文摘

饮酒导致的肝损伤引起炎症和氧化应激作为重要的介质。尽管严谨的研究,仍然没有食品和药物管理局(FDA)批准治疗酒精性肝病(ALD)的任何阶段。有趣的是,二甲双胍(满足)和一些益生菌菌株具有抑制酒精性肝损伤的潜力。因此,我们研究了联合治疗的有效性,使用8株乳酸细菌制造酸性物质的混合物,商业化是Visbiome®(V)和在防止ethanol-induced肝脏损伤在体外和在活的有机体内模型。人类HepG2细胞和雄性Wistar鼠暴露在乙醇和同时用益生菌治疗V或单独会面以及组合。内质网(ER)压力标记,炎症标记物,脂质代谢、活性氧(ROS)生产、和氧化应激评估,使用中存在,油红O染色,荧光测定法和高效液相色谱法。在体外结合,益生菌V和阻止ethanol-induced细胞损伤,ER应激,氧化应激,调节脂质代谢以及在HepG2细胞炎症反应。益生菌V和满足也促进巨噬细胞极化M2在ethanol-exposed生264.7巨噬细胞细胞表型。在活的有机体内,组合益生菌V和管理改善的组织病理学变化,炎症反应,肝标记(肝酶)和脂质代谢乙醇引起的。它也提高了抗氧化剂标记(HO-1和Nrf-2),所看到的的蛋白质水平HepG2细胞以及肝组织使用ELISA。因此,益生菌V可能采取行动,除了满足,是一种有效的预防性治疗对ethanol-induced肝损伤。

1。介绍

饮酒导致的肝损伤的主要根源是发病率和死亡率之间的普遍滥用酒精的人(1]。慢性饮酒最终导致退化,包括脂肪变性、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化,最近,肝细胞癌(HCC) (2]。一些研究报道,氧化应激和炎症反应中发挥关键作用的开发和进展饮酒导致的肝损伤(3,4]。几个发展背后的原因是(A)的促炎症酶的表达,细胞因子和趋化因子通过枯氏细胞激活5)和(b)生产过剩的活性氧(ROS)导致ROS-mediated肝损伤(6),而这最终会导致氧化应激(ROS生成过多会导致增加氧化剂形成和减少水平的抗氧化剂)(7)和脂质过氧化(ROS增加生产导致4-HNE形成加合物的生成与蛋白质和DNA) (8]。因此,抑制炎症和氧化应激会发挥重要作用在防止ethanol-induced肝损伤。直到,有限的可接受的发展已经完成在控制肝损伤的进展。因此,独特的和值得信赖的强烈需要的治疗方法。

二甲双胍(满足)是一种常见的抗高血糖药批准药物双胍家族的常用控制2型糖尿病。在人类中,有一个弹性肝胰岛素抵抗之间的联系和肝病以及脂肪肝。在许多动物和人类的研究,表明保护在纳什和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。在非酒精性脂肪肝患者,遇到治疗显示减少肝脏功能障碍(9]。非酒精性脂肪肝的接受历史退化的相似之处。某些研究结果显示,脂肪肝,酒精或不含酒精的,显示相似的机制和病理特点。某些研究表明,肠道微生物群可能遇到的治疗效果中起关键作用,阐明这一事实胃肠道(GIT)是一种重要的网站见过行动10- - - - - -12]。甚至有显著的治疗效果,改善了使用肠道微生物组调节器益生菌可能会减少氧化应激和ER压力和增加抗炎细胞因子的水平。

另一方面,在过去的二十年里,在食品和饲料行业以及临床和医学领域,益生菌的应用程序增加了由于其各种功能。益生菌被定义为单一栽培或各种文化的微生物,可以充分管理改善肠道微生物群的功能性质13]。最近的一项研究表明,浮在表面的游离获得不同的益生菌菌株,即嗜酸乳杆菌,乳酸菌bulgaricus,乳酸链球菌,双歧杆菌longum,乳杆菌,具有潜在的抗氧化剂,能够清除超氧化物自由基和羟基自由基。这些自由基会导致氧化应激,因此upregulation促炎细胞因子。体外益生菌的作用机制可能部分是由于它的抗氧化潜力,减少氧化应激和与之相关的进一步损害(14,15]。有报道表明,益生菌释放某些细胞组件(也可以溶解产物游离的一部分),这可能会导致免疫调节,通过调节免疫细胞的激活(16]。益生菌Visbiome®(V)(位于马里兰州Rockville ExeGi制药,LLC)(原德西蒙配方)是8株乳酸细菌制造酸性物质的混合物(嗜酸乳杆菌,乳酸菌paracasei,乳酸菌delbrueckii亚种bulgaricus,乳杆菌,双歧杆菌longum,双歧杆菌属对象,双歧杆菌谕令,唾液链球菌亚种酸奶)。益生菌V包含相同的配方中发现:# 3(销售:制药、Inc .)生产前1月31日,2016年。在,饮酒导致的肠道屏障损伤:# 3 / heat-killed: # 3单独或连同谷氨酰胺是被证明是有效地减少肠道通透性和移植紧密连接蛋白的表达,从而防止类毒素和其他细菌产品进入门脉循环,因此导致下调TNF -α表达式[17]。:# 3治疗酒精性肝硬化患者3个月(AC)组( )显著降低血浆水平的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和gamma-glutamyl转移酶(GGT)和降低MDA的水平和4-HNE,而血浆细胞因子TNF -α和il - 6以及增加il - 10水平降低(18]。

益生菌与管理可以帮助在维护肠道完整性会见了改善的功效,最近的研究证明,治疗Akkermansia种虫害改善葡萄糖稳态,暗示效果更佳的满足通过肠道调制(10]。各种报告表明联合治疗的有利影响益生菌和在许多疾病包括糖尿病、结肠癌,非酒精性脂肪肝(NASH)的存在(12,19,20.),但有狭窄的努力评估益生菌的联合政府可能带来的好处和在ethanol-induced肝损伤。基于上述研究益生菌的保护作用和对酒精性肝损伤,目前的研究评价益生菌V和遇到的综合效应调制ethanol-induced肝脏损伤在体外和在活的有机体内模型。

2。材料和方法

完全从Himedia实验室获得的每个化学/试剂(印度),除了指定。分子级乙醇(纯度99.8%)(Himedia实验室、印度)购买的诱导肝损伤。遇见是购自Sigma-Aldrich(美国)。DMEM(杜尔贝科的修改鹰介质)和rpmi - 1640买来Gibco(美国)。胎牛血清(的边后卫)从英杰公司购买(美国)。试剂盒试剂、DCFDA DNase-I,互补脱氧核糖核酸合成装备,SYBR绿色主人买来混合热费希尔科学(美国)。所有的引物序列都从Sigma-Aldrich(美国)。中使用的所有化学品购买高分子生物学的实验成绩。

2.1。细胞培养

在目前的研究中,我们使用264.7 HepG2细胞和原始细胞,从国立细胞科学中心(国立),印度浦那。总之,HepG2细胞在DMEM培养和维护21264.7)和生在rpmi - 1640细胞培养介质(22与10%的边后卫和1% antibiotic-antimycotic补充5%的解决方案在湿润的气氛中有限公司₂在37°C。

在整个实验过程中,完整的文化中被移除和改变了每隔一天3 - 4天。通过用于进一步的实验是在20到35岁之间。264.7 confluency达到70%之后,HepG2细胞和原始细胞无血清培养系统中维护各自的隔夜和孵化与乙醇以及益生菌V和见过像益生菌单独或结合,在乙醇的存在。

2.2。准备使用益生菌的细菌溶菌产物Visbiome®

Visbiome®(很多# 07197721)是一个复杂的益生菌组成的财团 CFU /胶囊三个可行的冻干菌种:4株乳酸杆菌(嗜酸乳杆菌,乳酸菌paracasei,乳酸菌delbrueckii亚种bulgaricus,乳杆菌),3株双歧杆菌(双歧杆菌longum,双歧杆菌属对象,双歧杆菌谕令),唾液链球菌亚种酸奶。益生菌Visbiome®包含1 g (V)的股票是悬浮在德曼,Rogosa,夏普琼脂(夫人)肉汤激活文化。一夜之间活性益生菌文化V是离心的速度6000转10分钟(4°C)。离心后,文化都洗两次无菌PBS和resuspended最终浓度为10⁸汤夫人CFU /毫升。

益生菌文化在各自的最终浓度是用V 30分钟(重复10声波降解法和10年代持有)的超声发生器。细菌培养是离心机(1500×·g 10分钟),和个人的上层清液(全细胞提取)。此外,包含全细胞提取的上层清液离心机(6500 g×30分钟)的细胞胞质(上层清液)和膜(颗粒)。证实了细菌细胞破坏测量光密度介绍过o。d。邓肯()的每个样本在每个声波降解法600海里后,直到达到一个持久的价值。每个样品蛋白质浓度测定用布拉德福德试验(23]。总蛋白浓度被发现之间的4和6毫克/毫升细菌溶菌产物。益生菌的总细胞液体悬浮在DMEM / rpmi - 1640 V当时在适当的浓度,进一步保持在−20°C实验。

2.3。细胞生存能力分析

在目前的在体外实验,HepG2细胞线暂停处理细菌溶菌产物的最终浓度10、50和100μl / ml,对应1、5、10毫克(冻干细菌质量)/毫升。细胞补充总细菌的溶菌产物(10、50和100μl /毫升)对应于10⁸, ,和10⁹在培养基CFU /毫升。对于每一个实验,新鲜的益生菌的细菌溶菌产物V和准备实验研究(图1)。

乙醇的浓度决定基于文献调查24]。(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)分析是用来确定描述的细胞生存能力Kema等。22]。简而言之, 在96孔板的细胞被播种。细胞获得所需的confluency之后,他们被暴露于不同浓度的益生菌V(10、50和100μl /毫升)和满足(1、2和3毫米),单独和组合剂量(10μl /毫升益生菌V 1毫米,2毫米,和3毫米;50μl /毫升益生菌V 1毫米,2毫米,和3毫米;100年μl /毫升益生菌V与1毫米,2毫米,和3毫米)的存在和没有100毫米乙醇48 h。治疗后48小时,每个孵化了10μl (MTT的解决方案(0.45 mg / ml:最终浓度)和在黑暗中保持在37°C有限公司5%₂大气对3 h。潜伏期结束后每个,100μl(二甲亚砜(DMSO)添加到甲瓒溶剂合物晶体。决定细胞生存能力,吸光度测量每个样品在570 nm和计算方程(1)如下:

的吸光度和Ac代表样品处理和控制,分别。

2.4。体外诱导肝损伤模型用乙醇刺激同时益生菌Visbiome®和二甲双胍

诱导肝损伤, HepG2细胞被镀在60毫米文化菜肴和孵化在37°C 3 - 4天。同样的, 264.7原始细胞被镀在60毫米文化菜肴和孵化在37°C 2 - 3天。融合性的细胞都孵化与ethanol-containing媒介48 h诱导肝损伤。1%乙醇中由DMEM antibiotic-antimycotic解决方案,和100毫米乙醇。因此,我们分配HepG2细胞和原始264.7细胞1 - 5组:对照组(a)未经处理的264.7和原始细胞HepG2细胞;(b)的乙醇对照组HepG2细胞和原始264.7细胞接受100毫米乙醇48 h诱导肝损伤;(c)测试group1: HepG2细胞和原始264.7细胞治疗3毫升DMEM包含1毫米浓度以及会见了100毫米乙醇48 h;(d)的另一项测试group2: HepG2细胞和原始264.7细胞治疗3毫升DMEM包含10μl /毫升益生菌V连同100毫米乙醇48 h;(e)组合组:264.7和原始细胞HepG2细胞治疗10μl /毫升益生菌V和1毫米稀释在3毫升DMEM会见了100毫米乙醇48 h。所有的组接受油红O染色,氧化应激估计,ER应激量化,ROS的决心,和细胞因子的表达分析。

2.5。与伴随的益生菌体内慢性乙醇喂养Visbiome®和二甲双胍

雄性Wistar鼠(8到10周大)重150 - 200克从Zydus-Cadila医药行业采购分公司(印度)。老鼠住在标准笼子(两个鼠/笼)和美联储正常食物的饮食在实验的起始Lieber-DeCarli液体饮食喂养。所有动物包括委员会批准的程序控制和监督的目的动物实验动物伦理委员会(CPCSEA)和机构(IAEC)。

体重和年龄的老鼠有一个ethanol-fed pair-fed Lieber-DeCarli饮食。他们适应与Lieber-DeCarli液体饮食第一2天。Ethanol-fed组被允许免费获取一个完整的Lieber-DeCarli液体饮食包括乙醇。在这个实验中,pair-fed饮食含有麦芽糊精(代替isocalorically)是控制整个喂养老鼠的时期。Ethanol-induced肝损伤模型(25天,总热量的32%)中乙醇的含量增加(卷/期):1%(2天),2%(2天),4%(7天),5%(7天),最后6%(7天)25]。

6%(卷/期)Lieber-DeCarli液体饮食含有乙醇提供了饮食总热量的32%。益生菌V,以及满足,是提供给老鼠剂量的10⁸CFU /天,75毫克/公斤,分别口服填喂法在特定时期内的乙醇喂养和pair-fed喂养。乙醇和pair-fed暴露喂养协议后,血从后腔静脉注射器和包含EDTA喷射成管状。Overnight-fasted老鼠被放血安乐死方法(如CPCSEA指南中提到的),和肝脏切除。其他小的部分肝脏在福尔马林固定,冻结在最佳切削温度(10月)中,并存储在RNA后隔离RNA的-20°C。从全血、血清分离,保持在-80°C,直到进一步的使用。

2.6。ROS估计

评估氧化应激引起的乙醇在益生菌的存在与否V和满足,控制和治疗细胞治疗与乙醇和益生菌V和48 h。治疗后,细胞被孵化与在黑暗中carboxy-H2-DCFDA绝对浓度的30μ在37°C M 1小时。这些细胞被刮掉,200μl细胞的样本添加到微量滴定板,和样品测定的荧光激发波长-485 nm和发射波长-530 nm近似ROS的总生产使用荧光分光光度计(美国珀金埃尔默LS-55) [26]。

2.7。氧化应激评估:MDA由高效液相色谱分析方法

控制和治疗细胞用1毫升PBS去除培养基。然后,细胞在220×g离心5分钟在4°C。上层清液被移除,并在200年获得的颗粒是resuspendedμPBS的l。然后,细胞被用在RT 7分钟,溶解细胞膜,释放总MDA,进一步离心机在3500 g×15分钟在4°C。样本包含用细胞(500μl)是孵化6 M氢氧化钠(氢氧化钠)(100μl) 45分钟在水浴60°C。样品被酸化高氯酸(250年为35%μl)。水解样品在15000×g离心10分钟。然后,上层清液(250μl)收集和混合2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) (25μl)的解决方案。这是进一步孵化在黑暗中10分钟。通过高效液相色谱法(美国水域Breeze-2),由此产生的样本进行了分析通过ODS2反相柱高效液相色谱法(美国水域Breeze-2)。乙腈和高效液相色谱级水有0.2%的醋酸比38:62年,分别是作为流动相。高效液相色谱法是在权力平等主义的条件下流速为0.5毫升/分钟,和MDA的样本使用紫外检测器检测到310海里。

标准曲线的制备:20 nmol /毫升的MDA标准溶液由TEP (TCI,日本),进一步稀释1%的H₂所以₄收益率最终浓度的0.10,0.20,0.31,0.62,1.25,2.50,5.00,和10.00 nM /毫升的MDA。到250年μl的标准,25岁μl DNPH补充,在黑暗中孵化了10分钟。样本分析高效液相色谱使用相同的程序,用于细胞培养的样品(27]。

2.8。通过油红O染色法测定脂质积累HepG2细胞

了解变化发生在控制和治疗细胞由于细胞中脂类的积累和评价减少ethanol-induced肝损伤,油红O染色了。经过48小时的潜伏期,控制和治疗细胞孵化1小时在室温下(RT) 1毫升的10%中性缓冲福尔马林。这些细胞被然后用milli-Q冲洗两次。油红O染色(股票的解决方案:100毫升的0.5%异丙醇,1毫升;工作解决方案:3:2比例稀释milli-Q)添加到细胞中。细胞在RT孵化15分钟。这些细胞被洗两次与milli-Q消除过度的污渍。细胞被科尔的苏木精复染色解决方案30 - 45分钟。额外的染色与milli-Q被洗细胞。在倒置显微镜下细胞观察和拍摄(马格努斯、印度)用PBS安装介质。

通过异丙醇油红O染色提取方法:确定控制和治疗细胞间脂质积累的差异,与油红O染色细胞后,污渍与绝对异丙醇提取。提取的油红O染色测定spectrophotometrically在570海里使用异丙醇作为空白28]。

2.9。测量血清肝损伤指数和脂质成分

血清样本测量对丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)。检查水平的饮酒导致的人体脂质代谢异常,血清总胆固醇和甘油三酯的水平测量使用商业酶试剂盒,根据设备制造商的协议。所有的实验进行了一式三份,各自的浓度测定。

2.10。脂质分析

脂质在肝脏被使用的比例提取2:1 v / v氯仿:甲醇溶液混合固定数量的正常肝组织和均质。匀浆离心机在5000转10分钟。lipid-containing底部收集解决方案,然后,球被蒸发氯仿获得通过使用真空离心浓缩器离心2 h。后,脂质是随着使用氯仿,然后,肝甘油三酯和总胆固醇是使用定量测量的测量工具和随后根据设备制造商的协议(29日]。

2.11。隔离的RNA,互补脱氧核糖核酸的合成,存在

从控制和治疗细胞总RNA分离使用试剂盒试剂以及肝脏。纯度和浓度的RNA样品测量在260 nm, A260 / A280比率的样本决定使用Nanodrop 2000(美国Thermofisher科学)。DNA污染的RNA样本被治疗的RNA样品DNase我酶。从完整的RNA,约1μg是用来合成cDNA使用合成第一链cDNA工具包。qPCR, maxima SYBR绿/火箭qPCR大师混合被用来量化所有基因的信使rna表达水平在安捷伦分析下Strategene Mx3005P系统。存在系统包含1μl cDNA、0.5μl (10μ0.5 M FP(正向引物)μl (10μM RP(反向引物),10μl SYBR绿色主人混合,和8.0μl milli-Q水20μl反应系统。2^{- - - - - -ΔΔCt}方法(褶皱改变基底)应用于评估HepG2-treated mRNA表达水平细胞和肝组织(30.]。提出了18 s rRNA作为内部参考基因控制。使用的引物序列不同的列表都列在下表中1- - - - - -3。

2.12。肝脏组织病理学观察

formalin-fixed肝断面处理最佳切削温度(10月)的媒介。5 - 10μ使用低温恒温器M部分被削减。石蜡切片是沾hematoxylin-eosin(他)解决方案识别肝细胞形态学的变化在老鼠区别对待。部分的幻灯片都是由一个侦探光学显微镜下检查治疗是不可见的状态。

2.13。蛋白质含量测定Nrf-2 HO-1在体外和体内Ethanol-Induced肝损伤模型

(一)HepG2细胞,游离上层清液用于分析Nrf-2和HO-1水平。治疗后,从每个测试板,细胞培养基是吸气,在1500转离心10分钟在4°C。分析了收集上层清液根据制造商的指示(英国Abcam plc)和测量在450海里。Nrf-2和HO-1蛋白质含量测定在皮克每毫升(b)分析Nrf-2水平ethanol-induced肝损伤模型中,核提取分离的大鼠肝脏组织。肝匀浆中孵化裂解缓冲(10毫米玫瑰;EDTA氯化钾pH值7.5,10毫米,0.1毫米,1毫米二硫苏糖醇(德勤)Nonidet-40 0.5%, 0.5毫米PMSF蛋白酶抑制剂的鸡尾酒)和允许膨胀与零星的混合冰为20分钟。样本涡和离心机在4°C 10000×g 10分钟。用作细胞质中提取获得的上层清液。后,颗粒被裂解缓冲和resuspended核提取缓冲(20毫米玫瑰(pH值7.5),400毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米德勤,1毫米PMSF和蛋白酶抑制剂鸡尾酒)在冰和孵化了30分钟。核提取离心收集的12000 g×15分钟在4°C。蛋白质含量检查使用布拉德福德试剂(31日]

分析HO-1 ethanol-induced肝损伤模型中的水平,100毫克的肝组织与1毫升PBS和均相混合。匀浆离心机在5000 rpm 10分钟在4°C,由此而来的上层清液作为肝脏组织匀浆。蛋白质含量检查使用布拉德福德试剂。

收集浮在表面的游离核提取物,肝组织匀浆测定通过酶联免疫吸附试验(ELISA)根据协议由设备制造商(英国Abcam plc)。

2.14。统计分析

所有各自的实验进行至少三次。数据复制计算的 。GraphPad棱镜7软件(GraphPad软件公司,加州公司)被用来分析结果。所有组之间的差异进行了分析使用一个单向方差分析(方差分析)。组间变异被认为是重要的值小于0.05。

3所示。结果

3.1。益生菌V和满足改善HepG2细胞的可行性

益生菌毒性V(10、50和100μl /毫升)和满足(1、2和3毫米)分别对HepG2细胞评估的存在和没有100毫米乙醇(表4)。组合的作用剂量的益生菌V和(10μl /毫升益生菌V和1、2和3毫米相遇;50μl /毫升益生菌V和1、2和3毫米相遇;和100年μl /毫升益生菌V 1, 2, 3毫米了)也被评估为测量细胞的生存能力对HepG2细胞治疗在乙醇的存在和没有100毫米(数字1(一)和1 (b))。

无论是个人益生菌治疗V还是与在不同浓度显示重要的细胞死亡HepG2细胞没有100毫米的乙醇。然而,有轻微减少观察到细胞的生存能力处理3毫米单独会面。对HepG2细胞治疗100毫米乙醇诱导细胞死亡,因此,只有64.6%的细胞生存能力观察48 h 100毫米乙醇处理后(即比未经处理的细胞。,95.7%)。益生菌是否V可以防止ethanol-induced毒性,HepG2细胞对益生菌V 100毫米乙醇的存在。我们的研究结果表明,V益生菌治疗不同浓度(10、50和100μl /毫升)显示增加存在剂量依赖的相关性在细胞生存能力(分别为81.9%,83.1%,和85.5%)相比,ethanol-exposed HepG2细胞48 h。遇到的影响在不同浓度的乙醇也被评估为100毫米测量细胞HepG2细胞的可行性。细胞暴露于100毫米乙醇的可行性的单独会面显示剂量依赖性细胞生存能力下降(分别为82.7%,81.6%,和67.9%)相比,ethanol-exposed HepG2细胞48 h,这是暗示在毒性的浓度更高。

与益生菌治疗V仅显示增加存在剂量依赖的相关性,和治疗单独会面显示减少可行性存在剂量依赖的相关性,我们检查如果益生菌V和遇到的组合可以在协同工作时提高细胞HepG2的可行性治疗的100毫米乙醇。组合剂量的益生菌V和遇到不明显影响HepG2细胞治疗的可行性没有100毫米的乙醇在所有不同的组合。然而,我们观察到益生菌治疗V在不同浓度救出3毫米的毒性遇见和提高细胞生存能力。这表明益生菌V可以提高二甲双胍降低其毒性的功效在更高的浓度。同时,细胞治疗的可行性与100毫米乙醇的存在的不同组合益生菌提高V和满足相比ethanol-treated HepG2细胞在缺乏益生菌V和满足,这表明益生菌V和遇到的有益作用组合治疗。最显著的差异观察细胞生存能力与100的组合μl /毫升益生菌V和1毫米(87.3%),但这种差异没有显著不同的细胞治疗相比,只有100μl /毫升益生菌V的乙醇(85.5%)。作为我们研究的目的是看看益生菌V和满足可以协同工作防止ethanol-induced HepG2细胞毒性,我们选择的组合10μl /毫升益生菌V和1毫米,因为这种组合显著提高细胞的可行性ethanol-exposed HepG2细胞,比各自单独治疗。

3.2。益生菌V和提高了形态学在HepG2细胞线

HepG2细胞乙醇处理时显示其形态学的变化被收缩的细胞的细胞膜和扭曲的形状(图2 (b)相比),上皮的形状控制细胞。达到或益生菌V-treated缺乏乙醇也保持了正常的上皮细胞的形状类似于未经处理的控制HepG2细胞。益生菌V和阻止了细胞损伤引起的单独会面由于乙醇通过保持原来的形状。然而,益生菌V和满足,在组合(图2 (d)),改善ethanol-induced损害相对比益生菌的个体治疗V或满足。

3.3。益生菌V和满足改善肝脏组织病理学变化的体内模型Ethanol-Induced肝损伤

组织学分析控制老鼠的肝组织表现出描述正常组织学(肝细胞有明显的细胞质,细胞核、核仁和中央静脉)。ethanol-fed老鼠表现出显著增加脂肪滴细胞炎症的渗透和无序安排代表肝细胞的病理变化与对照组相比。与这相比,遇到(75毫克/公斤)描述拥挤的中央静脉和无序排列的肝细胞。另一方面,益生菌V (10⁸CFU /天)显示正常肝细胞和中央静脉完全恢复。此外,饲喂益生菌V和在组合能显著防止肝脂质积累和保护肝细胞与益生菌V或(图单独会面3)。这些结果描述,结合治疗的益生菌V和遇到帮助恢复正常肝的架构。

3.4。益生菌V和防止氧化应激在HepG2细胞线

MDA水平的浓度采用高效液相色谱法在ethanol-exposed HepG2细胞被发现增加( nM /毫升)相比,控制细胞( nM /毫升)。与益生菌V和在组合更有效地降低MDA的水平( nM /毫升)相比ethanol-exposed HepG2细胞。然而,有一个显著差异在益生菌V (MDA的水平 nM /毫升)或满足( nM /毫升)治疗组相比,组合剂量的益生菌V和在ethanol-exposed HepG2细胞(图4)。因此,目前的数据表明,益生菌V和在组合在预防ethanol-induced氧化应激是有益的。

3.5。益生菌V和抑制活性氧的生产在HepG2细胞线

ROS生产评估仅通过荧光光谱在HepG2细胞暴露于乙醇和乙醇的益生菌V和单独会面,以及结合在一起,然后用carboxy-H2-DCFDA孵化在最后30的浓度μ在37°C M 1小时在黑暗中。Cotreatment ethanol-exposed细胞与益生菌V和在组合有关会见减少ROS生产相比,HepG2细胞暴露于乙醇,以及益生菌的个体治疗V或遇到相比(图5(一个))。因此,目前的数据表明,益生菌V和结合是有益的在改善ethanol-induced ROS生成。

3.6。益生菌V和抑制Ethanol-Induced ER应激在HepG2细胞线

慢性饮酒导致ER应激导致展开蛋白质的活化反应(UPR) [22]。mRNA的表达水平的ER应激标记葡萄糖调节蛋白78 (Grp78)和CCAAT enhancer-binding蛋白质同源蛋白质(切)透露,ethanol-exposed HepG2细胞显示增加了48小时的ER应激。在100 mM乙醇,益生菌V和管理遇到了单独或结合显示ER应激基因表达水平的降低与ethanol-exposed HepG2细胞。Cotreatment益生菌的V和显示显著差异在ER应激基因相比,益生菌V或遇到的个人治疗(图5 (b))。因此,组合益生菌治疗V和满足变弱ethanol-induced ER应激。

3.7。组合益生菌,V和相见Ethanol-Induced HepG2细胞内脂质堆积线

脂质积累进行了分析通过油红O染色显微镜下的细胞和量化使用分光光度计在异丙醇提取法(图570海里6(一))。确定益生菌V和满足单独或结合可以帮助减少HepG2细胞脂质积累的益生菌V和受到单独和联合会见了100毫米乙醇48 h。的总脂质积累细胞接触后益生菌V和单独或结合在会见了乙醇测定油红O提取过程。

总脂质积累被发现升高ethanol-exposed HepG2细胞相比,控制细胞。在益生菌V和管理单独会面以及结合ethanol-exposed HepG2细胞的脂质积累量下降在48 h。观察结果表明,完整的脂质积累在ethanol-exposed HepG2细胞,由益生菌V和恢复相结合,以更好的功效与益生菌V或遇到的个人治疗(图6 (b))。

3.8。益生菌组合V相遇,改善了Ethanol-Induced Upregulation血清肝酶水平与血脂标记体内的肝损伤模型

ALT、AST和高山是肝损伤的基本生化标记指示性。目前研究表明显著增加血清转氨酶(ALT和AST)和高山水平ethanol-fed大鼠与对照组相比。血清水平升高可由于流出细胞酶进入血液。益生菌V或满足治疗显著降低血清ALT, AST,和高山ethanol-fed组相比,这是进一步下调的两个组合相比,益生菌的ethanol-fed团体以及个人治疗V或满足。

血清,以及肝的内容总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG) ethanol-fed老鼠,都明显高于对照组相比,极大地降低了的益生菌的组合治疗V和满足相比,益生菌的ethanol-fed团体以及个人治疗V或遇到(图7)。这些结果表明,益生菌V和遇到的联合治疗可能改善ethanol-fed老鼠的肝脏代谢功能。

3.9。益生菌V和调节脂质代谢在体外和体内Ethanol-Induced肝损伤模型

慢性饮酒会导致肝脏的脂质代谢异常减少腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶(AMPK)的激活导致增加固醇调节元件结合蛋白1 c (SREBP-1c)表达式,进一步导致增加脂肪生成通过激活下游基因乙酰辅酶a羧化酶(ACC)和脂肪生成的脂肪酸合酶(FAS) ethanol-exposed HepG2细胞以及ethanol-fed老鼠。益生菌V或满足行政个体治疗激活腺苷单磷酸盐激活蛋白激酶(AMPK),脂质代谢的关键调节器,否则抑制的ethanol-exposed HepG2细胞和ethanol-fed老鼠。激活AMPK通过治疗达到或益生菌V抑制转录因子的表达,例如,sterol regulatory element binding protein 1c (SREBP-1c) (also a key regulator of lipid metabolism), thereby inhibiting the ethanol-induced lipogenesis. Consistent with the altered expression of SREBP-1c, it also decreases the expression of downstream lipogenic enzymes like acetyl-CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FAS) as compared to ethanol-exposed HepG2 cells as well as ethanol-fed rats, which was more significantly reduced as compared to either individual treatment of probiotic V or Met.

在肝脏,PPAR -γ和高速逻辑是目前在基础水平;然而,用乙醇治疗移植的肝脏表达PPAR -γ和高速逻辑与对照组相比,导致增加脂肪生成。治疗与益生菌V或满足的表达水平下调PPAR -γ和奥软导致减少脂肪生成比ethanol-exposed HepG2细胞以及ethanol-fed老鼠。这是进一步降低了两个更重要的组合相比,乙醇组和益生菌V - Met-unaided组(数字8和9)。我们的研究表明,组合益生菌治疗V和在乙醇的存在有效地调节脂质代谢,从而防止ethanol-induced脂肪生成。

3.10。益生菌V和满足缓解促炎/抗炎/氧化应激标记在体外和体内Ethanol-Induced肝损伤

Ethanol-induced肝脏损伤也会导致慢性炎症。因此,我们评估的影响益生菌V和单独会面,以及结合在炎症反应和氧化应激标记(数字10和11)。的信使rna表达水平ethanol-metabolizing enzyme-like细胞色素P450 2 e1 (CYP2E1)炎性标志物如il - 1β肿瘤坏死因子-α、诱导一氧化氮合酶(间接宾语)和受体介导炎症反应,即。,TlR-4, was found to be upregulated, and mRNA expression levels of anti-inflammatory cytokine like IL-10 and oxidative stress markers like heme oxygenase-1 (HO-1) and nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf-2) were found to be downregulated in ethanol-exposed HepG2 cells and ethanol-fed rats. We observed that mRNA expression levels of CYP2E1 and TLR-4 as wells pro-inflammatory markers were dramatically diminished, and anti-inflammatory cytokine IL-10 and oxidative stress markers (HO-1 and Nrf-2) were largely upregulated in ethanol-induced HepG2 cells and ethanol-fed rats treated with probiotic V and Met alone. However, probiotic V or Met in combination could additionally diminish the expression of pro-inflammatory markers and more significantly elevated the IL-10, HO-1, and Nrf-2 expression levels as compared to probiotic V or Met-unaided groups.

3.11。益生菌V和移植Nrf-2的生产和HO-1蛋白质含量在体外和体内Ethanol-Induced肝损伤

如图12,减少蛋白质的抗氧化水平,即。,Nrf-2 and HO-1, were observed in the ethanol group when compared with a control group. However, combined treatment of probiotic V and Met showed increased levels of Nrf-2 and HO-1 compared to the ethanol group, which was more significantly reduced as compared to either individual treatment of probiotic V or Met. Thus, combinatorial treatment of probiotic V and Met helps in reducing the production of Nrf-2 and HO-1 protein levels in both the在体外和在活的有机体内ethanol-induced肝损伤模型。

3.12。益生菌V和满足调节巨噬细胞的极化Ethanol-Exposed生264.7细胞系

巨噬细胞发挥重要作用在对抗病原体,组织修复、炎症整改。长期饮酒会导致巨噬细胞功能失调(32]。常数与这些结果,我们的数据也验证了264.7 ethanol-exposed原始细胞显示调节的基因表达标记的M1比控制细胞表型。未经处理的控制原始264.7细胞在形态学和小,但乙醇治疗改变其形状和细胞表明突触形态细长,指出结束。Cotreatment益生菌V和单独会面,并随着乙醇相结合改进的形态学与ethanol-exposed相比原始细胞(图264.713)。此外,组合益生菌治疗V和满足显示更重要的形态变化与个体治疗益生菌V或满足。在分子水平上,益生菌V或单独会面,并结合益生菌M1表型的观察标记物表达水平降低il - 6、il - 12, TNF -α地,进气阀打开,NADPH氧化酶1 (NOX-1)和M2表型的表达水平增加,如il - 10和Arginase-1相比ethanol-induced原始细胞(图264.714)。然而,组合益生菌治疗V和还显示显著差异在M1和M2表型巨噬细胞表达水平与益生菌的个体治疗相比V或满足。

4所示。讨论

食用酒精被认为是唯一的肝损伤发展的主要原因。过度饮酒溪流穿过门静脉到达肝脏发育毒性,导致肝细胞的氧化应激和脂质积累(33]。因此,氧化应激和炎症被认为是发展的两个重要球员ethanol-induced肝损伤(34,35]。研究ethanol-induced肝脏损伤,HepG2细胞作为一种被广泛使用在体外研究模式36]。一项研究也显示,二甲双胍能够调节巨噬细胞极化的微环境,防止HepG2细胞的增殖(37]。此外,肝脏被认为是乙醇代谢的主要器官。在肝脏、乙醇代谢乙醛和形式与蛋白质和DNA加合物,后来诱导各种变构变化导致丧失其功能(38]。一些报告显示,慢性饮酒导致组织病理学的修改,改变肝酶的活性和血脂水平(39]。ALT、AST和高山是至关重要的生化标记表明肝损伤(40]。目前研究表明显著增加血清转氨酶(ALT和AST)和高山ethanol-fed组水平。血清水平升高可由于流出细胞酶进入血液。临床上,对于诊断脂肪肝的变化很容易观察到,但肝组织学确诊是必要的肝脏肝损伤的程度。我们的结果符合上述报告描述增加ALT, AST,和高山水平大幅增加的脂质沉积,发生在中央小叶部分肝细胞肿胀的无序排列ethanol-fed老鼠,代表肝脏的病理形态学的改变。根据我们的协议,这些变化表明ethanol-induced肝损伤大鼠模型。目前,没有fda批准的药物可用于治疗或预防酒精肝损伤。节制饮酒的限制的唯一方法的开发和发展酒精肝损伤。目前,可用疗法治疗一个ethanol-induced肝损伤是单身,和治疗效果不理想41]。两个这样的个人认识疗法益生菌和满足预防酒精肝损伤(42,43]。然而,联合治疗有效的疗法可能提供不同的链接和目标治疗或预防ethanol-induced肝损伤。这是第一个报告,据我们所知,它提供了一个强有力的证据,表明益生菌V的新颖的协同效应结合遇到可能大大防止ethanol-induced肝损伤的发展。

朱镕基et al。(2014)发现二甲双胍的剂量200毫克/公斤/天减慢性乙醇暴露引起的肝损伤(44]。同时,据报道,肝纤维化是减少的益生菌乳酸菌口服剂量的10⁹CFU /毫升的体内模型(45]。因此,探讨益生菌V和满足的低剂量是否显示了一个针对ethanol-induced肝损伤保护作用单独管理和结合在一起时,我们选择10⁸CFU / ml /天益生菌V和75毫克/公斤遇到作为一个组合治疗。在当前的研究中,我们发现益生菌V和遇到的联合治疗能有效地改善增加血清ALT, AST,高山水平ethanol-fed老鼠。上述结果表明,益生菌的联合治疗V和在低剂量有改善对ethanol-induced肝毒性的保护作用。

Ethanol-induced ROS生产制程过程中起着关键作用,限制了cytoprotective基因表达(46]。因此,改善抗氧化抗活性氧生成的网络可以帮助保护细胞内氧化还原内稳态。当前数据证明ethanol-exposed HepG2细胞显示增加活性氧积累,获救的结合疗法和益生菌V和更重要的是相比会见了益生菌的个体治疗V和满足,降低细胞内活性氧积累就证明了这一点。代的ROS通过乙醇通过CYP2E1代谢导致脂质过氧化反应和反应性醛的生产像4-hydroxyl nonenal (4-HNE),进一步形成蛋白质和DNA加合物(47]。呃,蛋白加合物的积累导致ER碎片,因此导致ER应激(48]。我们的结果是按照报告表明大都会和益生菌l。嗜酸的可以改善HepG2细胞ER应激(49),以及HT-29细胞在活的有机体内(50通过减少剁碎,Grp78的表达。在目前的研究中,益生菌V和独自在ethanol-exposed HepG2细胞显示减少mRNA的表达ER应激标记喜欢Grp78无常但益生菌的组合治疗V和满足显示更明显降低与益生菌的个体治疗V或遇到表明益生菌和在组合能够预防ER应激。

慢性酒精消费产生不利影响脂质在肝脏代谢导致肝脂肪变性(51]。在肝脏损伤,脂肪生成的酶如奥软和PPAR -γ在脂质代谢中起到至关重要的作用。在肝脏、脂肪生成增加观察肝超表达的PPAR -γ(52]。奥软抄本发现升高肝脏overexpressing PPAR -γ(53]。我们的报告发现减少脂肪生成的HepG2细胞(如被减少脂滴油红O染色)和ethanol-fed老鼠用益生菌治疗V和遇到相比乙醇组。当前结果支持崔et al。(2020),表明益生菌l。杆菌的政府降低了肝体重和脂肪生成的基因的信使rna表达水平PPAR -γ和奥软54]。同时,目前的结果表明,益生菌V和在组合或单独会见了政府镇压AMPK水平诱导的抑制乙醇,这被称为脂质代谢的关键调节器。相对的,激活AMPK抑制转录因子的表达,例如,SREBP-1c (also a key regulator of lipid metabolism), as observed in the combinatorial treatment of probiotic V and Met. Consistent with the altered expression of SREBP-1c, it also decreases the expression of downstream lipogenic enzymes like ACC and FAS compared to ethanol-treated groups as well as either individual treated group. Our results are in accordance to Zhu et al. (2014) and Zhang et al. (2015), where the administration of individual treatment of Met and乳杆菌GG激活AMPK从而SREBP-1c的表达水平,使之抑制ACC和FAS ethanol-induced肝损伤模型(44,55]。

饮酒导致的肝损伤的另一个重要的标志是证明了TG水平的增加,表明肝脂肪变性。脂肪酸氧化和三羧酸(TCA)循环得到干扰由于过度饮酒影响脂质代谢,导致肝脏TG积累增加,因此提升血清TG水平(56]。喂养的老鼠与益生菌V和显示扩散脂质积累会见了整体更好的形态以及减少肝脏TG, TC含量相比,益生菌的治疗V和满足。上面的结果按照Shavakhi et al .,遇到和益生菌的联合治疗可以降低血清TC和TG水平在纳什57]。所有这些因素都会影响益生菌V和满足管理有助于调节肝脏脂质代谢,从而防止ethanol-induced脂肪生成。因此,益生菌V和满足合并施打ethanol-exposed HepG2细胞被证明是有效的在调节脂质积累,防止脂质过氧化作用。

Ethanol-induced肝损伤与nitrative水平增加压力。在小鼠模型,观察到ethanol-fed组有ROS-generating酶像伊诺的mRNA表达增加了3.6折(58]。伊诺HepG2细胞中表达增加,显示所需的“肾上腺脑白质退化症”(59]。我们的结果与文献一致,说明遇到的作用[60),而益生菌乳酸菌(61年)可以防止通过减少生产伊诺肝损伤和一氧化氮在肝脏。目前的研究还表明,基因表达水平的间接宾语与益生菌分别减少了治疗V和开会ethanol-exposed HepG2细胞,在ethanol-exposed调节HepG2细胞。然而,在乙醇的存在,益生菌的联合治疗V和满足的表达水平显著减少伊诺相比个人益生菌治疗V或满足。

改变发展的ROS / RNS(活性氮物种)导致氧化应激的发生。乙醛和MDA的产生是由于氧化酒精在其新陈代谢,和MDA水平的提高是一个氧化应激生物标志物(62年]。在会见了益生菌通过减轻氧化应激有抑制作用在结直肠癌(CRC)和2型糖尿病19]。坚持我们的结果说明ethanol-exposed HepG2细胞调节MDA水平,而海拔MDA水平明显阻止了益生菌的组合治疗V和遇到比益生菌的个体治疗V或遇到演示益生菌的联合政府,可能是有效预防ethanol-induced氧化应激。这可能解释了益生菌V的天生的抗氧化能力,在防止ethanol-induced氧化应激,ER应激,ROS生成,和/或脂质过氧化作用。

持久活性氧导致炎症导致人类疾病的主设备号。细胞受损是由于氧化应激诱导炎症在酒精摄入(63年]。慢性饮酒诱发CYP2E1, ROS生产中起着关键的作用[64年]。研究表明CYP2E1表达的增加引起的100毫米乙醇导致饮酒导致的肝损伤(65年]。现存的研究表明益生菌V和遇到的cotreatment ethanol-exposed HepG2细胞和ethanol-fed老鼠显示CYP2E1的信使rna表达水平比乙醇团体以及个人治疗的益生菌V和满足。HO-1防御机制中起着重要作用对氧化损伤(66年),及其在肝细胞表达明显减少乙醇处理(67年]。然而,在目前的研究中,乙醇导致的下降表现HO-1 cytoprotective酶,由益生菌预防V和cotreatment在ethanol-exposed HepG2细胞以及ethanol-induced鼠模型。同时,Nrf-2绑定到一个上游(抗氧化反应元素)基因的启动子区域包括HO-1 [48]。在肝组织内,研究证明Nrf-2的调节活动和HO-1极其王亚南在氧化应激(68年,69年]。目前的结果表明,益生菌V和满足治疗显著提升Nrf-2活动ethanol-exposed HepG2细胞以及ethanol-fed老鼠。这证明益生菌V和在组合有助于大大减少氧化应激引起的CYP2E1通过提升HO-1的水平和Nrf-2 HepG2细胞以及大鼠模型。然而,益生菌的联合治疗V和显示显著差异在HO-1的表达水平和Nrf-2相比益生菌的个体治疗V或满足。

肿瘤坏死因子-α细胞毒性和il - 1β分泌,增加了乙醇暴露在HepG2细胞和大鼠原发性肝细胞(24,58]。一起会见了益生菌表现出抑制作用,下调炎性细胞因子的表达像TNF -α在结直肠癌(CRC)和2型糖尿病19]。我们的研究结果提示有慢性酒精的exposure-mediated upregulation TNF的表达水平α和il - 1β表达下调,更重要的是通过cotreating益生菌V和在组合相比个体治疗的代理。肿瘤坏死因子-α也由生产il - 10表达下调,否则HepG2细胞减少的挑战与乙醇(100毫米70年符合当前的研究。我们,在我们的研究报告中,il - 10的信使rna表达水平降低乙醇由益生菌V和缓解在HepG2细胞比ethanol-exposed细胞。值得注意的是,在益生菌V和满足,ethanol-exposed HepG2细胞信使rna表达水平升高il - 10显示超过益生菌的个体治疗V或满足。

制程地在发展中起着重要的作用。HepG2细胞,增加地表达是由100毫米乙醇诱导20 h (70年]。在纳什模型,治疗或益生菌(l。这种)和抗生素灭滴灵透露温和改善的炎症通路:有限合伙人/地/ NF -κB /肿瘤坏死因子-α(20.]。目前的研究显示,ethanol-exposed地mRNA表达水平增加HepG2细胞,由cotreating益生菌表达下调V和在ethanol-exposed HepG2细胞以及ethanol-fed老鼠。然而,在乙醇的存在,益生菌的联合治疗V和满足的表达水平显著降低地与益生菌的个体治疗V或满足。

肝细胞、巨噬细胞也发挥急性作用酒精诱发炎症的进展和巨噬细胞浸润的积累71年]。过量摄入酒精会导致枯氏细胞的激活,这行动响应增加肠道易位的有限合伙人通过受体CD14 /地复杂,导致退化进程(72年]。研究表明增加释放肿瘤坏死因子-α由100毫米和il - 6在原始264.7细胞刺激乙醇24 h和Met-induced生264.7对M2巨噬细胞表型(3]。由于酒精的作用在激活巨噬细胞产生促炎细胞因子(73年),这是需要确定如果cotreatment益生菌264.7 V和会见了ethanol-induced原始细胞能促进抗炎细胞因子的表达。264.7我们的研究表现,乙醇暴露在原始细胞的基因表达调节M1表型标记来控制细胞相比,由cotreatment益生菌V和预防以及个人的治疗以及会见了乙醇,所建议的M1表型标记物表达水平降低il - 6、il - 12,进气阀打开,地,TNF -α,NOX-1。我们的研究观察益生菌的联合治疗V和满足也调节M2表型标记的表达水平相比Arginase-1和il - 10 ethanol-treated 264.7原始细胞。另外本研究得出结论:组合益生菌治疗V和满足可以作为预防肾上腺白质退化症患者发展目标,因为它有助于翻译炎性M1表型巨噬细胞(tissue-damaging渗透巨噬细胞)M2巨噬细胞表型(抗炎组织恢复细胞)相比更重要的益生菌V或Met-unaided组。

在最近的研究中,益生菌的组合V和帮助在其余会见了其抗氧化和抗炎作用。结合我们的发现表明益生菌V和满足防止ethanol-induced细胞毒性通过抑制氧化应激和ROS生成和保护人类HepG2细胞和在活的有机体内肝CYP2E1抑制伤。CYP2E1表达水平降低引起的益生菌V和有关会见了增加Nrf-2易位Nrf-2易位和HO-1激活加速血红素分解,导致减少CYP2E1蛋白质水平(74年]。我们假设益生菌V和在组合可能抑制LPS /地信号和表达下调的磷酸化NF -κB或MAPK,引发炎症介质的产生TNF -α,il - 1βil - 6,从而防止ethanol-induced肝损伤。

5。结论

结果显示在当前的研究中导致许多结论显示改善的贡献直接治疗联合益生菌V和满足。从目前的研究结果表明,合并施打益生菌V和会见了乙醇暴露是有效改善细胞损伤和肝组织学的ethanol-exposed HepG2细胞,264.7原始细胞,ethanol-fed老鼠。同时,合并施打益生菌V和会见了乙醇大大减少炎症反应和脂质积累,调节抗氧化水平,调节脂质代谢的体外和体内模型ethanol-induced肝损伤。本研究推断联合治疗的影响益生菌V和在乙醇的存在在细胞因子的表达以及蛋白水平。因此,减少ROS水平和氧化应激和炎症标记物可能是潜在的目标提出的预防效果益生菌V和在组合。激活MAPK / Nrf-2 HO-1信号通路可能是一个可能的机制导致益生菌V的联合保护效果和满足ethanol-induced HepG2细胞毒性和肝损伤(图15)。在酒精的用户,本研究临床推理对ethanol-induced肝损伤。

数据可用性

作者确认数据支持本研究的发现可用的文章。

伦理批准

研究根据委员会的指导方针的目的是控制和监督动物实验(CPCSEA)、环境、森林和气候变化,印度(新德里,印度),政府和机构批准的动物伦理委员会(IAEC) Ramanbhai Patel药学院,Charotar科技大学(Anand,印度)(940 / PO / Re / S / 06 / CPCSEA)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Farhin Patel和Parwani医生说了同样的工作。

确认

作者感谢DST-INSPIRE奖学金方案提供奖学金和Charotar科技大学的设施进行实验。

补充材料

益生菌的影响V和满足原始264.7小鼠巨噬细胞细胞的可行性。(补充材料)