文摘

背景。Interleukin-16 (IL-16)是一种重要的炎症调节器和已被证明具有强大的影响炎症反应的调节。心脏炎症被报道阿霉素-密切相关(阿霉素)诱导心脏损伤。在这项研究中,在DOX-induced IL-16心脏损伤的作用和可能机制进行。方法。心脏IL-16水平首次以强力霉素或saline-treated老鼠。此外,老鼠使用anti-IL-16-neutralizing抗体(nAb)或同形像免疫球蛋白1天,进一步管理阿霉素或盐水为5天。然后,心脏损伤,心脏M1巨噬细胞水平和心肌细胞凋亡进行了分析。anti-IL-16 nAb的影响巨噬细胞分化和心肌细胞凋亡也调查了体外。结果。阿霉素政府增加IL-16表达相比,心脏巨噬细胞与生理盐水治疗。anti-IL-16 nAb显著降低血清乳酸脱氢酶(LDH)水平,myocardial-bound肌酸激酶(水平)和心肌肌钙蛋白T (cTnT)和高架DOX-induced小鼠心脏功能。治疗anti-IL-16 nAb也减少p65途径激活,M1 macrophage-related标记和细胞因子表达,减少和防止心肌细胞凋亡DOX-induced老鼠。在细胞的研究中,anti-IL-16 nAb也减少DOX-induced M1巨噬细胞分化和细胞凋亡在心肌细胞和巨噬细胞cocultured减轻。结论。anti-IL-16 nAb保护反对DOX-induced心脏损伤减少心脏炎症,和IL-16可能是一种很有前途的目标,以防止DOX-related心脏损伤。

1。介绍

作为药物已广泛应用于临床化疗,阿霉素(阿霉素)已经慢慢撤回作为一线治疗由于严重的毒性和心脏损伤,进一步严重的临床后果1,2]。各种病理损伤的因素,包括炎症反应、氧化应激、细胞凋亡过度,和能量代谢衰竭,被发现参与的发展DOX-induced毒性和心脏损伤(1- - - - - -4]。研究表明,免疫细胞激活和释放大量炎症相关的物质起着至关重要的作用在DOX-induced毒性和心脏损伤(2- - - - - -4]。

Interleukin-16 (IL-16)是一种重要的促炎细胞因子免疫细胞所分泌,包括激活T淋巴细胞和巨噬细胞,以及多发地细胞,如肥大细胞和上皮细胞(5- - - - - -7]。IL-16最初认为是趋化因子与CD4 + T淋巴细胞;然而,现在有相当数量的研究也表明IL-16介导巨噬细胞的趋化现象的活动和/或分化,单核细胞和肥大细胞(6- - - - - -12]。IL-16参与信号调节通过激活多种信号通路,包括磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K),核因子kappa-B (NF -κB) p65,压力激发了蛋白激酶(SAPK)和增殖蛋白激酶(MAPK)途径13- - - - - -15]。

IL-16已经证明参与多种疾病的进展,包括结肠炎、过敏反应、肺炎、肿瘤,脊髓损伤,通过调节免疫和炎症反应5,7,8,10- - - - - -13]。然而,IL-16和心血管疾病之间的关系一直没有充分报道。在早期的研究中,IL-16 TG / GG基因型rs11556218 T / G据报道大大增加冠状动脉疾病的发病率(16]。另一项研究报道,IL-16升高与心血管事件的发生率减少患者的颈动脉粥样硬化(17]。循环IL-16水平是升高的慢性心力衰竭(CHF)患者左心室(LV)保存射血分数(LVEF),而IL-16过度增加心脏巨噬细胞浸润,加重了心脏纤维化血管紧张素ⅱ- (Angⅱ)注入老鼠,和IL-16中和了相反的效果18]。然而,是否参与IL-16 DOX-induced心脏损伤通过调节心脏炎症尚不清楚。在这项研究中,我们审查的影响一个anti-IL-16-neutralizing抗体(nAb) DOX-induced心脏损伤和炎症和试图解释其可能的机制。

2。材料和方法

2.1。老鼠和治疗

雄性野生型(WT)与C57BL / 6小鼠背景被命令从北京重要河流实验动物技术,装在一个无菌小鼠的房间(温度: °C;12小时光/ 12小时黑暗)在北京安贞医院和接收水随意从动物保健设施服务。小鼠年龄在9 - 10周,体重24.5 - -25.5 g被用于这项研究。首先,老鼠服用15毫克/公斤由一个腹腔内注射阿霉素,和老鼠注射生理盐水作为对照( 为每个组)。然后,心脏IL-16表达测量5天后。此外,老鼠使用200年μ克老鼠anti-IL-16 nAb或相同数量的同形像免疫球蛋白1天,然后使用强力霉素或生理盐水治疗5天( 为每个组)[18]。体重(BW)在不同时间点测定阿霉素前后管理,和心脏重量(HW)和胫骨长度(TL)测定小鼠安乐死。使用小鼠和研究北京安贞医院伦理委员会的批准。

2.2。心脏功能的分析

老鼠后使用1.5% - -2%异氟烷麻醉,进行超声心动图,M-mode图像的左心室乳头肌水平记录5心脏周期。然后,心率(HR)、LVEF、部分缩短(FS)的数据进行了分析。接下来,microtip导管传感器插入到颈动脉,进一步插入左心室,和阅读最大的收缩压增加(+ dp / dt max)和舒张压衰减(dp / dt max) 10心脏周期进行了收集和分析。

2.3。细胞实验和治疗

RAW264.7 CTLL-2 T淋巴细胞,巨噬细胞,DC2.4树突细胞,HL-1心肌细胞都购自写明ATCC RPMI 1640培养基培养(美国)和含10%胎牛血清和抗生素在37°C和5%的股份有限公司₂。首先,细胞治疗1μ米阿霉素或盐水为12小时,然后,IL-16 mRNA水平测定每组细胞。Anti-IL-16 nAb——或者IgG-treated RAW264.7巨噬细胞注射阿霉素或生理盐水,和核p-p65表达式,CD80和诱导一氧化氮合酶(间接宾语)mRNA表达水平和CD80巨噬细胞蛋白表达的检测。此外,HL-1心肌细胞与RAW264.7 cocultured巨噬细胞和蛋白质水平的伯灵顿、bcl - 2,和裂解caspase-3 HL-1心肌细胞测量。

2.4。分析血清IL-16和心肌损伤标志物水平

血清是来自每一个血液样本,鼠标酶联免疫吸附试验(ELISA、NeoBioscience、中国)工具包用于确定血清IL-16水平根据制造商的指示。此外,血清心肌损伤标记物,包括乳酸脱氢酶(LDH)、myocardial-bound肌酸激酶(水平)和心肌肌钙蛋白T (cTnT),分析了使用工具根据实验过程由制造商提供。

2.5。核和胞质分离和免疫印迹

LV组织和RAW264.7巨噬细胞的细胞质和细胞核核分离孤立使用工具包(Njjcbio)根据先前描述的协议(19]。短暂,匀浆收集从LV组织和细胞裂解细胞溶解的缓冲区,并进一步在1000×g离心10分钟。底部的球管包含细胞核,和上层的细胞质。

细胞质,细胞核、LV组织和HL-1心肌细胞,分别溶解在里帕裂解缓冲含有10%磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和10%的总蛋白质获得和量化使用BCA蛋白质化验设备。在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,转移到PVDF膜蛋白质。的蛋白表达IL-16 (Abcam),伯灵顿,bcl - 2, caspase-3裂解,caspase-3,和GAPDH总LV(所有三个来自GeneTex)组织,p-p65的蛋白表达和GAPDH(来自Abcam)在细胞质中,p-p65和PCNA蛋白表达的(GeneTex)核,和伯灵顿的蛋白表达,bcl - 2, caspase-3裂解,caspase-3, GAPDH HL-1心肌细胞测定使用主要抗体在括号中表示。与二级抗体进一步孵化后,目标蛋白进行了检测和分析。

2.6。实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

总RNA分离细胞溶解LV组织和细胞,进一步转化为互补使用互补脱氧核糖核酸合成装备(热费希尔)。然后,PCR扩增都使用了SYBR绿色PCR反应混合液(Vazyme)来确定目标mRNA的表达。在这项研究中,目标mrna的表达IL-16,肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α),il - 1β、il - 6、IL-17地震,干扰素-γ(IFN -γ)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1), CD80和伊诺测量和规范化GAPDH mRNA水平。在这项研究中使用的所有基因引物在表列出1。

2.7。组织学分析

新鲜的心和RAW264.7巨噬细胞在4%多聚甲醛4天孵化,嵌入在石蜡,切割的厚度4 - 6μm。然后,心肌细胞的液泡化是衡量组织病理学分析用苏木精和伊红染色(他)。心肌细胞凋亡测定使用终端原位dUTP尼克末端标记(TUNEL)染色。Anti-CD80和anti-iNOS抗体被用于免疫组织化学染色检测心脏CD80和伊诺蛋白表达。此外,使用一个anti-IL-16抗体进行免疫荧光染色检测心脏IL-16表达式。双重免疫荧光染色使用anti-IL-16 anti-F4/80抗体和anti-CD80 F4/80抗体进行测量IL-16总和M1巨噬细胞表达。

2.8。统计分析

在这项研究中提出的所有数据 并分析了使用GraphPad棱镜8。为数据方差齐次和正态分布,使用学生的两组之间的差异进行了比较 - - - - - -测试和差异3或多组使用方差分析进行了分析,其次是图基的多重比较测试。为数据方差的非均质性或非正态分布,不同群体之间的差异进行了分析使用非参数检验。一个值小于0.05被认为是指示性的平均值之间的显著差异组。

3所示。结果

3.1。阿霉素政府促进IL-16心脏小鼠的巨噬细胞释放

免疫印迹结果显示阿霉素增加心脏IL-16表达和血清IL-16水平与控制条件(图1(一))。免疫荧光染色显示增加心脏IL-16表达式(图1 (b))。阿霉素也增加了IL-16 mRNA水平在树突细胞,T淋巴细胞,心肌细胞,特别是巨噬细胞(图1 (c))。双重免疫荧光染色法显示IL-16是由心脏巨噬细胞(图1 (d))。

3.2。Anti-IL-16 nAb减轻DOX-Induced小鼠心脏损伤和功能障碍方面研究

受虐妇女综合症DOX-induced老鼠明显减少,但这些变化被anti-IL-16 nAb逆转(图2(一个))。anti-IL-16 nAb也增加了探测和HW / TL比率在DOX-induced老鼠(图2 (b))。在免疫球蛋白降低心肌细胞液泡化百分比观察阿霉素组比nAb强力霉素组(图1 (c))。相同的血清心肌损伤标志物的趋势,包括LDH水平,和cTnT观察(图2 (d))。此外,阿霉素政府减少人力资源、LVEF和FS和anti-IL-16 nAb增加人力资源、LVEF、FS DOX-induced老鼠,和类似的趋势+ dp / dt和dp / dt观察。表中列出的结果2。

3.3。Anti-IL-16 nAb抑制M1 DOX-Induced小鼠巨噬细胞分化

首先,p65磷酸化是测量,结果表明,阿霉素政府降低细胞质p-p65表达式和增加核p-p65表达式,而anti-IL-16 nAb增加细胞质p-p65水平和减少核p-p65水平DOX-induced老鼠(图3(一个))。免疫组织化学染色显示,anti-IL-16 nAb减少心脏CD80和伊诺表情DOX-induced老鼠(图2 (b))。类似的趋势M1 macrophage-related心脏mRNA表达的细胞因子,包括TNF -α,il - 1β、il - 6、IL-17地震,干扰素-γ和MCP-1观察(图3 (c))。

3.4。Anti-IL-16 nAb防止DOX-Induced小鼠心肌细胞凋亡

心肌凋亡蛋白测定,结果表明,anti-IL-16 nAb减少伯灵顿/ bcl - 2比率和裂解caspase-3 DOX-induced老鼠(图/ caspase-3比率4(一))。此外,心肌细胞凋亡测定,结果表明:强力霉素高架TUNEL-positive细胞的数量,减少了anti-IL-16 nAb(图4 (b))。

3.5。Anti-IL-16 nAb抑制DOX-Induced M1巨噬细胞,在体外心肌细胞凋亡

RAW264.7核p65激活巨噬细胞测定,结果表明,anti-IL-16 nAb逆转DOX-induced增加p-p65表达式(图5(一个))。更CD80的表情观察免疫球蛋白g强力霉素组比anti-IL-16 nAb强力霉素组(图5 (b))。类似的趋势在mRNA的表达CD80和伊诺RAW264.7观察巨噬细胞(图5 (c))。在HL-1心肌细胞,强力霉素政府增加了伯灵顿/ bcl - 2比率和裂解caspase-3 / caspase-3比率,和anti-IL-16 nAb产生相反的效果没有强力霉素(图5 (d))。

4所示。讨论

IL-16在心血管疾病中的作用很少被报道,本研究的目的是检查IL-16对DOX-induced心脏损伤的影响及其可能的机制。我们发现,阿霉素管理显著增加IL-16心脏巨噬细胞释放。利用抗体中和IL-16几个心肌损伤标记物的表达减少和减轻DOX-induced小鼠心脏功能障碍。anti-IL-16 nAb也降低了M1 macrophage-related标记和细胞因子mRNA表达和减少心肌细胞凋亡在DOX-induced老鼠。此外,anti-IL-16 nAb也抑制DOX-induced M1巨噬细胞体外分化和减少心肌细胞凋亡。监管角色的IL-16炎症参与其他系统性疾病已被广泛报道,包括系统性硬化病,痛风炎症,和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌肺炎和肺损伤,而它的作用在心脏炎症已经讨论了少(10,20.,21]。在目前的研究中,我们的研究结果表明,IL-16还可以调节心脏炎症。

常见的免疫细胞,包括T淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞是免疫系统的重要组成部分。除了调节免疫反应,这些免疫细胞也可以释放大量炎症因子,包括干扰素、转化生长因子,趋化因子,盲降22- - - - - -24]。多个图书馆,包括il - 6、il - 12、il - 22生成时,主要是通过激活免疫细胞和分泌很少或不分泌多发地细胞(25- - - - - -27]。与这些图书馆,大量IL-16是由免疫细胞和分泌细胞(5- - - - - -7]。确定IL-16的来源,强力霉素的影响管理IL-16表达在不同的细胞类型检查,结果表明IL-16 mRNA水平增加CTLL-2 T淋巴细胞,巨噬细胞RAW264.7, DC2.4树突细胞,HL-1心肌细胞。我们的结果表明,这些细胞可以分泌IL-16和都与先前的研究一致表明,免疫和多发地细胞IL-16的重要来源。IL-16 mRNA在RAW264.7巨噬细胞提升最重要的,和双重免疫荧光染色法显示IL-16是由心脏巨噬细胞。这些结果表明,巨噬细胞是最重要的来源的IL-16特定DOX-associated微环境。

在这项研究中,我们发现,阿霉素政府明显增加心肌和血清IL-16表达式。此外,IL-16中和显著缓解BW和HW的损失,减少心肌细胞液泡化的程度,减少多个血清心肌损伤标志物的表达DOX-induced老鼠。此外,超声和血流动力学结果表明DOX-induced小鼠心脏功能障碍明显减轻anti-IL-16 nAb的预处理。这些结果表明,IL-16中和可以显著降低DOX-induced心脏损伤。

NF -κB p65信号通路是最常见的一种炎症相关的信号通路。最近,你们等人报道,M1 p65通路的激活增加显著提高巨噬细胞分化和II-infused和DOX-induced老鼠(26,27]。核p-p65但不是总p-p65调节巨噬细胞的分化与炎症反应27- - - - - -30.]。决定的影响IL-16 p65途径激活,细胞质和细胞核的p-p65水平测定。结果表明,IL-16中和显著增加细胞质p-p65表达式和减少核p-p65表达式在DOX-induced老鼠。这些结果表明,anti-IL-16 nAb减少p-p65 DOX-induced易位。通用电气等人报道,p-p65表达增加的细胞核和细胞质在慢性动物实验(31日,32]。这些结论可能不是与我们的结果一致;一个可能的解释是,细胞质p65也是由慢性炎症激活。事实上,增加核p-p65表达式和减少细胞质p-p65中也发现了另一个急性炎症动物模型(33]。

M1的激活巨噬细胞和促炎细胞的分化主要由p - 65信号通路核,核的表达M1 p-p65促进分化的巨噬细胞(29日,30.]。进一步探索的机制IL-16调节DOX-induced心脏损伤,M1巨噬细胞的分化。结果表明,anti-IL-16 nAb减少心脏M1巨噬细胞标记表达式,包括CD80和进气阀打开。结果表明,CD80和伊诺减少DOX-induced anti-IL-16 nAb的老鼠。IL-16中和也抑制的表达各种DOX-induced M1 macrophage-related炎症因素。这些结果表明,IL-16中和显著降低DOX-induced M1巨噬细胞分化和macrophage-associated促炎细胞因子的分泌。这些结果还表明,anti-IL-16 nAb防止DOX-induced心脏损伤减轻macrophage-related炎症反应。

心肌细胞是一种终末分化细胞可塑性较差表现出较差的耐各种外部病理因素,尤其是炎症反应(4]。大量研究表明,促进M1巨噬细胞的分化和放大炎症反应显著增加DOX-induced心肌细胞凋亡,而抑制M1巨噬细胞的分化或促进M2巨噬细胞分化和减少炎症反应明显减少心肌细胞凋亡(4,34,35]。这些研究表明,心肌细胞凋亡过度DOX-induced心脏损伤的最基本的机制,与心脏功能的恶化相关。进一步探索机制,影响DOX-induced anti-IL-16 nAb的心肌细胞凋亡检测。结果表明,IL-16中和显著降低伯灵顿/ bcl - 2比率和裂解caspase-3 / caspase-3比率。此外,少TUNEL-positive细胞中观察到nAb强力霉素组比免疫球蛋白g强力霉素组。这些结果表明,IL-16中和显著降低DOX-induced小鼠心肌细胞凋亡,这表明IL-16可能防止DOX-induced心脏损伤,减少心肌细胞凋亡。来验证上述结论,我们确定anti-IL-16 nAb在巨噬细胞分化的影响在体外,和结果表明,IL-16中和显著抑制DOX-induced M1巨噬细胞的分化。HL-1心肌细胞与RAW264.7 cocultured巨噬细胞,结果表明,心肌细胞凋亡也由巨噬细胞分化。这个结果支持我们的结论。

总之,我们的结果表明,IL-16中和可以抑制DOX-induced M1巨噬细胞分化,减少炎症反应,减少心肌细胞凋亡,从而减轻心肌损伤,改善心脏功能。IL-16中和可能有利于防止化疗药物阿霉素毒性诱导。

数据可用性

我们申报材料中所描述的手稿,包括所有相关的原始数据,将免费提供给任何科学家希望用于非商业目的,没有违反参与者保密。

的利益冲突

作者宣称他们没有冲突的冲突。

确认

作者要感谢焦博士临床实验室的局域网技术支持我们的研究。这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81560085和批准号81560085博士Qingwei霁)。