文摘

背景。罗勒多糖(BPS)代表一个主要活性成分提取罗勒(罗勒属basilicum l .),它可以调节继发性细菌性肺炎sepsis-mediated免疫抑制的发展过程中。方法。在这项研究中,双模式sepsis-induced继发肺炎盲肠的结扎和穿刺气管内的滴注法金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌构造。结果。结果表明,BPS-treated小鼠接受CLP显示阻力次要的金黄色葡萄球菌肺炎。与IgG-treated组相比,BPS-treated老鼠表现出更好的存活率以及更高的细菌清除率。此外,BPS治疗减毒细胞凋亡,增强淋巴细胞和巨噬细胞招聘到肺,促进肺细胞因子生产,显著增强CC受体配体4(亚兰)。值得注意的是,亚兰重组蛋白可以增强保护作用金黄色葡萄球菌全身继发肺部感染的败血症的老鼠,这表明BPS-induced亚兰介导抗继发细菌性肺炎。此外,BPS启动显著促进了肺泡巨噬细胞的吞噬作用而死亡金黄色葡萄球菌体外,这是增强p38MAPK信号转导通路的激活有关。此外,在sepsis-induced二级BPS也起到了保护作用金黄色葡萄球菌肺炎由诱导Treg细胞分化。结论。总的来说,这些结果流小说灯BPS sepsis-induced辅助的治疗机制金黄色葡萄球菌肺炎小鼠。

1。介绍

脓毒症免疫病理综合症是一个复杂的特点是危及生命的器官功能障碍引起的管制宿主应对系统性感染(1]。归因于一个持久的和复杂的相互作用的促炎与抗炎过程中就有一个身体,导致高炎症反应和随后的免疫功能障碍[2,3]。在全球范围内,脓毒症仍然是死亡主要原因在重症监护室(ICU) [4]。最近,全球研究报告约4900万名确诊患者以及1100万人死亡由于脓毒症在世界2017年,占全球总死亡病例的20%左右。此外,一项研究报告称,汇集hospital-treated脓毒症患者的发病率是189/100,000人每年,而估计死亡率是26.7%。研究还报道,ICU-treated脓毒症的患病率是58/100,000组,包括41.9%的患者在出院前死亡。值得注意的是,hospital-treated脓毒症的发病率大大增加后2008 (5]。伟大的炎症反应是之前报道诱导sepsis-related早期死亡,而补偿建议抗炎反应导致死亡后通过占据主导地位的先天性免疫器官衰竭,影响血管内皮功能,血液流动,实质细胞代谢6]。然而,最近的研究表明,持久counterregulatory抗炎和促炎状态不平衡引发的先天克制的适应性免疫反应导致长期器官损伤和功能障碍,导致患者死亡(7]。原发性感染严重脓毒症患者可能不是死亡的主要原因;然而,持续的炎症和免疫抑制代表继发感染和死亡率的主要原因(8]。近年来,抗药性细菌感染患病率的增加代表着一个重大的挑战sepsis-induced继发性细菌性肺炎的有效治疗在医院(9]。肺免疫产生抵制肺部呼吸道病原体的重要组成部分,而不同的炎症介质(如趋化因子、细胞因子或生长因子)调节反应各种感染或损伤(10]。因此,进一步了解肺免疫分子和细胞免疫反应在一起微生物感染将大大提高我们理解继发肺部感染的发病机制在脓毒症的免疫抑制阶段。几项研究已经确定了suppression-mediated免疫抑制和二级bacteria-induced肺部感染之间的关系。此外,巨噬细胞功能障碍(11),中性粒细胞瘫痪(12),淋巴细胞减少(13)相关二级bacteria-induced post-sepsis肺部感染。因此,脓毒症诱导的免疫抑制可能明显改变肺免疫调制的主机,从而增强灵敏度感染性病例中并发院内肺炎(14]。

罗勒或罗勒属basilicuml,belongs to the family Lamiaceae, is known as the “king of herbs” due to its extensive traditional use in medicine and for culinary and perfumery purposes worldwide. It is native to Southeast Asia, America, and parts of Africa and frequently planted within the gardens and pots across Southwest Asia, the USA, and Europe [15]。罗勒被证明能表现出潜在的药理作用,包括抗癌,反应力,抗糖尿病的,退热剂,抗氧化、免疫调节、降血脂药antiatherosclerotic效果,和抗菌活性16- - - - - -19]。罗勒的至关重要的活性物质之一,罗勒多糖被证明展览各种药理作用[20.]。研究已经证明,罗勒多糖(BPS)采用刺激巨噬细胞的免疫增强剂,保护免疫器官,在构建补充系统施加的免疫增强作用。此外,罗勒多糖表现出良好的抗菌活性(21]。个基点也可以抑制各种细菌感染在诊所22,23]。目前,基点已经广泛用于降低血脂,预防动脉粥样硬化,治疗癌症和糖尿病(24,25]。然而,有一个缺乏文学的影响罗勒多糖在sepsis-induced继发性细菌感染的肺部。

院内继发性肺炎,频繁的院内细菌感染,占主要原因导致严重脓毒症死亡病例(26]。生物引起院内继发肺炎导致严重脓毒症是由金黄色葡萄球菌(20.5%),紧随其后的是假单胞菌物种(19.9%)、真菌(19%)和肠杆菌属(主要是大肠杆菌,16.0%)27]。,双模式sepsis-induced继发肺炎与盲肠的结扎和穿刺(CLP)鼻内滴注法铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌阐明罗勒多糖的影响在成立sepsis-induced继发肺部细菌感染。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性老鼠的8-12-week-old C57BL / 6(重量、20 - 24 g)是由重庆医科大学实验动物中心(中国重庆)。车牌号码是SYXK(中国重庆)2018 - 0003。之后,所有的动物都是在特定的无菌(SPF)环境下24°C, 50% - -60%的相对湿度(RH)和12 h / 12 h光/暗周期条件。每个鼠标被允许喝水和吃标准的食品。每一个动物都是健康的,无感染整个实验。

所有小鼠治疗后实验动物保健和使用指南。机构重庆医科大学动物保健和使用委员会批准了我们的研究协议。

2.2。“双重打击”小鼠模型

中电控股和气管内的注入金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌进行了第一和第二支安打,分别。短暂,每只小鼠腹腔内注射氯胺酮(1毫克/毫升)和100μl甲苯噻嗪(20毫克/毫升)包含在PBS麻醉,其次是盲肠的结扎和使用26个g针穿刺(CLP者,导致WT小鼠的死亡率为5% - -10%)。后,我们放回盲肠进入腹腔,紧随其后的是切口关闭使用的主食。所有小鼠皮下政府0.9%的无菌生理盐水的剂量5毫升/ 100克体重(BW)预热37°C取代3理查德·道金斯空间损失;此后,温暖的垫是准备复苏28]。

在CLP后3天,甲苯噻嗪/氯胺酮混合物是麻醉管理到幸存的老鼠。然后,每个鼠标放在“平视”位置,气管被曝光,紧随其后的是气管内的注入(信息技术)铜绿假单胞菌( 菌落(cfu)在50μl PBS)或金黄色葡萄球菌( 那么在50μl PBS) (29日]。

2.3。在活的有机体内政府的罗勒多糖

为在活的有机体内罗勒多糖治疗,每个鼠标管理ip罗勒多糖的75毫克/公斤(30.(山西kingreg生物技术。有限公司,中国)或免疫球蛋白g 2 h后第二次打击。关于亚兰曝光在活的有机体内,所有的动物有500 ng免疫球蛋白或重组鼠亚兰(美国研发系统)ip的第二次打击金黄色葡萄球菌。

2.4。肺组织和支气管肺泡灌洗液的收藏

在金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌信息后24小时。,动物麻醉中丧生。肺提取和组织是收获,随后立即收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。后胸部鼓掌,对支气管捆绑和左肺灌洗。正确的肺,此外,之后成就我们获得正确的上部叶计算细菌数量,而其余对肺组织−70°C下保存一次进行进一步分析。

2.5。测定肺和等离子体细菌负担

血浆样本获得在特定的时期。与此同时,我们也在无菌条件下切除右上肺叶,紧随其后的是均质化1毫升无菌生理盐水使用组织内均质器的使用排放。后来,我们在串行浓度稀释血浆和肺匀浆。每稀释10毫升样品添加在predried胰蛋白酶的soy-base血琼脂平板,紧随其后的是隔夜孵化下37°C。后来,CFU计数,表示为总CFU /肺或每毫升的等离子体。

2.6。炎症介质测量

血液样本被收集在肝素化管通过眼静脉。炎症介质,如亚兰,il - 10, CXCL-1, TNF -α,il - 1β、il - 6和IL-17A评估小鼠细胞因子磁珠面板工具包(美国eBioscience)后,制造商的协议。

2.7。趋化因子测定亚兰所产生的中性粒细胞

中性粒细胞分类从支气管肺泡灌洗使用磁选(Miltenyi研究)和悬浮在10%的边后卫(美国σ)和RPMI1640(美国σ),然后接种培养板。确定罗勒多糖促进中性粒细胞分泌的亚兰,我们补充罗勒多糖(31日)(100μg / ml, kingreg生物技术,中国)或PBS文化。孵化后48 h,趋化因子的亚兰的上层清液由ELISA量化使用工具包(研发、美国)特定的协议。每个样品的吸光度是阅读450海里。

2.8。肺损伤指数评估

肺损伤指数评估如下:(1)形态学评估:至于右上肺叶,受到10%福尔马林固定,石蜡包埋,切片到4μ米的部分。然后,部分deparaffinized、脱水和苏木精和伊红染色(圆))进行组织学检查。Mikawa采用的方法估计肺损伤采用4分指标如下:(1)肺泡充血,出血(2),(3)中性粒细胞或间质聚合或渗透,(4)透明膜形成或肺泡间隔增厚,在0 - 4标志表示没有/非常温和,温和,温和,严重,分别和非常严重的损害。所有的分数加起来作为最终得分,和ARDS病理评分表明病变数量的增加。肺损伤评分等级按照0 - 4基于损伤严重程度的指标,在0 - 4分表示正常结果,温和(< 25%),中等(25 - 50%)、严重(50 - 75%),和非常严重的肺(> 75%),还分开。更大的比分是指示性的更严重的病变。光学显微镜(日本奥林巴斯)是用来评估组织学异常结果。(2)白蛋白评价:白蛋白肺通透性评估使用白蛋白进行量化工具(Bethyl实验室、蒙哥马利、TX)后具体的协议。(3)髓过氧化酶(MPO)测量:MPO的活动组织量化测定肺中性粒细胞浸润。总之,我们均质肺组织20更易/ l PBS (pH值7.4),其次是10分钟的离心4°C和10000 g。 Later, pellets were resuspended with 50 mmol/l PBS (pH 6.0) contained within 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide (Sigma), and then, the homogenate was treated with 4 freeze-thawing cycles, followed by 40 s of sonication for disruption. Afterwards, the samples were subjected to 5 min of centrifugation for 40 s at 10,000 g and 40,000 ion. The sample was assayed for the myeloperoxidase activity according to previous description, with tetramethylbenzidine (Sigma) being the substrate. Later, we detected the absorbance (OD) values at 460 nm and adjusted them based on tissue weights (fold change (FC) relative to control). (4) Wet/dry weight: after dissecting left lung, we weighed the wet weight. The lung was incubated, then dried in an oven at 60°C for 3–4 days and reweighed as dry weight. Then, the wet weight was divided by dry weight to calculate the wet-to-dry (W/D) weight ratio [32]

2.9。TUNEL分析

原位细胞凋亡检测装备,POD(瑞士罗氏公司)是利用测量细胞凋亡率通过TUNEL分析以下具体说明。总之,二甲苯deparaffinage之后,4μ米部分受到梯度乙醇补液。此后,3%过氧化氢(H2O2)被用来阻断内源性过氧化物酶活动一段10分钟;后来,10 - 20μg / ml蛋白酶K的解决方案是利用消化部分37°C下15分钟。PBS洗涤后,末端转移酶稀释1:20内补充反应缓冲区(digoxigenin-labeled核苷酸)被用来与部分反应为2 h 37°C。此后,停止/洗缓冲区用于冲洗三次幻灯片2分钟。随后,先前antidigoxin抗体稀释1:100被用来孵化部分37°C下30分钟,后来,ABC来进一步孵化部分37°C下30分钟。细胞凋亡测定通过孵化部分使用3,3 - - - - - -diaminobenzidine色原约20分钟,其次是苏木精复染色。之后,5个字段的视图(fov)选择随机从每一节(×400放大)。然后,每个字段TUNEL-positive细胞比例为5个随机领域的记录在400年×放大。

2.10。免疫印迹分析

蛋白质提取工具包(Beyotime,中国)是利用巨噬细胞总蛋白提取按照特定的协议。Bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包(美国皮尔斯)是用于检测蛋白质的内容。此后,蛋白质通过10% sds - page分离,其次是硝化纤维膜转移。转让后,膜被孵化阻断缓冲区包含5% ( )脱脂牛奶补充Tween-20 Tris-buffered盐水中含有0.05%,紧随其后的是隔夜孵化与第一抗体在4°C下然后第二抗体孵化。最后,ECL检测系统用于可视化蛋白质印迹。

2.11。流式细胞术

PBS洗涤后,细胞成丸及流式细胞分析仪的分析做好准备。以下包括CD4单克隆抗体、CD25 Foxp3, CD11b, Ly6G F4/80。染色CD4、CD25 Foxp3、CD11b Ly6G, F4/80,固定/透化作用工具包(美国eBioscience) anti-CD4-FITC, anti-CD11b-APC, anti-Ly6G-FITC, anti-F4/80-FITC, anti-CD25-PE, anti-Foxp3-APC之后(美国eBioscience)是利用特定的协议。的FACScan流式细胞分析仪(正)是用于收集细胞(105),而FlowJo采用7.6软件进行分析。

2.12。细胞净化和文化

我们采用淋巴细胞分离介质(美国通用电气医疗集团)分离脾外周血单核细胞从老鼠(PBMCs)。此后,磁激活细胞分选(Miltenyi研究)进行了隔离从PBMCs使用幼稚天真的CD4 + T细胞CD4 + T细胞隔离设备二世(干细胞,加拿大)在特定的协议。然后,流仪分析测量天真的CD4 + T细胞纯度(> 90%)。然后,我们培养细胞内的RPMI 1640完全培养基(美国纽约Gibco,大岛),含10%胎牛血清的边后卫和37°C和5%下孵化有限公司2条件。

2.13。Treg细胞子集生成

在这项研究中,我们生产Treg细胞子集通过暴露到50毫米β巯基乙醇、2毫米谷酰胺、2μg / ml anti-CD28, 5μg / ml anti-CD3, 2.5 ng / ml TGF -β,50 U /毫升一段3 - 2天。确定罗勒多糖参与诱导过程,我们补充罗勒多糖(100μg / ml, kingreg生物技术,中国文化。流仪分析评估细胞内染色和表面标记表达式。

2.14。巨噬细胞吞噬作用分析

BALFs孵化使用0.5毫克/毫升FITC(σ)37°C下20分钟,这巨噬细胞坚持塑料、FITC-labeled金黄色葡萄球菌分离。此后,FITC-labeled细菌(MOI, 100)被用来孵化37°C下巨噬细胞分离了30分钟。然后,细胞被洗,原子核受到DAPI(表达载体)染色和可视化在共焦激光扫描显微镜下(LSM 510,蔡司)。一个独立评论家负责量化吞噬细菌的300个细胞比例计算/。对某些实验,100年μg / ml BPS (kingreg生物技术,中国)被用来预处理支气管肺泡巨噬细胞感染FITC-labeled之前金黄色葡萄球菌。

2.15。巨噬细胞杀死化验

活着金黄色葡萄球菌(感染复数(MOI) 10)被用来感染 支气管肺泡巨噬细胞1 h下37°C。100年后,缓冲区包含μ采用g / ml妥布霉素洗细胞移除细胞外的细菌,而裂解缓冲(Promega)是用于溶解。溶菌产物文化是用来量化活细胞内的细菌,以评估细菌吸收以及胞内杀死( 分别为2)。死亡是由殖民地比例发生 相比,h h, 。在某些实验中,100年μg / ml BPS (kingreg生物技术,中国)被用来预处理前支气管肺泡巨噬细胞活着金黄色葡萄球菌感染。

2.16。统计分析

SPSS19.0(美国、IBM、纽约Armonk)是用于统计分析。值是在中位数(四分位范围)或的方式 。不同的两组被Mann-Whitney评估 测试,而在几组被单向方差分析评价。Log-rank (Mantel-Cox)测试是用于分析生存曲线。 显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。罗勒多糖可以显著改善预后的Sepsis-Induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型,而不是次要的铜绿假单胞菌肺炎

调查可能影响的BPS sepsis-mediated继发性细菌性肺部感染,我们对C57BL / 6小鼠CLP,紧随其后的是气管内的注入与细菌(金黄色葡萄球菌或铜绿假单胞菌)和基点或免疫球蛋白治疗。整个实验设计和程序提出了图1(一)。如数据所示1 (b)- - - - - -1 (g),CLP-induced长程脓毒症模型,存活率BPS-exposed和免疫球蛋白g对照组之间无显著差异,和他们的存活率约90%。因此,在小鼠肺损伤指标没有显著差异,如蛋白质BALF中MPO和W / D比率。然而,在细菌性肺炎模型,小鼠的死亡率开始增加,死亡率最高的CLP-induced继发性细菌性肺炎小鼠模型。接下来,我们发现罗勒多糖管理可以提高生存率金黄色葡萄球菌肺炎或CLP-induced二级金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型。此外,它还可以减少细菌负荷小鼠的血液和肺,提高肺损伤指标。然而,这些结果没有被观察到铜绿假单胞菌肺炎或CLP-induced二级铜绿假单胞菌肺炎小鼠模型(补充数据(可用在这里))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
图1
(一)实验过程。小鼠随机分成6组,包括4接收CLP D0和2接受虚假的操作。在3天后(D3)或在D0虚假的操作组小鼠气管内的注射铜绿假单胞菌(爸爸, CFU)或金黄色葡萄球菌(SA), CFU)。两个小时后细菌或第二个细菌,罗勒多糖或免疫球蛋白作为干预腹腔内注射。我们收集肺组织、血液和BALF细菌感染后24 h或继发性细菌感染进行分析。在为期10天的实验周期,我们记录了所有组的死亡率分析生存。(b)后的死亡率都监控了10天的挑战金黄色葡萄球菌( 老鼠/组)。(c, d)肺或血液细菌菌落后,每组管理金黄色葡萄球菌( 老鼠/组)。(eg)肺损伤评估指标如BALF中蛋白质、髓过氧化物酶,在肺湿/干重比测量后的挑战金黄色葡萄球菌( 老鼠/组)。Log-rank (Mantel-Cox)执行测试来分析生存曲线。值的方式 ,而单向方差分析和LSD多重比较测试采用数据分析。# ,相比之下,金黄色葡萄球菌感染治疗罗勒多糖。▲ ,而CLP-surgery老鼠在次要的金黄色葡萄球菌感染治疗罗勒多糖。 , ,和 ,在单向方差分析和LSD多重比较。相比之下,金黄色葡萄球菌感染用罗勒多糖治疗组或CLP-surgery老鼠在次要的金黄色葡萄球菌感染用罗勒多糖治疗组。
3.2。CLP导致宿主肺免疫受损的老鼠

为证实CLP对衰减的影响肺反应基于微生物脓毒症模型,首先,我们发现CLP后小鼠的免疫状态。结果表明:CLP后24小时内,肺损伤和炎症介质包括MIP-1β/亚兰,il - 10, TNF -α,il - 1β在血清和BALF、il - 6和IL-17A显著增加。然而,CLP后72小时,肺损伤逐渐恢复。促炎细胞因子包括MIP-1β/亚兰,TNF -α,il - 1β在血清和BALF、il - 6和IL-17A下降,而抗炎细胞因子il - 10继续增加(数据2(一个)- - - - - -2 (d))。接下来,我们对待WT与虚假的操作或CLP C57BL / 6小鼠,紧随其后的是气管内的感染金黄色葡萄球菌在CLP后72 h。老鼠接受虚假的操作均存活,而超过90%的老鼠接受CLP 26 g针活了下来。尽管如此,后金黄色葡萄球菌肺内的管理 CFU, 67%的虚假的操作组的动物活了下来。相反,大多数动物暴露于亚致死的CLP死在随后的气管内的注入金黄色葡萄球菌(图2 (e))。此外,动物受到CLP,二次开发的金黄色葡萄球菌肺炎显示明显降低BALF或血清炎症介质生产,如il - 1β、il - 6、IL-17A TNF -α,MIP-1β/亚兰,而调节抗炎介质(il - 10)生产相对于虚假的经营集团,和肺炎发生在感染后24小时(图2 (f))。总的来说,上述结果符合先前的结果表明CLP导致损害肺免疫反应在次要的金黄色葡萄球菌感染。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图2
CLP导致受损的肺在宿主的免疫反应。老鼠接受CLP或虚假的操作。(a, b)组织学得分CLP-induced长程脓毒症模型( 老鼠/组)。(c, d)在CLP后24 h和72 h,我们在血清和BALF细胞因子的检测内容。小鼠细胞因子磁珠面板工具( 每组)进行分析获得的标本。中电控股(e) 72 h后,小鼠气管内的注射金黄色葡萄球菌( CFU)。挑战( 每组),我们观察的10个交易日内死亡率。Log-rank (Mantel-Cox)执行测试来分析生存曲线。(f)在24 h后继发感染金黄色葡萄球菌,我们检测到趋化因子和细胞因子在血清和BALF的内容。小鼠细胞因子磁珠面板工具( 每组)进行分析获得的标本。值的方式 ,而非参数Mann-Whitney 试验采用数据分析。 , ,与正常相比控制或虚假手术来得见效老鼠在二级金黄色葡萄球菌感染。
3.3。罗勒多糖保护小鼠免受杀伤力,切除肺的病理,调节炎症反应在Sepsis-Induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型

评估罗勒多糖参与宿主防御金黄色葡萄球菌在脓毒性小鼠、免疫球蛋白或罗勒多糖在小鼠管理干预。结果显示,罗勒polysaccharide-treated小鼠组接收CLP后显著提高生存率次要的金黄色葡萄球菌感染,相对于免疫球蛋白组(图3(一个))。从小鼠的肺组织病理学检查,与罗勒多糖,肺损伤评分显著降低,表明改进的出血,水肿,炎性细胞浸润CLP-induced次要的S.aureus肺炎小鼠模型(数据3 (b)和3 (c))。此外,肺TUNEL-positive细胞比例下降后BPS曝光(图3 (d)和3 (e))。提出了图3 (f)虽然没有统计学意义,罗勒polysaccharide-treated组表现出相对增加趋化因子或细胞因子的生产(如处于受控,TNF -α、il - 6、il - 1β和IL-17A)肺泡灌洗液和血清内,与免疫球蛋白组相比,在统计上有显著差异的亚兰的水平。在一起,这些发现表明,罗勒多糖的治疗效果可能与招聘有关趋化因子亚兰的肺。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图3
Postseptic罗勒多糖抗金黄色葡萄球菌肺炎。(a)与罗勒多糖对小鼠的生存金黄色葡萄球菌期间感染败血症( 老鼠/组)。(b)的典型他染色在24 h postinfection肺组织样本金黄色葡萄球菌在脓毒症和治疗后免疫球蛋白或罗勒多糖组。(c)继发性肺感染的组织学得分金黄色葡萄球菌在小鼠脓毒性以及与免疫球蛋白治疗后或罗勒多糖( 老鼠/组)。执行(d, e) TUNEL分析来确定细胞凋亡,在TUNEL-positive的细胞核是深棕色的。(f) BALF和血清细胞因子和趋化因子的内容被发现在24 h与免疫球蛋白治疗后或罗勒多糖sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎小鼠。标本收集小鼠细胞因子分析的磁珠面板工具( 老鼠/组)。生存曲线进行了分析使用log-rank (Mantel-Cox)测试。数据表示为 ,而非参数Mann-Whitney 测试数据分析应用。 , ,和 ,相对次要的肺部感染金黄色葡萄球菌脓毒性小鼠的免疫球蛋白g组。
3.4。罗勒多糖对白细胞的影响招聘Sepsis-Induced中等金黄色葡萄球菌肺炎小鼠

个基点的识别可能的机制改变抗菌宿主防御,本研究测量了白细胞sepsis-mediated二级后流入到原发感染的网站金黄色葡萄球菌肺部感染。整个细胞数量在小鼠肺泡灌洗液(BALF)和罗勒多糖在治疗后显著增加(数据4(一)和4 (b))。值得注意的是,用罗勒多糖治疗显著提高淋巴细胞和巨噬细胞数量相对于免疫球蛋白治疗组BALF中(数据4 (c)- - - - - -4 (f))。相反,整体中性粒细胞计数差异不显著(数字4 (g)和4 (h))。这些结果共同表明,罗勒多糖在感染的保护仍然是招募淋巴细胞和巨噬细胞在这个模型的关键。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
图4
(a, b)控制策略分析总BALF中细胞。(c, d)控制CD11b + F4/80 +细胞进行整体BALF中巨噬细胞计数来确定。(e, f)浇注的CD4 +细胞进行确定总体BALF中T淋巴细胞计数。(g h)浇注CD11b + Ly6G +细胞进行整体BALF内中性粒细胞计数来确定。进行kaplan - meier和log-rank测试分析比较两组。 , ,相比之下,二次金黄色葡萄球菌在感染性肺炎小鼠治疗isotypical免疫球蛋白的控制。
3.5。罗勒多糖提高存活率Sepsis-Induced次要的金黄色葡萄球菌从中性粒细胞肺炎小鼠通过促进亚兰分泌

先前的研究已经发现,趋化因子的亚兰施加重要组成部分的肺部疾病,如细菌性肺炎的发病机理和呼吸道防御(33]。我们的研究显示,罗勒多糖可显著提高水平的亚兰的肺sepsis-induced次要的美国aureu年代肺炎小鼠(图3 (f))。这表明,罗勒多糖的治疗效果可能与招聘有关趋化因子亚兰的肺。因此,我们研究了亚兰在sepsis-induced次要的角色金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型。首先,我们观察到,在次要的金黄色葡萄球菌脓毒症引起的肺炎,重组亚兰可以改善肺部病理学和肺损伤,增加细菌清除率的肺和血液,减少肺损伤和死亡率,有效促进肺巨噬细胞招聘(数字5(一个)- - - - - -5(我))。中性粒细胞免疫细胞可以分泌多种趋化因子,如il - 1β引发,干扰素-γ诱导蛋白10 (IP-10)和亚兰(32]。虽然我们没有确定的能力罗勒多糖在促进中性粒细胞招聘在肺部,在体外实验结果显示,罗勒多糖能有效地促进中性粒细胞分泌的亚兰。这些发现强调了罗勒多糖的分子免疫机制在调节sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎小鼠(图5 (j))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
(h)
(h)
(我)
(我)
(j)
(j)
图5
重组蛋白的亚兰(CC受体配体4)在脓毒性小鼠抵抗金黄色葡萄球菌肺炎。重组蛋白亚兰(500 ng) 2小时后服用金黄色葡萄球菌接种在败血症的老鼠。对照组给予相当于免疫球蛋白的控制。(一)感染性小鼠的生存次要的金黄色葡萄球菌感染( 老鼠/集团)重组蛋白亚兰后管理。(b, c)血液和肺的脓毒性小鼠CFU次要的金黄色葡萄球菌感染( 老鼠/集团)重组蛋白亚兰后管理。(d-f)肺损伤评估指标如BALF中蛋白质、髓过氧化酶(MPO)以及湿/干重比与二级感染性老鼠金黄色葡萄球菌感染( 老鼠/集团)重组蛋白亚兰后管理。(g)小鼠巨噬细胞在感染性BALF的总数与次要的金黄色葡萄球菌感染( 老鼠/集团)重组蛋白亚兰后管理。(h i)继发性肺感染的组织学得分金黄色葡萄球菌脓毒性小鼠( 每组)。Log-rank (Mantel-Cox)执行测试来分析生存曲线。值的方式 ,而非参数Mann-Whitney 试验采用数据分析。# , , ,和 ,相对次要的肺部感染金黄色葡萄球菌败血性的老鼠接受重组蛋白亚兰治疗。(j)亚兰后的细胞上清液的浓度金黄色葡萄球菌或罗勒多糖刺激中性粒细胞48小时。 , ,单向方差分析和LSD多重比较,相对于金黄色葡萄球菌组。
3.6。罗勒多糖诱导巨噬细胞吞噬作用和杀戮金黄色葡萄球菌p38 MAPK信号通路

确定罗勒多糖诱导的细菌吞噬细胞的防御能力,本研究调查了细菌吸收和支气管肺泡灌洗液中巨噬细胞间隙。预处理和罗勒多糖促进吞噬细胞内杀害金黄色葡萄球菌通过巨噬细胞(数据6(一)和6 (b))。此外,本研究探讨了可能的影响机制BPS金黄色葡萄球菌杀戮和吞噬能力。p38 MAPK信号通路发挥重要的部分规定的细菌清除率和巨噬细胞吞噬作用32,34]。本研究结果,进行免疫印迹试验分析蛋白质的表达与这些信号转导途径有关。BPS治疗后,p38 MAPK信号表达显著增加(数据6 (c)和6 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图6
罗勒多糖治疗对巨噬细胞的能力的影响,消除细菌和吞咽。h (a, b) 12个基点巨噬细胞进行治疗,其次是30分钟的金黄色葡萄球菌(MOI, 10)或FITC-labeled金黄色葡萄球菌感染下37°C。然后我们决定FITC-labeled吞噬金黄色葡萄球菌计数和细胞内的细菌杀死( h)根据特定的描述。(c, d)后12 h (BPS治疗,免疫印迹试验是确定p38MAPK信号在巨噬细胞内进行的。 , ,和 ,在单向方差分析和LSD多重比较,比较的基点。
3.7。罗勒多糖促进调节性T淋巴细胞的分化Sepsis-Induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎小鼠

前面的结果发现CD4细胞+在sepsis-induced二级淋巴细胞显著增加金黄色葡萄球菌肺炎小鼠(数据4 (e)和4 (f))。接下来,我们使用流式细胞仪检测BALF Treg淋巴细胞在老鼠。结果显示,罗勒多糖政府后,Treg老鼠BALF细胞显著增加(数据7(一)和7(b))。为了进一步分析的影响罗勒多糖Treg淋巴细胞的分化,天真的CD4 + T淋巴细胞从老鼠脾脏分离和培养在体外。之后,细胞被干预与个基点。在3天后,观察Treg细胞分化的趋势在天真的CD4 + T淋巴细胞(数字7(c)和7(d))。综上所述,这些数据表明,罗勒多糖可以促进天真Treg细胞CD4 + T淋巴细胞分化,从而发挥免疫调节效应sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎小鼠。


图7
个基点推动天真Treg细胞CD4 T淋巴细胞分化。(a, b)我们从BALF小鼠T细胞分离。CD4 + CD25 + Foxp3 Treg细胞比例测量通过流仪分析,研究结果表明意味着从5老鼠在每个时间点。(c, d) Treg提升比例相对于基点后:集团的挑战。 , ,单向方差分析和LSD多重比较进行了测试比较两组。

4所示。讨论

微生物学的临床治疗后,患者治疗失败的经验明显高复发性肺炎和高易感性sepsis-induced继发肺部感染(35]。这些发现已经与sepsis-induced免疫抑制的发展(36]。报导了几个新疗法减少sepsis-induced免疫抑制率和近年来限制容易继发肺炎。然而,这些新方法的有效性仍然是临床医生(穷人和代表一个重大挑战37]。伟大的尝试一直试图避免抗菌素耐药性传播;随着时间的推移耐药细菌的发展仍然是不可避免的(38]。一个可能的方法是相关immunity-specific靶向治疗(39]。罗勒,与不同的药用应用程序,已纳入药典(2015年版)。罗勒多糖被认为是最重要的活性化合物罗勒,而甘露糖(人),鼠李糖(Rha)、葡萄糖(相关)、果糖(Fru)和阿拉伯糖(Ara)代表其主要组件(40- - - - - -42]。研究表明,多糖可能通过刺激巨噬细胞免疫增强剂,保护免疫器官,同时构建补充系统,从而发挥的作用immunoenhancers [43,44]。不仅如此,罗勒多糖也展示一个广泛的抗菌活性。他们还表现出抑制作用在各种常见的细菌感染(45]。在这项研究中,我们观察到在实验sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎模型,罗勒多糖可以改善肺部病理学和肺损伤,增加细菌清除率从肺部和血液,并有效降低死亡率(图1);然而,这样的影响是在实验观测到sepsis-induced次要的铜绿假单胞菌(补充数据(可用肺炎模型在这里))。这些发现表明,罗勒多糖可以作为一种新的辅助治疗sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎。

之间的不平衡的促炎细胞因子水平和抗炎细胞因子水平sepsis-mediated免疫抑制的特征,这使得主机容易继发肺炎,尤其是院内肺炎(46,47]。一般来说,如数据所示2 (c)和2 (d)在CLP后72小时,促炎细胞因子包括MIP-1β/亚兰,TNF -α,il - 1β、il - 6和IL-17A在降低血清和BALF和抗炎细胞因子il - 10显著增加。同时与对照组相比(假+ SA)、肺泡灌洗液和CLP + SA组小鼠的血清样本显示低水平的促炎细胞因子、趋化因子(包括TNF -α,il - 1βIL-17A, il - 6和CCL-4)和较高的抗炎细胞因子(il - 10),表明sepsis-induced二级金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型提出了一种免疫抑制状态(图2 (f))。

接下来,我们介入管理罗勒多糖2小时后第二次打击。如图3 (f)虽然没有统计学意义,罗勒polysaccharide-treated组表现出稍微增加趋化因子和细胞因子表达式(如il - 1β肿瘤坏死因子-α内il - 6, IL-17A和处于受控)肺泡灌洗液和血清样本,与免疫球蛋白组相比,在统计上有显著差异的亚兰的水平。在一起,这些发现表明,罗勒多糖的治疗效果可能与招聘有关趋化因子亚兰的肺。至于宿主防御,招募免疫和炎症效应细胞组织损伤,肿瘤和感染的网站仍然是一个重要的部分。这种反应可以部分调制通过当地生产中介网络,如脂质或趋化蛋白(46]。趋化因子是至关重要的促炎细胞因子与宿主防御调节激活和招募白细胞的趋化性或其他类型的细胞进入肿瘤,感染,或受伤的网站(47]。MIP-1β,也被称为亚兰,属于趋化因子家族和感染的免疫反应和炎症是至关重要的。亚兰是一个至关重要的招聘单核巨噬细胞趋化现象的中介,自然杀伤细胞、T淋巴细胞和细胞因子的生产监管33]。此外,研究表明,亚兰(MIP -β)趋化因子在调节免疫细胞因子网络内发挥至关重要的部分,呼吸道的炎症反应,这可能促进肺部疾病的发病机理(48- - - - - -50]。根据文章,评估间质性肺疾病(51),肺脓毒症(52),或氧化剂肺损伤53)动物模型,亚兰(MIP -β)对疾病发病机理的重要组成部分,呼吸道防御。因此,我们调查了sepsis-induced亚兰的次要角色金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型。首先,我们观察到在实验sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎、重组亚兰可以改善肺部病理学和肺损伤,增加细菌清除率从肺部和血液,并有效促进巨噬细胞招聘在肺部和降低死亡率(数字5(一个)- - - - - -5(我))。其次,现场招募中性粒细胞是第一个免疫细胞的炎症54]。他们可以分泌多种趋化因子,包括il - 1β引发,干扰素-γ诱导蛋白10 (IP-10)、巨噬细胞炎性蛋白- 1α(MIP-1α),MIP-1β(亚兰)55]。根据之前的报道,中性粒细胞释放后,MIP-1β(亚兰),一个关键的趋化现象的招聘中介的单核细胞/巨噬细胞,促进巨噬细胞的内吞作用,导致炎症的回归56]。因此,我们进一步调查是否罗勒多糖可促进中性粒细胞分泌的亚兰;我们提取小鼠腹膜中心粒在体外文化。结果表明:BPS能有效地促进亚兰的分泌中性粒细胞(图5 (j))。这可能是罗勒多糖的分子免疫机制调节sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎。

吞噬细胞,尤其是常驻巨噬细胞和中性粒细胞招募,感染产生免疫反应的一个重要组成部分网站,在早期或晚期;此外,他们表达不同的清道夫受体,从而清除衰老宿主细胞,蛋白质,和外国的细菌(57]。我们的在体外实验表明,与罗勒多糖预处理可以有效地促进吞噬作用和杀死巨噬细胞的吞噬能力金黄色葡萄球菌(数据6(一)和6 (b))。激活细胞内信号转导途径是必要的交互与外国病原体宿主细胞(58]。本研究还探讨了BPS治疗巨噬细胞的影响改变胞内信号转导在二次感染金黄色葡萄球菌。根据我们的调查结果,BPS显著提升p38MAPK信号转导通路激活后巨噬细胞内金黄色葡萄球菌挑战(图6 (c)和6 (d))[34]。上述途径参与宿主细胞能够识别和吸收细菌和BPS-mediated增强巨噬细胞杀死细菌和吞咽的能力部分监管通过提升p38MAPK信号转导通路的激活。

细胞凋亡是一个重要的组成部分,正常的生理机制和发生体内平衡机制来平衡细胞增殖和细胞死亡。细胞凋亡是由基因的起始和受细胞内生化反应的刺激和细胞外信号(59]。在生理条件下,细胞凋亡是必要消除pathogen-invaded细胞和参与消除炎性细胞;然而,在病理情况下,它与多系统疾病的发展60]。一些研究发现,细胞毒性的影响金黄色葡萄球菌在入侵上皮和内皮细胞是介导细胞凋亡(61年,62年]。通过coculturing人类T淋巴细胞金黄色葡萄球菌外毒素,乔纳斯等人发现,nanomolecular浓度的毒素可引起不可逆的ATP耗竭或休息时,T淋巴细胞的激活。T淋巴细胞膜更渗透单价离子,导致核DNA降解和细胞凋亡63年]。这些研究表明的发病机制金黄色葡萄球菌与细胞凋亡密切相关。在这项研究中,我们发现在sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎小鼠模型,肺细胞凋亡明显增加。然而,罗勒多糖治疗可以显著降低小鼠的肺细胞凋亡(数字3 (d)和3 (e))。这些发现强调的另一个重要机制监管的罗勒多糖sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎。

人体的免疫系统在抵抗病原菌有几个功能,调节炎症反应和抗炎反应64年,65年]。人类的免疫系统包括体液免疫和细胞免疫;蜂窝组件中,T淋巴细胞代表主细胞参与实现细胞介导免疫反应(66年]。此前研究表明,CD4 T淋巴细胞是必不可少的肺部抵抗特定病原体(67年]。报告还表明,CD4基因敲除小鼠(KO),的清除率金黄色葡萄球菌明显受损。而在金黄色葡萄球菌介导实验胸膜炎,CD4 T淋巴细胞发挥重要作用[68年]。因此,我们分析了罗勒多糖对CD4 +淋巴细胞在小鼠模型sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎。首先,我们测试了CD4 +淋巴细胞的数量在鼠标BALF和发现罗勒多糖可显著提高CD4 +淋巴细胞在肺部(数字4 (e)和4 (f))。以前的研究也表明,个基点提高T细胞活化抗原在树突状细胞(dc)表示,从而提高免疫反应和监测(21]。接下来,我们测试了CD4 + T淋巴细胞(Treg细胞)的子集BALF实验老鼠,和结果表明,罗勒多糖能增加Treg BALF细胞的比例(数字7(一)和7(b))。进一步说明BPS影响T淋巴细胞分化,天真的CD4 + T淋巴细胞分离的小鼠脾脏在体外文化,结果显示,罗勒多糖可以显著促进天真Treg细胞CD4 + T淋巴细胞分化(数字7(c)和7(d))。

5。结论

总的来说,在这项研究中,我们发现个基点可以有效地加速MIP-1β(亚兰)分泌的招募中性粒细胞单核细胞/巨噬细胞(MΦ)在肺,增强巨噬细胞内吞作用和杀害金黄色葡萄球菌通过p38MAPK信号通路的激活,显著降低肺的细胞凋亡,促进天真Treg细胞CD4 + T淋巴细胞分化。除此之外,该研究强调了一个重要机制发挥保护作用的BPS sepsis-induced次要的金黄色葡萄球菌肺炎。

数据可用性

使用的数据集或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

本研究按照建议进行机构的动物保健和使用委员会重庆医科大学。所有实验协议机构批准的动物保健和使用委员会重庆医科大学。

的利益冲突

所有作者没有任何可能的利益冲突。

作者的贡献

假设和设计概念是由王Chuanjiang和习近平陈。数据采集和分析是由悦他。手稿准备了悦习他和陈。王的修订手稿是由Chuanjiang。搜索和参考书目是由魏羌族的集合。我们确认手稿已经阅读和批准所有命名的作者,没有其他的人满意的标准作者但没有列出。我们进一步确认作者手稿中列出的顺序已经认可了我们所有的人。习陈和曰他贡献了同样的工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81803110,QW)和基础科学和前沿技术研究项目重庆市科学技术委员会(cstc2020jcyj-msxmX0014, CJ-W)。

补充材料

补充图:(A)铜绿假单胞菌感染( 每组),我们观察的10个交易日内死亡率。(B, C)后肺或每组BALF细菌菌落与挑战铜绿假单胞菌( 老鼠/组)。(D, E)肺损伤评估指标如BALF中蛋白质、髓过氧化物酶,在左肺湿/干重比测量后的挑战P。绿脓杆菌( 老鼠/组)。 , ,和 ,在单向方差分析和LSD多重比较。相比之下,金黄色葡萄球菌感染用罗勒多糖治疗组或CLP-surgery老鼠在次要的金黄色葡萄球菌感染用罗勒多糖治疗组。ns:两组之间没有统计学意义的挑战铜绿假单胞菌。(补充材料)