文摘

背景。炎症反应与延迟相关口腔黏膜伤口愈合和牙周疾病的发病机理。微生物的入侵到组织和建立慢性感染可能是由于治疗受损。旷日持久的炎症阶段可能会延迟伤口愈合,可能支持组织纤维化,减少组织再生。香兰素是一个著名的天然化合物与潜在的抗炎能力。因此,我们假设香兰素会加速伤口愈合减少炎症细胞因子,特别是生产使口腔组织修复过程简单。方法。我们的假设测试主要使用人类牙龈成纤维细胞(HGF)和il - 1细胞使用香兰素和影射β,如电感促炎的环境。经过24小时的治疗,il - 6基因表达和生产,TNF -α,引发,cox - 2,进气阀打开,一氧化氮(NO)生成和伤口愈合率测定。结果。在il - 1β启动细胞,预培养和香兰素降低il - 6,引发,cox - 2,和伊诺表达和释放,而il - 1β启动细胞。此外,香兰素决定基因表达的增加乙酰胆α7,我们假设一个香兰素在胆碱能抗炎通路的激活。此外,在出现机械损伤,香兰素预孵化,伤口关闭可能会降低il - 6和TNF的表达和释放αupregulation cox - 2和引发。结论。在一起,这项研究的结果强调了il - 1的抗炎和组织修复能力的香兰素β影射HGF。因此,香兰素显示一个潜在的治疗利益作为炎症调制器分子小说在牙周再生应用和口腔健康。

1。介绍

炎症是定义为一个重要的生物事件发生身体的防御。它涉及免疫细胞和多个机制,在不同层次上运作,包括免疫细胞类型变化组织,细胞对炎症刺激反应性的变化,信号通路的调节,控制基因表达(1]。实际上,巨噬细胞促进先天宿主防御和炎症反应,释放的炎症介质白介素- 1 (IL)β、il - 6、引发、肿瘤坏死因子(TNF)α活性氧(ROS),一氧化氮(NO) (2]。这些分子调节炎症反应和触发适应性免疫激活,通过与细胞的相互作用特定受体(3]。牙周疾病,炎症条件与传染病病原学包括牙龈炎和牙周炎,在口腔健康流行疾病,最终可能导致严重的慢性疾病在口腔4]。炎症似乎与微生物生长与口腔组织的破坏和释放有害的营养物质,如降解胶原,heme-containing化合物,氨基酸的来源,和铁。这些事件可以推动建立炎性微环境和氧化应激的生产介质与牙周袋形成和牙龈组织,牙槽骨和牙周韧带的破坏。因此,炎症反应的重要角色在牙周病发病机理表明,减少细菌负荷和调节炎症是治疗牙周病的主要目标。最近,它已成为明显,天然化合物免疫反应(有重要的调控作用5]。到目前为止,天然酚类化合物受到了相当大的关注人类健康的改善。增加的草药的使用兴趣重燃的影响植物提取物对斑块的控制和其他口腔疾病(5- - - - - -7]。在他们的评论,Kouidhi et al。8)记录的潜在使用植物提取物、精油,和天然化合物作为牙科生物膜预防剂,和寻找天然抗炎剂用更少的副作用使得从制药工业研究实验室。不同自然常见草药组件如茶树油、芦荟、香兰素、姜黄素、洋甘菊最近介绍了抗炎分子牙科治疗(9]。

香兰素(4-hydroxy-3-methoxybenzaldehyde)是天然香草的主要组成部分,这是一种最广泛使用的风味成分在食品和个人产品10)与抗菌,抗诱变剂的抗血管新生的影响(11,12]。许多研究调查了香兰素在神经系统中的作用,展示了防止rotenone-induced SH-SY5Y细胞神经毒性(13)或antineuroinflammatory属性在小胶质细胞(14]。记住香兰素的抗菌和抗炎能力,因为到目前为止,还没有报道香兰素在口腔组织细胞的影响,本研究旨在调查香兰素的能力调节炎症反应、氧化应激、口腔组织修复。人牙龈成纤维细胞(HGF)是最丰富的居民口腔黏膜细胞,细胞因子和炎症HGF可能产生的核心作用在牙龈炎症和牙周组织修复。因此,模拟体外炎症微环境在牙周疾病,我们使用il - 1β电感器和增强剂的促炎反应主要牙龈成纤维细胞(15]。体外模型,我们的目标是评估香兰素对炎症的影响,氧化应激,并组织修复,以开放的方式可以在牙周疾病。

2。材料和方法

2.1。HGF抽样

健康的患者,年龄在20到25年,在牙科诊所被吸收了“G。邓南遮“基Chieti-Pescara大学的,意大利,智慧拔牙。书面知情同意释放后,废弃的牙龈组织获得和处理主要人类牙龈成纤维细胞(HGF)隔离。牙龈组织被安置在生理溶液,在室温下,运输到细胞培养实验室。这项研究是与委员会报告没有批准。14日,2015年7月23日由Inter-Institutional Chieti-Pescara大学的伦理委员会,意大利。每个样本编码保证匿名的捐助者。

2.2。细胞隔离和文化

为每个健康的捐赠者,牙龈碎片与生理氯化钠溶液洗涤和放置在一个T25培养瓶(默克公司,达姆施塔特,德国)充满了杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (pH值7.2;默克公司,达姆施塔特,德国)补充heat-inactivated 10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μ2 g / mL链霉素,更易与L谷酰胺(默克公司,达姆施塔特,德国)和左湿润有限公司2孵化器为37°C到细胞粘附发生。文化媒体取代新鲜培养基每周两次15天获得初级HGF。收集细胞后添加1 x trypsin-EDTA解决方案(默克公司,达姆施塔特,德国)和用于后来的实验。主要hgf被用于实验后通道4和5之间的隔离。

2.3。细胞生存能力分析

hgf的井被播种到96孔板的密度 细胞/。第二天,il - 1β(美国落基山Peprotech)浓度范围内0.1 -10 ng / mL或香兰素(默克公司,达姆施塔特,德国)在一个浓度范围100 - 300μ米或负控制(0.1% (v / v) DMSO)和积极控制(100% (v / v) DMSO)被添加到连接细胞,在新鲜培养基,24 h。细胞生存能力是由3 - 4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定,根据制造商的建议(默克公司,达姆施塔特,德国)。年底的孵化,MTT试剂添加2 h和孵化37°C, OD590海里的吸光度测定。吸光度数据规范化治疗对照组,视为生存能力的100%。

2.4。体外治疗

牙周疾病的炎症条件是模仿在体外启动hgf与il - 1β(1 ng / ml)。评价香兰素在炎症反应调制的能力,我们设计了两种不同的实验条件。在第一个实验条件, 细胞/厘米2HGF preincubated 2 h和200人μM il - 1的香兰素和治疗β下列的孵化24小时37°C, 5%的公司2,然后,基因表达和炎症介质的生产评估。在第二个实验条件,hgf被播种的细胞密度 细胞/厘米2在两组6-well板块完全培养基(10%的边后卫)和生长,直到单层汇合的。随后,模拟口腔伤口、擦伤了机械10μl无菌吸管小费。分离细胞和碎片被洗涤了杜尔贝科的磷酸缓冲盐(PBS),包含il - 1的新鲜培养基β,或者添加了香草醛进行孵化在37°C, 5%的股份有限公司224 h。另外,添加香兰素是前2 h,和添加新鲜培养基与香兰素+ il - 1补充β。香兰素的影响挠率的单层关闭监控通过观察细胞之间的区域重新伤口边缘,用倒置相差显微镜(德国徕卡)配备CCD相机,剩下的颗粒面积测量。

孵化结束时,这些细胞被收割的分析炎症介质参与伤口愈合。

2.5。亚硝酸盐的决心

测量没有生产,亚硝酸盐浓度文化上层的决心使用格里斯试剂(1%磺胺和0.1% N - (1-naphthyl)乙二胺盐酸盐在H3PO4 5%)(开曼化工、安阿伯市密歇根,美国)。100年μ细胞培养上清液和100 lμl格里斯试剂混合和孵化10分钟,显色。吸收约为540纳米,使用Glomax Multireader分光光度计(WI Promega,麦迪逊,美国)。亚硝酸盐标准(美国开曼化学,安阿伯市密歇根)被用来生成一个量化的标准曲线。从三个独立的实验测量结果。

2.6。ELISA分析

文化上层清液定量化验了il - 6、TNF -α,引发(升压PicokineTM ELISA、博士德生物技术,而钙、美国),与浓度后,制造商的指示。光密度测量在450海里。炎性细胞因子水平测定在所有不同条件下样品重复测量需要100年μL文化上层清液。结果通过使用内部控制标准化提供每个设备,用已知的目标蛋白质的浓度。il - 6, pg / ml;肿瘤坏死因子-α和引发, pg / ml。

2.7。RNA隔离和实时rt - pcr分析

使用经典的phenol-chloroform方法总RNA是孤立的。总RNA在260 nm量化使用NanoDrop 2000紫外-可见(紫外分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。1μg的RNA是反向转录cDNA在42°C和15分钟3分钟在90°C Quantiscript逆转录酶的灭活,根据协议QuantiTectReverse转录工具包(试剂盒,希尔登,DE)。实时PCR在中国只进行实时PCR检测系统(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州,美国),使用GoTaq®qPCR大师混合(WI Promega,麦迪逊,美国)来评估il - 6基因表达,乙酰胆α7,肿瘤坏死因子-α引发,进气阀打开,cox - 2和18 s看家基因(表1)。扩增程序由一个预孵化一步cDNA变性(2分钟95°C),紧随其后的是40个循环组成的变性步骤(30年代95°C),一个退火步骤(60年代60°C),和一个扩展步骤(30年代68°C)。每次运行结束时,熔化曲线的温度范围进行60到95°C。每个基因表达水平进行根据2- - - - - -ΔΔCt方法。

表1
引物序列用于实时PCR反应。
2.8。统计分析

定量变量概括为均值和标准差(SD)的数据。褶皱的精度变化,计算2- - - - - -ΔΔCt方法,确定使用95%置信区间(95% CI)。学生 - - - - - -测试未配对样本用于评估统计差异。测试将假定等于阈 值≤0.05。由SPSS inc .统计分析软件包(版本23.0)。一个,两个,三个符号代表两个团体之间的显著差异 , ,和 ,分别。

3所示。结果

3.1。香兰素和il - 1的影响β在胶质瘤可行性

5-dimethylthiazol-2-yl初步,使用3 - (4)2,5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)分析,我们分析了香兰素的影响(100、200和300μ米)和il - 1β(0.1 1和10 ng / ml), HGF生存。剂量反应实验表明细胞生存能力经过24小时的孵化与香草醛或il - 1β不是在任何测试浓度的影响(图1)。因此,1 ng / mL的il - 1的浓度β和200年μ米香兰素的选择来进行下面的实验。


图1
MTT可行性分析在胶质瘤细胞治疗24 h和香兰素(100、200和300μ米)或il - 1β(0.1 1和10 ng / ml)。吸光度值作为媒体±SD三个独立的实验。
3.2。炎症介质的生产

调查香兰素的影响,在炎症,我们使用了il - 1β促进胶质瘤细胞的炎性反应。HGF与il - 1的24 h后孵化β香兰素单独或香草醛(2 h预处理)+ il - 1β,il - 6、引发和TNF -α在细胞培养上清液水平进行评估,通过ELISA测定。肿瘤坏死因子-αil - 6 ( ),和引发( )是调节和il - 1的治疗吗β。与此同时,在香兰素,单独或作为发炎HGF的预处理,显著降低TNF -α、il - 6和il - 1相比,观察引发β启动细胞( )(图2)。


图2
肿瘤坏死因子-αil - 6,在胶质瘤细胞培养上清液和引发的水平。的 据报道, 。所有的实验都重复一式三份。
3.3。炎症介质的基因表达

为了研究如果镜子上层清液水平的细胞因子的差异不同的促炎细胞因子的基因表达谱,我们评估了处理和未经处理的胶质瘤细胞因子的表达情况,使用实时PCR。肿瘤坏死因子-α基因表达水平显著( )在il - 1诱导β影射HGF,如引发的水平( )与未经处理的细胞。香兰素治疗没有显著影响基因表达水平,相比其他条件。与香兰素的预处理,2 h,降低il - 6的表达( )和引发( )对il - 1β影射HGF。此外,由于乙酰胆α7可以表示组织内稳态的稳定的一个重要标志的存在持续的慢性炎症,我们评估香兰素对乙酰的影响α7基因表达。如图3,il - 1β影射HGF在乙酰胆无显著变化α7表达水平( )对未经处理的细胞。与此同时,香兰素独自领导乙酰略有增加α7基因表达,在Vanillin-pretreated胶质瘤细胞乙酰胆α7 mRNA表达明显增加,而未经处理的细胞( )和il - 1β影射HGF ( )。


图3
基因表达的肿瘤坏死因子-α、il - 6、引发和乙酰胆α7在胶质瘤细胞。数据报告为均值和95%可信区间,三个独立的实验。 。il - 1β:il - 1β启动细胞;范:香草醛;范(2 h) + il - 1β:香兰素(2 h预处理)+ il - 1β。
3.4。cox - 2和伊诺基因表达,没有生产

炎症刺激引起的cox - 2和伊诺表达发炎和受损组织的网站;因此,我们评估了香兰素对il - 1的影响β影射HGF。两hgf对香兰素单独或与香兰素(2 h预处理)+ il - 1β显示cox - 2基因表达(差别明显对这些 )对il - 1β影射HGF。伊诺基因表达,也负责生产,明显调节所有的治疗条件,较高的提高香兰素发炎HGF(图的预处理4)。


图4
基因表达cox - 2和伊诺的胶质瘤细胞。数据报告为均值和95%可信区间,三个独立的实验中, 。il - 1β:il - 1β启动细胞;范:香草醛;范(2 h) + il - 1β:香兰素(2 h预处理)+ il - 1β。

此外,如图5,生产的是HGF il - 1显著增加β启动,而未经处理的细胞。香兰素预处理的il - 1β影射胶质瘤细胞会使没有生产水平,而il - 1β影射胶质瘤细胞。这些结果强调了香兰素的调节能力没有生产由伊诺抑制作用。此外,如图5,生产的是HGF il - 1显著增加β启动,而未经处理的细胞。香兰素预处理、il - 1β的差别影射胶质瘤细胞,显示对这些没有生产水平,而il - 1β影射胶质瘤细胞。这些结果强调了香兰素的调节能力没有生产由伊诺抑制作用。


图5
没有在胶质瘤细胞水平的决定基于格里斯试剂反应。在重复实验,改变被报道 ; 。il - 1β:il - 1β启动细胞;范:香草醛;范(2 h) + il - 1β:香兰素(2 h预处理)+ il - 1β。
3.5。香兰素预处理对HGF挠发炎细胞的影响
3.5.1。伤口愈合

感染的主要因素是潜在的炎症,但同时,伤害或创伤可以触发炎症反应。愈合试验被用来研究组织修复的分子机制,以及研究香兰素的潜在应用是治疗改善软组织愈合。作为显示在图6(一)Vanillin-pretreated细胞,增加观察HGF迁移后24 h抓挠,达到100%的伤口关闭。在il - 1β启动细胞受损的胞外区(减少25%的伤口大小与T0)检测(数字6(一)和6 (b)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
伤口愈合的挠口服纤维母细胞单层照片和测量伤口面积都是划痕(T0)和后24 h后(T24)。(一)代表自愈的图像分析。(b)伤口修复后评估测量剩余的胞外区24 h和最初的伤口大小表示为一个百分比(T0)承担100%。 ; 。il - 1β:il - 1β启动细胞;范:香草醛;范(2 h) + il - 1β:香兰素(2 h预处理)+ il - 1β。
3.5.2。炎性介质表达和生产在伤口愈合

修复过程是由相互作用的分子信号,它指挥下属炎症和愈合的细胞活动。因此,我们已经确定了香兰素对生产的影响和促炎介质的基因表达。香兰素的预培养挠HGF单层降低il - 6与il - 1的生产β启动细胞( )并对未经处理的细胞( ),而生产的TNF -α和引发没有明显(图修改7)。


图7
水平的肿瘤坏死因子-α、il - 6和引发挠胶质瘤细胞的上清液。数据报告为均值和95%可信区间,三个独立的实验。 ; 。il - 1β:il - 1β启动细胞;范:香草醛;范(2 h) + il - 1β:香兰素(2 h预处理)+ il - 1β。

另一方面,肿瘤坏死因子的基因表达α和引发显著的影响治疗。特别是,减少肿瘤坏死因子-α在挠胶质瘤细胞诱导了香兰素( )和更多的香兰素(2 h预处理)+ 1β细胞( )(图8)。细胞的il - 6基因表达降低处理香兰素( )表达下调,香兰素(2 h预处理)+ 1β( ),相对于1β启动细胞。在挠HGF单层,我们观察到更高水平的引发基因表达在香兰素(2 h预处理)+ 1β关于治疗( )和il - 1β启动细胞( )。


图8
基因表达的肿瘤坏死因子-α、il - 6和引发挠胶质瘤细胞。数据报告为均值和95%可信区间,三个独立的实验。 ; ; 。il - 1β:il - 1β启动细胞;范:香草醛;范(2 h) + il - 1β:香兰素(2 h预处理)+ il - 1β。
3.5.3。香兰素对伊诺和cox - 2基因表达的影响,没有生产发炎挠胶质瘤细胞

号和考克斯酶之间的相互作用,重要的炎症介质,被建议16]。因此,我们评估了信使rna表达水平的cox - 2和伊诺挠胶质瘤细胞单层preincubated香兰素和影射与il - 1β。24 h后出现机械损伤和治疗的孵化,cox - 2基因表达显著增加( )中检测出香兰素(2 h预处理)+ 1β,而其他条件(图9)。与此同时,香兰素( )单独使用或作为预处理( )发炎的显示显著upregulation伊诺,胶质瘤对1β启动细胞。


图9
基因表达cox - 2和伊诺的胶质瘤细胞。数据报告为均值和95%可信区间,三个独立的实验。 ; 。il - 1β:il - 1β启动细胞;范:香草醛;范(2 h) + il - 1β:香兰素(2 h预处理)+ il - 1β。

没有生产的弱诱导在发炎挠胶质瘤细胞( )恢复了香兰素(2 h预处理)+ 1β( )。减少 ,如图10。


图10
没有在胶质瘤细胞水平的决定基于格里斯试剂反应。在重复实验,改变被报道 。 ; 。il - 1β:il - 1β启动细胞;范:香草醛;范(2 h) + il - 1β:香兰素(2 h预处理)+ il - 1β。

4所示。讨论

治疗潜在的兴趣的酚类化合物,存在于食品和药用植物,在过去十年增加相关性[15,17]。在许多疾病,炎症可以确定全身炎症,表现为系统性氧化应激,循环炎症细胞的活化,增加循环的炎性细胞因子水平。炎症反应的影响由酚类化合物已成为一些新的治疗策略的重点和有前景的结果(18,19]。使用香兰素在口腔炎症尚未评估,尽管其有趣的对氧化应激和炎症的影响可能代表一种治疗炎性疾病的新策略。口腔成纤维细胞,除了由巨噬细胞、树突状细胞、上皮细胞和角化细胞细胞,有一个核心作用的抑制细菌生产产品和促炎细胞因子(20.- - - - - -22]。在牙周炎,促炎细胞因子,如il - 1β,il - 6、引发和TNF -α,似乎是主要的介质,参与牙周组织的破坏。牙周感染的个体显示高浓度的循环炎症标记物,直接与组织破坏和炎症的严重程度相关血清标志物(20.- - - - - -23]。高水平的il - 6和TNF -α,重要的介质从急性慢性炎症,出现在观察牙龈沟液内细胞激素牙周、牙龈组织,非手术牙周治疗后,肿瘤坏死因子水平降低α,il - 1β,并观察il - 6,确认他们的角色在牙周疾病24,25]。在这项研究中,我们模拟了il - 1的炎性微环境β启动的HGF和我们已经评估了香兰素对炎性介质的影响基因表达和生产。我们的研究结果表明,il - 1β影射胶质瘤细胞,香兰素预处理降低表达和促炎介质的生产,如引发、il - 6和TNF -α。牙周疾病的进展可能派生没有和cox - 2信号通路26,27]。在香兰素细胞预处理,我们发现减少伊诺和cox - 2基因表达,没有生产。在一起,这些结果突显出香兰素HGF-inflamed细胞调节炎症反应的能力。票α7受体是一个至关重要的监管机构的“胆碱能抗炎通路”28,29日),在胶质瘤细胞中表达。因此,我们调查如果香兰素的抗炎能力可能与乙酰胆α7表达式。我们的研究结果显示,Vanillin-induced增加乙酰胆α7表达符合减少促炎细胞因子基因表达。考虑到炎症介质驱动结缔组织退化的发病和进展,我们的第二个目标是分析香兰素对伤口愈合的影响(30.- - - - - -32]。香兰素,在我们的伤口愈合的体外模型,加快伤口关闭。此外,il - 1的基因表达β全身的介质(il - 6和TNF -α在挠HGF单层Vanillin-pretreated细胞减少,无显著差异在il - 6、TNF -α观察,引发生产。有趣的是,在机械损坏的il - 1β启动HGF,引发基因表达增加香兰素预处理,作为应对双机械刺激和炎症。事实上,体内和体外的研究报告,引发诱导中性粒细胞招募受损区域,阻止细菌入侵,并促进当地neoangiogenic、细胞增殖、组织reepithelization在人类伤口的地狱33,34]。

il - 1β众所周知,增加cox - 2表达和HGF(前列腺素(PG)生产35- - - - - -37]。在目前的研究中,我们观察到il - 1βupregulation cox - 2表达增加了香兰素(预处理)+ 1β治疗,符合cox - 2在早期和晚期的监管伤口修复的结果(35- - - - - -37]。伊诺表达发生组织损伤后早期,表明这种酶在早期炎症阶段是必要的;事实上,我们的研究结果显示,减少进气阀打开,没有在24小时,当检测到完整的伤口愈合。

5。结论

总的来说,我们的研究结果表明,香兰素可能有用的管理炎性牙周疾病减少促炎介质和自由基的过度生产,以及刺激组织再生和软组织修复的管理。众所周知,抗炎和抗氧化分子添加到口腔卫生产品改善牙周疾病的指标(38,39),减少系统性疾病相关的风险。因此,香兰素可能会用于配方适合口服应用程序作为牙周健康,也非药物剂积分一些疾病的护理管理,如糖尿病患者或艾滋病毒感染,伤口愈合延迟率。

数据可用性

作者确认数据支持这项研究的结果都包含在这篇文章,可以从记者的要求进一步澄清。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

概念是由着力点和智慧;方法是由着力点和J.S.二人主持;调查是由C。E和mit获得;智慧化和M.G.导致了资源的研究;写草稿准备由着力点,S.B.,和R.M.; writing-review and editing was done by K.F., C.S., and M.G.; supervision was done by R.M. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.