文摘

的目标是。调查的影响glp - 1在的/ GLP-1R巨噬细胞极化的发生和动脉粥样硬化的发展。方法。完全,49冠心病(CHD)患者和52例健康控制(HC)招募了,所有受试者接受冠状动脉造影黄金标准检查。一个或多个主要冠状动脉(LM,小伙子、LCx和RCA)狭窄程度在50%的患者冠心病组;其余的狭窄小于50%或未见明显狭窄被分配到HC组。流式细胞仪是用来检测(CD14 +)米巨噬细胞的比例,(CD14 + CD80 +)巨噬细胞M1, M2巨噬细胞(CD14 + CD206 +),及其表面GLP-1R表达两组的差异,利用BD细胞因子检测引发的水平,il - 1βTNF、il - 6、il - 10,和IL-12p70。结果。GLP-1R表达总巨噬细胞和M2巨噬细胞表面不同冠心病组和HC组( )。没有差异的百分比,M1和M2巨噬细胞( )。引发HC组浓度高于冠心病组( )。细胞因子il - 1没有显著差异βTNF、il - 6、il - 10,和IL-12p70两组( )。在控制了潜在的混杂因素包括年龄、性别、吸烟状态(s),饮酒状态(科学博士),人力资源,SBP,类似PP、TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白GHbA1c, M, M1, M2, GLP-1R_M, GLP-1R_M1, GLP-1R_M2,引发,il - 1βTNF、il - 6、il - 10,通过多元线性回归和IL-12p70,减少Gensini积分M1巨噬细胞的比例明显增加。结论。GLP-1R受体激动剂是独立的二型糖尿病的降糖效果和对心血管系统有保护作用。对M2 GLP-1R可能调节巨噬细胞的极化,从而发挥保护作用在冠状动脉粥样硬化的进展。

1。介绍

2型糖尿病(T2DM)病人体内是一个主要的风险因素对冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病);冠心病是严重和致命并发症的2型糖尿病(1]。患者长期病程超过10年经常有视网膜病变,这是失明的主要原因之一,严重影响患者的生活质量2]。更重要的是,动脉粥样硬化(AS)是恶性肿瘤的病理基础心血管和脑血管事件(MACE)如冠心病、急性心肌梗塞(AMI),和中风(3]。尽管一直是研究领域的核心在心血管和脑血管疾病,这种复杂的疾病还没有被人类征服了。

研究发现,各种慢性非传染性疾病,如原发性高血压(EH), 2型糖尿病,,肥胖,和非酒精性脂肪肝病(NAFLD),不仅与遗传有关,环境,和代谢紊乱4),但也轻微的全身慢性炎性反应;炎症和免疫反应参与其发生和发展在某种程度上(5]。巨噬细胞是先天免疫细胞,不仅损害血管内皮细胞作为初始因子在动脉粥样硬化的过程中,多贯穿动脉粥样硬化发展的整个过程(6]。泡沫细胞形成ox-LDL吞噬后,进一步释放炎性细胞因子,它也扮演着至关重要的作用[6]。此外,适应性免疫T细胞所代表的子集,如Th(辅助T细胞)和Treg(调节性T细胞)也参与进来,和其他Th2 Th9, Th17, Th22子集仍有待研究[7,8]。

Glucagon-like peptid-1受体(GLP-1R)是一个G protein-coupled受体(9];动物研究表明,激活GLP-1 / GLP-1R途径可以受益老鼠,和极化的机制包括免疫细胞10]。然而,大多数当前的研究在细胞或动物的水平。GLP-1R人类免疫细胞的分布以及它是否协调人类巨噬细胞的极化,然后独立作出antiatherosclerosis无2型糖尿病患者的影响尚不清楚。因此,本文打算使用流式细胞术分析M1(促炎)和M2的分布(消炎)巨噬细胞及其表面GLP-1R不同程度的冠心病患者,初步探讨细胞因子网络的角色GLP-1R-mediated免疫细胞极化。

2。方法

2.1。主题

所有参与者提出了诊断的冠状动脉粥样硬化(冠心病)承认美国心脏病学,大学隶属于湖北东风总医院医学,从2020年8月到9月,人临床症状,如胸闷、知情同意后收集。所有受试者接受金本位的心脏血管造影检查,一个或多个主要冠状动脉左主干(LM),左前降枝(小伙子),左旋(LCx)和右冠状动脉(RCA)狭窄程度在冠心病组中,50%的病人低于50%,其余的狭窄或没有明显狭窄被分配到卫生控制(HC)组。入选标准如下:汉族,慢性心肌缺血综合征,急性冠脉综合征;所有接受心脏血管造影术。排除标准如下:(1)二级或妊娠期糖尿病;(2)服用激素药物,如甲状腺激素和糖皮质激素;(3)类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病;(4)严重心、肝、肾功能不全;(5)恶性肿瘤;(6)急性心肌梗塞以外的疾病,如主动脉夹层动脉瘤。 Finally, 101 people who met the requirements were included in the analysis.

2.2。数据收集和实验方法

一般信息收集的所有对象,包括年龄、性别、吸烟、饮酒、心率(HR)、收缩压和舒张压(SBP)类似,和微分脉压(PP)。Gensini积分是根据指南在2009年完成11]。外周静脉血禁食病人的编号,和甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白),高密度脂蛋白胆固醇(hdl - c),和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)检测到酶方法使用自动生化分析仪。测定糖化血红蛋白A1c (GHbAc1)高压液相色谱法(HPLC)。

2.3。巨噬细胞的检测GLP-1R表达

血液样本存储4°C取样和测试后8小时内确保活细胞的数量在每个样本。集群的免疫细胞如下:1μL CD3 +标记抗体,5μL CD4 +标记抗体,5μL CD80 +标记抗体,10μL CD14 +标记抗体,10μL CD80 +标记抗体,10 -μL CD206 +标记抗体加入2毫升与涡3 s EP管和混合。10μL抗体被加入到微球试管(没有绝对计数。Z6410004-10微球号码:51300)。反向吸收30μ从疑似冠心病患者L EDTA-K2抗凝全血管的底部。与涡3 s混合后,在室温下血孵化和暗了25分钟。溶血剂460μL流式细胞分析仪稀释1次被添加进管、管帽是放置在管,轻轻的涡15 s。解决办法是远离光在室温下10分钟。

流式细胞分析仪设置如下:NovoExpress软件被用来进行自动采样单元分析。六个通道参数B530 (CD14 FITC) B572 (CD206 PE), B675 (CD80 PE-CY7), R675 (GLP-1R APC)和R780 (CD4 APC-CY7)。停止条件:5000 M1巨噬细胞或样本容量高达450μL流量:高速、66μL /分钟;示例流直径:16.8μm。板管理:混合每隔3井,每3井冲洗一次。混合参数:速度:1500 rpm,加速时间:2 s,时间:10年代。流式细胞仪由两名有经验的人员完成,进行盲目与未知分组每个样本的方法,以避免系统误差造成的暴露怀疑偏差由主观因素造成的。

2.4。检测细胞因子

收集到的全血抗凝管放入离心机,离心5分钟的500克,和上等离子体吸收和存储在冻存管,这是存储在-80°C冰箱以备后用。BD细胞因子工具包(551811号)是用于定量分析的引发,il - 1βTNF、il - 6、il - 10,和IL-12p70。

制备炎性细胞因子标准:画2毫升瓶中稀释测定冻干炎症因子标准的瓶子里,用液体移动头轻轻混合重组蛋白,平衡室温20分钟,然后转移标准15毫升聚丙烯管,标记为最高浓度的标准(5000 pg / mL),其他八15毫升聚丙烯管标记为1:2、1:4,1:8、1:16日,1:32岁,1:64年,和1:128年,分别一个负控制也贴上。

混合人类炎性细胞因子捕获微球:六瓶捕获微球涨跌互现,每次之前完成涡捕获微球3 - 5 s完全中断。上述混合捕获微球在200 g离心5分钟,认真吸收和丢弃的上层清液30μL,添加相同体积的血清增强缓冲悬挂,为了减少假阳性的等离子体类型样本含有蛋白质,在室温下和孵化在黑暗的30分钟。

血浆样品检测程序:所有合格的血浆样本存储在-80°C,立即放在冰解冻。涡旋混合所有血浆样品的无菌管、离心5分钟500克。加30μL混合捕获所有EP珠管,涡捕获珠子每5 EP管。数量每EP管;加30μL每个样本编号EP管和孵化为1.5小时在室温下在黑暗。1毫升洗涤缓冲被添加到每个EP管然后在200 g离心5分钟。仔细,不断吸收和丢弃上层清液,留下约100μL在每个EP管的液体。加30μL人类炎性细胞因子PE二级抗体EP管轻轻地搅拌。舱口的EP管在室温1小时没有光。加1毫升每个管和离心洗涤缓冲200 g为5分钟一次。小心地提取和丢弃每个EP的上层清液管。300年μL洗涤缓冲被添加到每个EP管resuspend捕获的微球。样品转移到96孔板进行测试,采用注射和随机序列的细胞因子检测血浆样品。

这些细胞被自动收集和分析使用NovoExpress软件。6通道参数是B530 (FITC) B572 (PE), B67 (Per-CP) B780 (PE-CY7) R675 (APC),和R780 (APC-CY7)。停止条件:100 1800微球捕获或样品μL体积被检测到。流量:低速,14μL / min。流直径:7.7μm。阈值:FSC-H大于10000,SSC-H大于5000。董事会管理:混合一旦每口井,每口井的冲洗一次。混合参数:速度1000 rpm,加速时间0和5 s。

FCAP软件参数:散射参数:FSC-A,散射峰:5,聚类参数:APC-A,报告参数:PE-H微球A1, A2, A3、A4、A5、A6相应的引发,il - 1βTNF、il - 6、il - 10,和IL-12p70。定量分析混合人类细胞因子的浓度标准曲线理论为:0.00 pg / mL, 19.53 pg / mL, 39.06 pg / mL, 78.13 pg / mL, 156.25 pg / mL, 312.50 pg / mL, 625 pg / mL, 1250 pg / mL, 2500 pg / mL,每个细胞因子标准曲线的5000 pg / mL。为每个细胞因子拟合标准曲线,阅读的最终浓度每个样本中的每个细胞因子进行统计分析。

2.5。统计分析

对数正态分布分布改变后Gensini积分展品 ,和作为因变量的多元线性回归模型。测量数据所描述的 ;后一个示例Kolmogorov-Smirnov正规性检验和方差同质性测试中,变量符合正态分布和方差齐性检验 - - - - - -测试,而变量方差不均匀被校正测试 - - - - - -测试。其余的偏态分布数据与中位数描述,上、下四分位数。计算卡方测试的数据。细胞因子的浓度两组与非参数Mann-Whitney相比测试。斯皮尔曼相关分析是用于两个变量。所有价值源于2-tailed分析; 被认为是统计学意义。与IBM SPSS统计分析26。

3所示。结果

3.1。临床数据

包括在这项研究中,101名患者,包括52名患者在健康控制(HC)组和冠心病组49例,其收缩压高于对照组( )。此外,冠心病组相比,HC组甘油三酯水平较低和较高的高密度脂蛋白胆固醇,这是符合当前对冠心病危险因素的看法。在我们的研究中,没有进行分配或GHbA1c水平差异两组( ),可用于分析GLP-1R表达式的差异在两组巨噬细胞及其亚型。两组的临床和生化特征研究如下(表1)。

3.2。表达不同的巨噬细胞、巨噬细胞M1和M2巨噬细胞在冠心病组和HC组:CD14⁺,CD14⁺CD80⁺,CD14⁺CD206⁺

总巨噬细胞被CD14标记⁺抗体,M1 CD14的巨噬细胞⁺CD80⁺double-positive抗体,CD14和M2巨噬细胞⁺CD206⁺double-positive抗体。先前的研究已经表明,GLP-1R受体激动剂可以改善糖尿病患者的心血管疾病的风险,而在这项研究中,之间没有差异分布的2型糖尿病冠心病组和HC组,从而避免偏差引起的糖尿病患者的不同分布在两组之间。在这项研究中,总数的百分比,M1, M2巨噬细胞显示没有区别冠心病组和HC组( ),表明巨噬细胞的相对含量可能不是最关键因素对冠心病(图的发展1)。

3.3。表达不同的表面GLP-1R, M1, M2巨噬细胞在冠心病组和HC组:CD14⁺GLP-1R⁺,CD14⁺CD80⁺GLP-1R⁺,CD14⁺CD206⁺GLP-1R⁺

如前所述,两组之间没有差异被发现在巨噬细胞不同的表型,这似乎并没有证明M1和M2巨噬细胞协同效应,我们通常认为的。然而,我们惊奇地发现,GLP-1R巨噬细胞表面的表达是不同的两组,虽然不同的巨噬细胞表型的百分比在冠心病组和对照组无统计学意义( ),与对照组相比,GLP-1R表情M2巨噬细胞在冠心病组高,这似乎表明,巨噬细胞和抗炎功能可以表达更多GLP-1R心血管有益。没有发现显著差异表达抗炎表型在M1巨噬细胞(图2)。

3.4。引发的表达,il - 1βTNF、il - 6、il - 10,和IL-12P70两组

有一个统计上的显著差异引发两组之间的浓度( ),虽然没有一个细胞因子il - 1βTNF、il - 6、il - 10,和IL-12P70被发现是不同的两组之间在我们的研究中(图3)。

3.5。巨噬细胞及其表面GLP-1R与血脂之间的相关性和细胞因子

我们分析了巨噬细胞及其表面GLP-1R与血脂之间的相关性和细胞因子:包括(1)在所有的研究,GLP-1R巨噬细胞表面表达的TG(成反比 , ),M1的百分比巨噬细胞il - 10成反比( , );(2)HC组总巨噬细胞的百分比与TG负相关( , ),而M2巨噬细胞GLP-1R表达增加与减少引发级别( , );(3)在冠心病组,M2巨噬细胞的百分比是成反比的百分比总巨噬细胞( , )。然而,在M1 GLP-1R巨噬细胞的表达直接正比于TG ( , )(图4)。

3.6。M1 Gensini积分的巨噬细胞百分率的影响

对数转换Gensini得分作为因变量潜在混杂因素调整年龄、性别、吸烟状态(s),饮酒状态(科学博士),人力资源,SBP,类似PP、TC、TG、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白GHbA1c, M, M1, M2 GLP-1R_M, GLP-1R_M1, GLP-1R_M2,引发,il - 1βTNF、il - 6、il - 10,和IL-12p70。进行了多元线性回归分析,模型方程 ,方程是统计学意义( )。确定系数R2为0.457,入口条件是0.1和0.15排除条件。

4所示。讨论

倒带实验(12)是一个双盲随机安慰剂对照试验,发现中老年2型糖尿病患者有先前的心血管疾病或心血管疾病风险因素可能受益于liraglutide的使用。这表明GLP-1R受体激动剂的有益的抑制性影响心血管疾病的发生和发展机制并不完全依赖的治疗2型糖尿病;因此,我们的研究包括冠心病患者冠状动脉造影证实和巨噬细胞的分布和表面相比GLP-1R没有偏见引起的2型糖尿病分布的差异或GHbA1c水平在两组之间。数据显示,GLP-1R总数和M2巨噬细胞的表达是冠心病组和HC组之间的不同( ),和HC组GLP-1R较高的表达。的表达水平GLP-1R M1巨噬细胞表面或总数的百分比,M1, M2巨噬细胞显示两组之间没有显著差异。这表明:(1)在冠心病的慢性炎症过程,改变GLP-1R表达水平比相对巨噬细胞更敏感的内容;(2)减少GLP-1R有益的抗炎类型(M2)冠心病患者巨噬细胞可以解释GLP-1R受体受体激动剂是独立的血糖控制效果,从而为冠心病的好处。

DPP-4抑制剂可以抑制人类的退化本机GLP-1 DPP-4酶和间接刺激GLP-1R。dina l·梅塔等。13PMA)用来阻止THP-1巨噬细胞,coincubate ox-LDL;抑制NLRP3 toll样受体(TLR4)和il - 1的表达,观察DPP-4抑制剂,以及upregulation GLP-1R表达式;虽然PMA的阻塞效应被GLP-1R受体激动剂如liraglutide松了一口气,本研究进一步表明动脉粥样硬化的炎症状态和免疫反应。数据显示,GLP-1R表达水平确实高总在对照组和M2巨噬细胞和炎症细胞本身的百分比,这表明GLP-1R可能发挥核心作用比炎症细胞在动脉粥样硬化的炎症调节节点;反过来,它也支持在冠心病GLP-1R的抗炎效果。

现有研究表明,炎症反应起着至关重要的作用在冠心病的发生和发展,2型糖尿病,慢性阻塞性肺疾病(COPD),慢性肝炎,牙周炎14),阿尔茨海默病(AD)等。il - 6 (15,16)已被证明是负相关与心率变异性(HRV)在冠心病妇女,提高HRV与副交感神经兴奋,心室颤动阈值的增加是保护性因素,这项研究再次证实il - 6是冠心病的一个危险因素。此外,引发,il - 10, MCP-1作为一个经典的炎性细胞因子,在冠心病都已经被广泛地研究过了17- - - - - -19]。6中细胞因子参与我们的研究中,il - 10是唯一的抗炎细胞因子,而其余的促炎细胞因子。然而,我们的数据表明,有统计上的显著差异引发浓度两组( ),而il - 1β,il - 6、TNF和IL-12P70显示无显著差异。

类似的结果卡琳娜Vargas-Sanchez的结果,GLP-1R没有与任何炎症标记物(20.]。因为表面的自然杀伤T细胞(NKT)也表达了GLP-1R,和这个途径可以增强等抗炎细胞因子il - 10的表达(21];这可能部分解释了更高的il - 10水平在卡琳娜Vargas-Sanchez疾病组和我们的研究,尽管没有统计上的显著差异在两组之间的il - 10在我们的研究中。此外,我们的样品是外围血液细胞因子,它可以反映出下游上述系统的调节人类影响的结果。

其他的可能性我们推测上述现象如下:(1)由于冠心病的诊断标准是50%的冠状动脉狭窄程度的一个或多个主要的限制,那些没有达到狭窄程度,但仍有轻微的斑块形成包括HC组,导致这一事实HC组斑块形成的并不是完全免费的,但更重要的是,如果一个统计上的显著差异被发现之间的狭窄的冠心病组和人口在0到50%之间,这将是更容易识别病人没有狭窄;(2)与急性炎症引起的严重的外伤或病原体感染,冠心病是一个温和的慢性炎症的循环系统19),炎症或基线浓度较低的抗炎细胞因子,在短期内没有显著变化;可能是多中心大样本大小,大规模的人口将揭示统计差异(17];(3)轻度炎症是常见的多种慢性疾病,和本研究的排除标准仅限于急性炎症、感染性炎症,患者自身免疫性疾病或服用免疫抑制剂,等等,除了慢性炎性疾病(心血管系统22]如轻度肝功能异常或轻度慢性胃炎患者没有被严格排除;更重要的是,过于严格的排除条件限制,该研究的结果的外推和真实世界的场景;(4)il - 1、il - 12和TNF -α可以用作M1巨噬细胞的分子特征,而il - 10、il - 4可以用作M2巨噬细胞的分子特征23]。如前所述在这项研究中,没有差别百分比的巨噬细胞M1和M2巨噬细胞之间的HC组和冠心病组;这也许可以解释为什么il - 12、il - 4、il - 1和il - 10两组没有差异。

动脉粥样硬化密切相关,脂质代谢和炎症反应24,25]。在这项研究中,101人包括相关分析表明,GLP-1R总巨噬细胞的表达水平是TG成反比;TG是已知的和公认的心血管危险因素(26),这表明GLP-1R负调节TG在冠心病患者和CS人口。HC组GLP-1R M2的表达水平与引发负相关,中性粒细胞的趋化因子;引发促进中性粒细胞炎症网站的迁移和块胆固醇流出通过抑制ABCA1的表达(27),从而促进炎症反应。劳拉·j·窝Hartigh [28)刺激人类单核细胞与TG和脂蛋白脂肪酶,VLDL的降解产物,然后发现单核细胞启动内皮细胞粘附,和发现引发的上调表达,从而支持我们的结果。结合流式细胞术检测在这项研究中,人们发现M2 HC组巨噬细胞的表达水平高于冠心病组;我们推测,与冠心病组相比,增强代表的保护性因素上调GLP-1R M2巨噬细胞表达HC组是主要原因。

虽然在冠心病组,GLP-1R_M1的表达水平与TG呈正相关,我们已经观察到细胞膜上的GLP-1R, M1, M2巨噬细胞是低于HC组。我们因此推测GLP-1R的高表达与M1巨噬细胞的数量增加,或者作为一个负面的反馈管理身体的补偿机制,M1巨噬细胞可能GLP-1R中高度表达。尽管这项研究并未显示差异的百分比M1巨噬细胞在两组之间,临床研究与更大的样本量可能显示不同来解释这一现象,具体机制和因果关系需要进一步研究。罗等。29日抑制ROS, NLRP3, Caspase-1 HUVECs利用GLP-1R兴奋剂Dulaglutide也抑制了il - 1的成熟和地震。因此,GLP-1R可能调节巨噬细胞的极化和释放不同的炎症性小分子通过NLRP3 / Caspase1机制,以规范的发展。

大规模免疫系统由免疫细胞、免疫器官,和炎症反应参与人体的生理和病理条件;新发现的作用和机制macrophage-subtype T细胞亚型在动脉粥样硬化需要进一步研究。像大多数临床研究,冠心病组和HC组根据冠状动脉造影和血管内超声的诊断金标准来区分,但技术本身,只提供狭窄部位和程度的结构信息,如函数索引血流储备分数(FFR)没有被收集并协助疾病的亚组分析。最后但并非最不重要,它是希望找到疾病生物标志物的冠心病(30.),如c反应蛋白(CRP)、il - 6、血清淀粉样蛋白A (SAA)、CD40 / CD40配体(CD40L)和热休克蛋白60 (Hsp60) [31日)和70 (Hsp70),但他们的特异性需要改进;因此,更加敏感和特定的炎性疾病生物标志物仍需研究。

5。结论

GLP-1R受体激动剂是独立的二型糖尿病的降糖效果和对心血管系统有保护作用。对M2 GLP-1R可能调节巨噬细胞的极化,从而发挥保护作用在冠状动脉粥样硬化的进展。

数据可用性

支持数据的结果在我们的研究可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

寒冬杨和小君陈设计研究。李阳和长陈收集的临床资料和完成了实验。郝Xu Yang Li东风Li Jishun Chen新汶Min Meian他Tangchun Wu轨迹中,赵小君(湖北大学医学院)完成了统计分析和解释结果。手稿被李阳起草,陈小君和纠正了李阳和杨寒冬。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81573244),从湖北大学教师发展资助医学(2018 qdjzr04),湖北卫生委员会的基础(WJ2021M061)和创新研究项目为湖北大学医学院的毕业生(YC2020017)。