馈。对迁移的影响依赖于il - 1的含量β当我们观察细胞迁移减少il - 1的浓度增加β(图2 (b))。总的来说,这些结果表明,高水平的il - 1β影响成纤维细胞的细胞增殖和迁移体外。

3.3。基质金属蛋白酶的表达调节糖尿病伤口而TIMP蛋白表达下调

几项研究显示,基质金属蛋白酶是潜在的预测标记受损伤口关闭在糖尿病足溃疡17),我们下一个测量蛋白质和mRNA水平的MMP-2, MMP-9, TIMP1和TIMP2组织和培养的成纤维细胞从糖尿病患者的伤口患者和正常对照组比较。我们发现,MMP2和MMP9的mRNA表达显著调节糖尿病患者的伤口当TIMP1的表达和TIMP2抑制剂MMP2和MMP9,分别显著下调在糖尿病伤口相比正常伤口(图3(一个))。然后我们评估TIMP1和TIMP2表达在db / db伤口组织和控制老鼠和观察到的类似的效果(图3 (b))。这些结果进一步证实了通过免疫印迹使用样本的蛋白质水平糖尿病和非糖尿病患者的伤口。MMP2和MMP9在糖尿病伤口样品中蛋白表达明显高于非糖尿病患者相比,伤口,而TIMP1和TIMP2糖尿病创面组织中表达水平明显下降(图3 (c))。然后我们验证这些结果在培养的成纤维细胞,观察到mRNA和蛋白水平MMP2和MMP9调节在足协TIMP1和TIMP2表达下调(数字3 (d)和3 (e))。综上所述,我们的结果表明,糖尿病条件增加伤口组织同时MMP的表达蛋白表达下调表达TIMP的蛋白质。

3.4。il - 1βTIMP的诱导基质金属蛋白酶的表达,下调表达的蛋白质体外

我们下一个评估il - 1的影响β基质金属蛋白酶的表达和TIMPs主要的成纤维细胞体外。il - 1β发现移植MMP2和MMP9的表达方式存在剂量依赖的相关性qPCR量化,同时抑制TIMP1的表达和TIMP2(图4(一))。我们观察到类似的结果在测量通过免疫印迹蛋白质表达。il - 1β我抑制胶原酶的表达,促进伤口愈合和TIMP1 TIMP2同时促进MMP2和MMP9的表达(图4 (b))。这些结果表明,水平的MMP与TIMP蛋白质参与伤口愈合的过程直接由il - 1β。

3.5。il - 1β表达调节p38 MAPK通路的激活

我们测量了il - 1的影响β治疗p38 MAPK的激活,PI3K和AKT通路在培养的成纤维细胞。il - 1β治疗增加p38剂量依赖性的方式但不是一种蛋白激酶的磷酸化和PI3K(图5(一个))。我们下一个测量基质金属蛋白酶的表达水平和TIMPs p38 MAPK抑制剂的存在和缺乏SB203580 (10μ米)和观察到一种抑制剂治疗降低il - 1的影响β在ECM重塑蛋白基质金属蛋白酶的表达和TIMPs胶原酶(图5 (b))。此外,抑制剂治疗也降低il - 1的影响β在细胞增殖(图5 (c))。在部分磷酸化p38的表达明显高于糖尿病伤口相比,非糖尿病患者伤口样品(图5 (d))。在一起,这些结果表明il - 1β调节ECM重塑蛋白的表达在伤口组织通过p38 MAPK通路在糖尿病。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们证实了增加il - 1的含量β2型糖尿病患者也是之前报道的几项研究[18,19]。目前关于糖尿病的病理生理学理论概念化作为促炎的疾病状态的特点,除此之外,il - 1的水平升高β。封锁的il - 1的影响β因此,一个有前途的研究集中在糖尿病治疗20.]。toll样受体和nod样受体蛋白质3 (NLRP3) inflammasome interleukin-1β似乎,所有参与糖尿病的发病机制21]。几项研究已经强调了il - 1在2型糖尿病的发病机制中的重要性和确认它是一种有前途的治疗策略22- - - - - -25]。尽管Mandrup-Poulsen和AIDA研究小组(2013)报道,il - 1抑制剂治疗1型糖尿病(不是有效26),其结果在降低2型糖尿病仍有待评估。为了追求这种方法作为一种有效的治疗策略,分子机制il - 1在2型糖尿病的影响是必要的。

il - 1的作用β在糖尿病伤口愈合之前被描述。殿下等人报道,il - 1β扮演一个关键的角色在维持炎性巨噬细胞表型和损害糖尿病伤口的愈合15]。il - 1受体的抑制剂治疗逆转受损的伤口愈合过程在糖尿病小鼠模型(27];然而,这种影响背后的机制并没有阐明。我们观察到高浓度的il - 1β触发糖尿病伤口组织基质金属蛋白酶的分泌,抑制TIMP的表达蛋白质干扰ECM重塑和伤口关闭。在肺纤维化的过程中,il - 1β刺激成纤维细胞的增殖和I型和III胶原蛋白的生产28]。Furuyama等人il - 1的描述β诱发MMP-2和MMP-9成纤维细胞的分泌,从而抑制基底膜的形成(29日),这是按照我们的结果。这些发现表明,il - 1β调节成纤维细胞的形成和降解ECM;然而,研究之间的差异可能是由于il - 1的水平β作为我们也观察到一个抑制成纤维细胞增殖和迁移作用只有在高浓度下,观察到糖尿病患者样本,而低浓度il - 1β促进细胞增殖。

ECM重塑是一个主要要求伤口关闭(30.)和基质金属蛋白酶是一种重要的家庭细胞移民相关的蛋白质,可以降低不同组件的ECM (31日]。我们的研究结果显示,信使rna和蛋白质含量的基质金属蛋白酶在糖尿病伤口都高于对照组,而TIMP水平低。这些结果表明,糖尿病伤口的特点是大崩溃的ECM,伤口愈合延迟的现象。许多研究证明,基质金属蛋白酶水平较高的慢性伤口的渗出液比急性伤口,如糖尿病足溃疡(32]。增加il - 1β刺激基质金属蛋白酶的表达,抑制TIMPs和胶原酶表明il - 1的生产β促进ECM降解,在糖尿病延迟伤口愈合的过程。

我们也观察到,il - 1的作用β可能至少部分由p38 MAPK通路。众所周知,p38 MAPK能够调节多种细胞反应的细胞因子和压力,包括il - 1β(33]。p38发现促进胃腺癌的入侵和迁移细胞通过增加水平的基质金属蛋白酶(34]。的il - 1β培养成纤维细胞导致增加磷酸化p38剂量依赖性的方式而在一种蛋白激酶和PI3K它显示没有影响。磷酸化p38 p38的活化形式,也明显高于部分糖尿病患者比非糖尿病患者的伤口和伤口组织p38 MAPK抑制剂治疗SB203580逆转il - 1的影响β在ECM重塑蛋白表达。

5。结论

综上所述,我们的研究表明,il - 1β介导的糖尿病患者伤口愈合延迟改变水平的ECM重塑蛋白通过p38 MAPK通路的激活从而影响细胞增殖和迁移。它还确定了il - 1β作为一个潜在的治疗目标治疗2型糖尿病患者的伤口延迟关闭。

缩写

MMP的:	基质金属蛋白酶
TIMP:	的金属蛋白酶组织抑制剂
NLRP3:	nod样受体蛋白质3
ECM:	细胞外基质
MAPK:	增殖蛋白激酶
一种蛋白激酶:	蛋白激酶B
PI3K:	磷脂酰肌醇3激酶。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果都包含在这篇文章中,根据要求可从相应的作者。

伦理批准

本研究通过上海第六人民医院伦理审查委员会隶属于上海交通大学。

的利益冲突

所有的作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

戴Jiezhi负责调查和写初稿。俊杰沈负责的方法。义民庙柴负责编写、审查和编辑。华陈负责概念化、写作、审查和编辑。Jiezhi戴秉国和沈俊杰同样作为第一作者的贡献。

确认

赞助了本文研究和处理费用由上海市卫生委员会的资助(20204 y0430)。