文摘

背景。蛛网膜下腔出血(SAH)患者的损害血脑屏障(BBB)可以危及生命。间充质干细胞广泛应用于临床研究由于其多向性的属性。本研究旨在探索bmsc的影响调节星形胶质细胞在BBB长官。方法。建立了射孔的SAH模型血管。bmsc与TSG-6抑制剂转染质粒和cocultured星形胶质细胞。静脉移植治疗大鼠SAH bmsc的利用。我们进行ELISA、神经评分、伊文思蓝染色,没有测量,免疫荧光,BBB通透性、免疫印迹,他染色,尼氏小染色和免疫组织化学评估bmsc星形胶质细胞和BBB的效果。结果。SAH老鼠显示BBB受伤,BBB通透性增加,和大脑组织学损伤。bmsc会分泌TSG-6后激活TNF -α。的影响下TSG-6, NF -κB和MAPK信号通路的星形胶质细胞被抑制了。伊诺的表达减少,而occludin claudin 3, ZO-1表达增加。有害物质的生产和ONOO- - - - - -降低了。炎症因子的水平降低了。星形胶质细胞的凋亡是削弱。TSG-6分泌bmsc可以减轻炎症SAH引起的损伤。BBB通透性的增加大鼠SAH的进一步减少,出血的风险降低。结论。bmsc可以通过分泌调节星形胶质细胞的激活TSG-6保护BBB的体内和体外。

1。介绍

蛛网膜下腔出血(SAH)是一种严重的中风导致无法治愈的结果(1,2]。当长官发生时,立即开始各种病理生理反应。早期脑损伤(EBI)是指直接脑损伤和继发性病理生理反应SAH后72小时内发生,包括增加颅内压和脑血流量减少,以及由此产生的局部脑缺血(3]。这些更改立即导致神经细胞死亡,血脑屏障(BBB)通透性改变,和脑水肿4- - - - - -6]。的基本结构保持正常功能的BBB,胞质粘附蛋白和跨膜蛋白一起形成紧密连接结构。其中,胞质粘附蛋白包括几个亚型zonula occludens-1 (ZO-1) ZO-2, ZO-3,形成紧密连接的基础。跨膜蛋白是由occludin claudin,联接的粘附分子(果酱),和tricellulin7,8]。因此,它可以确定BBB是否被检测胞质粘附蛋白、跨膜蛋白。

星形胶质细胞发挥重要作用在维护BBB的完整性(9]。星形胶质细胞可以产生大量的没有通过诱导一氧化氮合酶(间接宾语)的作用下一些刺激因素。没有结合超氧化物阴离子(O2 -)来产生一个名为过氧亚硝基的代谢物(ONOO- - - - - -)。ONOO- - - - - -不仅是一种有效的生物氧化剂也非常有毒的和破坏性的产品10]。我们以前的工作证实,它可以减少BBB的破坏和脑水肿的程度被抑制脑出血后伊诺和ONOO的生产- - - - - -,但目标是否包括星形胶质细胞不是未知。因为星形胶质细胞可能与ONOO的数量有着密切的关系- - - - - -生产在3神经炎症,骨髓间充质干细胞(bmsc)被用来研究BBB SAH后的保护作用和星形胶质细胞作为研究目标。

bmsc的成体干细胞是一群生物学特性、multidifferentiation潜力,和自我复制11]。最近的文献回顾指出,在SAH的动物实验中,静脉移植的bmsc可以提高SAH动物的神经功能。相关的机制可能与减少神经细胞凋亡,减少炎症,改善脑组织的微观结构。然而,bmsc的具体目标和机制需要进一步研究12]。越来越多的研究证实,旁分泌作用bmsc的治疗中发挥了重要作用。bmsc的旁分泌作用有关的因素包括白介素10 (il - 10),吲哚胺2,3-dioxygenase(吲哚胺2,3-dioxygenase)和肿瘤坏死因素蛋白6 (TNF -α全身的蛋白6 (TSG-6)) (13,14]。TSG-6已成为一个重要的抗炎因子为研究bmsc的旁分泌作用[13,15]。

TSG-6研究的深化,下游信号通路由TSG-6正逐渐由研究人员发现的。崔指出,TSG-6已经影响到下游核转录因子(NF -κBκB)信号通路(14]。此外,相关研究认为,抑制下游NF -κTSG-6 B信号通路是一个重要的方式发挥其生物学特性(16,17]。NF -κB家族包括p65等转录因子,参与细胞凋亡和炎症(18]。作为神经系统的另一个重要途径,增殖蛋白激酶(MAPK)是一组蛋白酶,可以刺激不同的细胞和炎症在调节过程中发挥作用,氧化应激等。19]。MAPK家族包括p38MAPK、物和ERK1/2。其中,p38MAPK和物主要在炎症和细胞凋亡中发挥作用,而ERK1/2在增殖和分化过程中发挥作用(20.]。尽管先前的研究结果支持bmsc可以减轻脑出血后的脑水肿和保护通过TSG-6 BBB,没有相关研究bmsc能否减少BBB破坏通过TSG-6长官。此外,由于星形胶质细胞在神经炎症过程中发挥重要作用和维护BBB的完整性,是否TSG-6调节星形胶质细胞通过相关信号通路的目标需要进一步验证。通过这个课题的研究,我们可以澄清bmsc的作用在调节靶细胞通过TSG-6,提供新思路和依据的bmsc SAH的研究和治疗。

2。结果

2.1。SAH的特征建模

我们建立了大鼠SAH模型观察SAH的病理变化。没有老鼠死于虚假的组(0 8老鼠)。大约13.51%的大鼠SAH组(5)37分为SAH感应后24小时内死亡。观察SAH模型是否成功,我们进行神经行为评分mns的老鼠。图中1(一)虚假的组的得分显著低于SAH组。建模后,大鼠SAH组有走路不稳,肢体偏瘫,可怜的应对外界刺激。随后,两组老鼠的大脑。在图1 (b),我们发现虚假的组大鼠的腹侧表面是光滑的。没有见过血,和大脑的一般结构组织没有明显改变。然而,SAH组大鼠显示明显的血液积聚在颞叶皮层的表面没有明显的变化总脑组织的结构。进一步确定模型是成功的,大脑组织损伤的程度是他(图观察到1 (c))和尼氏小染色(图1 (d))。他染色显示,前额叶和海马组织学损害在SAH组与虚假的组。尼氏小体减少,神经元在前额叶皮层和海马受损SAH组与虚假的组。他和尼氏小染色的结果显示,在这个模型是可靠的和获得的神经功能评分呈正相关的组织学/病理变化SAH的大脑。进一步检查是否BBB的星形胶质细胞因故障而受到影响,免疫组织化学是用来衡量激活星形胶质细胞的标记GFAP +。图1 (e)透露,GFAP + SAH组积极的提高。上述建议SAH模型的成功。主要是表现在BBB的摧毁和星形胶质细胞的激活。

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图1
SAH模型的病理特征。(一)神经分数的定量分析。(b)代表大脑的骗局和SAH组。(c)染色。(d)尼氏小染色。(e)免疫组织化学是用来检测阳性表达激活星形胶质细胞标记GFAP +。 与假组相比, 。上面的结果是所有测量数据,表示为 ,和一个未配对 - - - - - -两组之间的测试使用。
2.2。bmsc分泌TSG-6保护激活星形胶质细胞

确定bmsc对星形胶质细胞的影响在SAH模型中,我们进行了一系列的体外实验。在图2(一个),存在被用来衡量TSG-6的表达。这是发现当TNF -α刺激BMSC激活,TSG-6的表达增加。研究是否TSG-6表达激活星形胶质细胞的影响,我们沉默TSG-6 BMSC细胞的基因。图2 (b)表明TSG-6基因沉默后,TSG-6的表达水平降低了。它提供了直接证据,沉默TSG-6已成功构建。数据2 (c)和2 (d)数据显示,TNF - bmsc刺激后α分泌TSG-6, TSG-6促进星形胶质细胞occludin, claudin 3和ZO-1 mRNA和蛋白表达水平,虽然伊诺是减少。在沉默中TSG-6 bmsc,星形胶质细胞的表达水平occludin, claudin 3, ZO-1减少但伊诺是增加。图2 (e)表明bmsc刺激TNF -α分泌TSG-6减少星形胶质细胞凋亡而沉默的TSG-6 BMSC促进星形胶质细胞凋亡。图2 (f)显示bmsc刺激TNF -α分泌TSG-6增加的入侵能力后星形胶质细胞星形胶质细胞的侵袭能力降低时沉默的bmsc TSG-6。总的来说,这些发现表明TSG-6分泌bmsc可能增加在星形胶质细胞紧密连接蛋白的生产,增加入侵,减少细胞凋亡。

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图2
TSG-6 bmsc在激活星形胶质细胞分泌的影响。(一)中存在利用检测TSG-6 BMSC细胞中表达。(b)的免疫印迹分析TSG-6 BMSC细胞的表达。(c)中存在利用测试occludin的表达水平,claudin 3 ZO-1,伊诺激活星形胶质细胞。(d)免疫印迹是用来测量occludin的蛋白表达水平,claudin 3 ZO-1,伊诺在星形胶质细胞。(e) TUNEL分析被用来检测星形胶质细胞凋亡(规模酒吧,100μ米)。(f)入侵了星形胶质细胞transwell试验(规模酒吧,50μ米)。bmsc(中包含bmsc (TNF -α激活集团)), (介质包含bmsc(数控 激活组)和 (包含bmsc介质( 激活组)。 与对照组相比, ; 相比之下, 组, 。上述实验结果都是测量数据。数据被表示为 。单向方差分析和图基的测试仅用于多个组之间的数据比较。
2.3。bmsc NF -监管κ通过TSG-6 B / MAPK信号通路

我们进一步研究了NF - TSG-6是否激活κ在星形胶质细胞B / MAPK通路。我们使用中存在的表达和免疫印迹测量NF -κB和MAPK信号通路基因。结果在图的数据3显示,与对照组相比,NF - mrna的表达相关κ信号通路(NF - BκB)和MAPK信号通路(ERK1 p38,物,ERK2)在TNF -α组被抑制。相比 ,NF -的表达κ信号通路(NF - BκB)和MAPK信号通路(ERK1 p38,物,ERK2) 组显著增加。上述结果表明,TSG-6分泌bmsc可以抑制NF -κ在星形胶质细胞B / MAPK信号通路。

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图3
TSG-6由bmsc分泌抑制NF -的激活κB / MAPK信号通路。(a)中存在测量NF -的表达κB / MAPK信号通路。(b)免疫印迹观察NF -的蛋白表达κB / MAPK信号通路。bmsc(中包含bmsc (TNF -α激活集团)), (介质包含bmsc(数控 激活组)和 (包含bmsc介质( 激活组)。 与对照组相比, ; 相比 组, 。上述实验结果都是测量数据。数据被表示为 。单向方差分析和图基的测试仅用于多个组之间的数据比较。
2.4。星形胶质细胞被抑制NF -保护κB

上述实验结果表明TSG-6分泌bmsc的表达可以抑制NF -κB信号通路。我们进一步研究了NF -的影响κB信号通路激活星形胶质细胞。首先,我们使用了NF -κNF - B受体阻滞剂沉默的表达式κ在星形胶质细胞。图4(一)表明NF -的表达κB在si-NF -κB组减少,表明si-NF -κB组成功构建。数据的数据4 (b)- - - - - -4 (d)显示与si-NC组相比,水平的相关炎症因子il - 6、il - 1β干扰素-γTGF -β1,伊诺si-NF -κB组降低。这表明si-NF -κB减少星形胶质细胞的炎症反应。图4 (e)表明si-NF -κB增加occludin claudin 3, ZO-1星形胶质细胞中表达。我们进一步发现星形胶质细胞凋亡。图4 (e)表明si-NF -κB抑制星形胶质细胞凋亡。因此,抑制NF -κB信号通路是一个有效的方法保护星形胶质细胞免受损伤。我们推测TSG-6分泌bmsc可以保护激活星形胶质细胞通过抑制NF -的表达κB信号通路。

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星形胶质细胞被抑制NF -保护κb (a)中存在测试NF -的表达κb . (b) ELISA是用来测量干扰素-的内容γ、il - 6、il - 1β,TGF -β1在星形胶质细胞。(c)中存在检测伊诺的表达。(d)测量免疫印迹伊诺的蛋白表达。(e)的荧光强度claudin 3 occludin, ZO-1检测到免疫荧光(规模酒吧,100μ米)。(f)流式细胞仪是用来测量星形胶质细胞的凋亡率。 与si-NC组相比, 。上述实验结果都是测量数据。数据表示为 。未配对的 - - - - - -两组之间的测试使用。
2.5。抑制星形胶质细胞MAPK信号通路的保护

学习在星形胶质细胞MAPK信号通路的影响,我们主要使用MAPK阻滞剂沉默MAPK在星形胶质细胞的表达。的结果图5(一个)透露,p38的表达减少,表明si-MAPK集团已成功构建。数据5 (b)- - - - - -5 (f)表明,抑制MAPK的表情后,相关炎症因子的水平il - 6、il - 1β干扰素-γTGF -β1,进气阀打开由星形胶质细胞分泌减少。此外,occludin的荧光强度,claudin 3, ZO-1增加。最后,流式细胞术结果表明,星形胶质细胞凋亡减少si-MAPK组相比si-NC组。简而言之,抑制MAPK信号通路也可以保护激活星形胶质细胞。我们怀疑TSG-6分泌bmsc可以保护星形胶质细胞通过抑制MAPK信号通路的表达。

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抑制MAPK信号通路的调节星形胶质细胞。(a)中存在检测p38的表达。(b) ELISA测定干扰素-的内容γ,il - 1β、il - 6和TGF -β1。(c)中存在检查伊诺的表达。(d)免疫印迹检测伊诺的蛋白表达。(e)免疫荧光检测occludin的claudin 3, ZO-1荧光强度(规模酒吧,100μ米)。(f)流式细胞仪是用来测量星形胶质细胞的凋亡率。 与si-NC组相比, 。上述实验结果都是测量数据。数据表示为 。未配对的 - - - - - -两组之间的测试使用。
2.6。bmsc调控星形胶质细胞通过TSG-6 SAH后保护BBB

进一步研究次数是否能保护BBB,我们进行了动物实验研究。图6(一)检查SAH模型导致TSG-6降低,增加伊诺脑组织中表达,而激活bmsc提升TSG-6和伊诺蛋白表达减少。沉默的TSG-6 bmsc可降低TSG-6和促进伊诺蛋白表达。相比 集团p38的表达、物p-JNK,兵,p-ERK p65, p-p65是增加的 组。图中的数据6 (b)表明,抑制TSG-6能促进与NF -相关基因的表达κB / MAPK信号通路。相比 组,干扰素-的水平γ、il - 6、il - 1β,TGF -β1 组增加。它被发现在图6 (c)星形胶质细胞的炎症反应增强后阻塞TSG-6在bmsc的表达。在图6 (d),伊文思蓝染色法被用来测量BBB的渗透性。结果证明,沉默的TSG-6 bmsc可以增强BBB的渗透性,造成有害物质进入大脑的神经元组织。数据6 (e)和6 (f)发现TSG-6分泌bmsc可减少没有和ONOO的形成- - - - - -在大鼠SAH BBB破坏的直接结果。在图6 (g)免疫荧光结果显示,TSG-6由bmsc分泌表达下调GFAP的表达和伊诺SAH老鼠,而GFAP的表达和伊诺被调节的 组相比, 组。以上表明TSG-6分泌bmsc可以抑制炎症和降低BBB破坏大鼠SAH NF -κB / MAPK信号通路。

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bmsc调节星形胶质细胞通过TSG-6治疗大鼠SAH。(a)的表达TSG-6和伊诺测量中存在和免疫印迹。(b)中存在和免疫印迹是用来测量NF -的表达水平κB / MAPK信号通路。(c) ELISA用于测试激活星形胶质细胞分泌的炎症因子的水平。(d)伊文思蓝发现BBB通透性的变化。(e)没有荧光探针分析的数量生产单元中。ONOO (f)的决心- - - - - -在大鼠血清ELISA。(g)双重免疫荧光染色法是用来测量伊诺的表达(红色)和GAFP(绿色)。bmsc(中包含bmsc (TNF -α激活集团)), (介质包含bmsc(数控 激活组)和 (包含bmsc介质( 激活组)。 与假组相比, ; 相比 组, 。上述实验结果都是测量数据。数据表示为 。单向方差分析和图基的测试被用于多个组之间的数据比较。

3所示。材料和方法

3.1。动物

我们购买了45 SPF(特定的无菌)SD大鼠的体重 和6 - 8周大湖南松弛Jingda实验动物有限公司处置动物在实验过程中遵守“指导意见处理实验动物”科技部颁发的2006年。八人被选为虚假的集团,其余37被用来构建SAH模型。

3.2。SAH模型

建立了射孔的SAH模型血管。1%的动物都是由腹腔内注射麻醉( )戊巴比妥钠(35μ毫克/公斤)。右颈总动脉分叉的暴露出来。颈外动脉的分离。用血管钳血流受阻。冲3 - 0单链尼龙缝线插入颈内动脉分叉的颈总动脉导致动脉破裂18 - 20毫米。缝合是保持约15秒,然后退出。然后,伤口被关闭。虚假的过程组作为SAH的群体,除了血管没有刺穿。37动物被用于建模,其中5死了。建模成功率被成功的动物数量计算建模/动物的总数(建模成功 )。

3.3。细胞培养

人类骨髓间充质干细胞(hBMSCs)和星形胶质细胞从HonorGene购买(长沙Aibiwei生物技术有限公司)。 星形胶质细胞激活了/好脂多糖(LPS)和放置在较低的transwell隔间。bmsc在人类间充质干细胞培养的培养基(Cyagen生物科学有限公司、广州、中国)在37°C和5%的公司2。当第三代BMSC融合达到了80%,接种于24-well文化板块 细胞/好,2毫升的完全培养基被添加到每个。bmsc TNF -激活α。小干扰rna和数控siRNA TSG-6冻在冰上。两个离心管拍摄,每个管增加了95μL无血清培养基,然后,100μg TSG-6 siRNA和5μL唇2000添加到离心管,分别。数控siRNA也是以这种方式添加到相应的离心管。TSG-6核和小干扰rna转染到数控bmsc激活TNF -α。在37°C细胞被培养24小时。随后,上述治疗方法之一的bmsc被放置在上层舱和cocultured星形胶质细胞在37°C 24 h。根据成分包含在参议院的媒介,他们被分成控制(medium-control组),bmsc(中包含bmsc (TNF -α激活集团)), (介质包含bmsc(数控 激活组)和 (包含bmsc介质( 激活组)。

3.4。综合干预体内

细胞(包括bmsc, ,和 )在相同的治疗的细胞实验暂停1毫升的PBS成功诱导SAH后1小时内,然后通过股静脉缓慢注射5分钟。针是退出。股静脉结扎。SAH组大鼠静脉注射等量的PBS没有伴。然后,32成功模仿动物被分成5组,每组8:SAH集团企业综合集团, 组和 组。

3.5。神经损伤的评估

修改后的神经严重程度评分(mns)包括一系列全面的测试来评估电机(肌肉状态,异常运动)、感官(视觉、触觉和本体感受的),和反射能力。一个点被授予为一个特定的任务或反射不执行测试。因此,得分越高,越严重损伤正常得分:0;最高得分:18)。建模成功后,mns评估来确定损伤的严重程度。

3.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)

标本后在室温下放置2小时,他们在2 - 8°C 1000 g离心15分钟的上层清液被测试。这个工具包是如下:il - 1β(中国、CSB-E04640R)、il - 6(中国,CSB-E08055R)、干扰素-γ(中国,CSB-E04579R), TGF -β1(中国,CSB-E04727R)从Cusabio生物科技有限公司购买ONOO- - - - - -(中国,JL21035)从Jianglaibio有限公司购买的辣根peroxidase-labeled卵白素100解决方案μL是添加到每个和孵化37°C 1小时。底物溶液(90μL)被添加到每个在秩序,和颜色是在37°C开发的15 - 30分钟。50μL终止的解决方案是添加到每个在序列终止反应。反应结束后5分钟内,光密度(OD值)的测量顺序下酶标准仪器(中国,mb - 530)的波长450 nm。

3.7。实时定量PCR(存在)

组织和细胞样本的总RNA提取使用试剂盒工具包(15596026,热,美国)。在下一步中,提取的总RNA是相对地转录成cDNA根据指令的逆转录工具包(CWBIO CW2569,中国)。随后,实时PCR进行荧光定量RCP仪器(美国热QuantStudio 1)使用一个UltraSYBR混合物(CWBIO CW2601,中国)。是内部参考β肌动蛋白,引物序列表中找到1。用2μg互补dna为模板,相对定量方法( 方法)是用来计算相对目标基因的转录水平: 实验组−△对照组, 。实验重复三次。

表1
引物序列。
3.8。免疫印迹

里帕工具包(中国Solarbio R0010)被用来提取总蛋白的组织和细胞样本。BCA法用于确定蛋白浓度。蛋白质分离10% sds - page电泳,electrotransfer转移到NC膜。膜被5%的脱脂牛奶2 h在室温和初级抗体孵育过夜在4°C。为初级抗体,我们使用兔子anti-TSG-6 (0.1μg / mL, ab204049 Abcam),兔子anti-iNOS(1: 500年,ab3523 Abcam),兔子anti-ZO-1(1: 4000年,21773 - 1 - ap, Proteintech),兔子anti-occludin(1: 1000年,27260 - 1 - ap, Proteintech),兔子anti-claudin 3(1: 500年,16456 - 1 - ap, Proteintech),兔子anti-p38(1: 1000年,14064 - 1 - ap, Proteintech),兔子anti-p-p38(1: 1000年,ab4822 Abcam),兔子anti-JNK(1: 1000年,ab179461 Abcam),兔子anti-p-JNK(1: 5000年,ab124956 Abcam),兔子anti-p65(1: 800年,10745 - 1 - ap, Proteintech),兔子anti-p-p65(1: 800年,ab97726 Abcam),兔子anti-ERK(1: 2000年,16443 - 1 - ap, Proteintech),兔子anti-p-ERK(1: 5000年,ab201015 Abcam)和兔anti-GAPDH(1: 5000年,10494 - 1 - ap, Proteintech)。膜与TBST冲洗3次每次10分钟,然后孵化与合山羊anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 5000年,SA00001-2 Proteintech,美国)。膜是沉浸在超级ECL + (k - 12045 d50 Advansta,美国)发光发展。GAPDH是作为内部参考。分析了目标乐队ImageJ软件。

3.9。Transwell化验

MSC细胞在DMEM培养含有10%与1%的边后卫双重阻力和洛克在37°C,孵化器有限公司5%2和饱和湿度。对数生长细胞被置于six-well板和治疗组在坚持墙上。基底膜基质与100年被稀释μL冷,血清MEM培养基的每个好,最终的浓度是200μg /。基底膜基质在37°C 30分钟孵化,上层清液吸出。500年μL 10%的完全培养基的边后卫被在37°C下舱48 h。参议院就取出来放到一个新的包含PBS。参议院和PBS洗3次,和参议院细胞用棉球擦拭干净。细胞与4%多聚甲醛固定20分钟。0.1%结晶紫染色5分钟,洗了5次。这部电影给了幻灯片,在显微镜下拍摄照片。室了,浸泡在10%醋酸脱色。在550 nm,吸光度值(OD)是由一个微型板块的读者。

3.10。流式细胞术

PBS的细胞被洗了两次,在2000转离心5分钟。关于 细胞被收集。500年μL绑定缓冲除了暂停细胞。后膜联蛋白V-FITC (5μL)补充说,5μ碘化L propidium添加并混合在一起。在室温下反应持续了5 - 15分钟,远离光线。结果指出,流式细胞仪探测到在1 h。

3.11。TUNEL

细胞爬片与4%多聚甲醛固定30分钟。蛋白酶K工作流体。100年μl 缓冲区被添加到每个样品在室温下和孵化为10 - 30分钟。50μL TdT)孵化缓冲区被加入到细胞爬片。DAPI (Wellbio中国)工作流体染色在37°C 10分钟。细胞爬片与PBS 5分钟洗3次。样本存储在黑暗和荧光显微镜下观察(Motic BA410T,中国)。

3.12。免疫组织化学(包含IHC)

片被烤在60°C 12 h。片是脱蜡和加热抗原修复。适当的稀释主要抗体GFAP(556330年,BD Pharmingen)一夜之间被添加在4°C。50 - 100μL anti-mouse IgG-HRP (Bio-Rad大力神,CA)添加和孵化37°C为30分钟,然后用PBS洗5分钟3次。Diaminobenzidine(民建联、ZSGB-BIO、中国)被用来发色体。样品被放置在二甲苯10分钟2次。中性胶密封,在显微镜下执行。

3.13。免疫荧光(如果)

我们取出细胞爬片与PBS洗2 - 3次。Triton添加0.3% 37°C 30分钟。片被烤在60°C 12 h。片是脱蜡和加热抗原修复。片是孵化5% BSA在37°C为60分钟。主要抗体claudin 3 (1: 50, 16456 - 1 - ap, Proteintech), occludin (1: 50, 27260 - 1 - ap, Proteintech),和ZO-1(1: 200年,21773 - 1 - ap, Proteintech)被添加到细胞爬片在4°C。50 - 100μL anti-rabbit IgG-labeled荧光抗体(1:200年,SA00013-4 Proteintech)被添加到细胞爬片和孵化在37°C的90分钟。主要抗体GFAP(1: 1000年,ab279290 Proteintech)和间接宾语(1:500年,ab3523 Proteintech)被添加到片在一夜之间在4°C。50 - 100μL anti-mouse(1: 200年,SA00013-5 Proteintech)和兔(1:200年,SA00013-4 Proteintech) IgG-labeled荧光抗体被添加到细胞爬片和孵化90分钟的37°C。DAPI解决方案用于染色细胞核在37°C 10分钟,和PBS是用来洗细胞爬片5分钟3次。缓冲甘油用于密封细胞爬片。样本存储在黑暗和荧光显微镜下观察(Motic BA210T,中国)。

3.14。伊文思蓝染料化验

老鼠注射静脉注射8毫升/公斤0.6%氟化钠2小时后成功的建模。30分钟后,老鼠与10毫升生理盐水灌注。大脑半球均质30%三氯乙酸和离心机在10000 g 5分钟。从上层清液,测定了氟化钠的浓度下的荧光计激励在460 nm和发射在515 nm)通过标准曲线。渗透率比计算除以氟化钠(pg / mg)研究的情况下/氟化钠正常的控制。

3.15。测定细胞内没有生产

细胞与稀释resuspended DAF-FM DA浓度 。细胞在37°C细胞孵化器孵化了20分钟,每5分钟和混合颠倒使探针完全接触的细胞。这些细胞被洗了三次与PBS (pH值7.4)充分去除DAF-FM哒,不进入细胞。荧光强度测量的流量计在495 nm激发波长和波长515 nm发射。

3.16。他染色

脑组织固定用4%多聚甲醛在室温下24 h。样本在梯度乙醇脱水,嵌入到一个蜡块。每个样本都切成2 - 3μ片。片被烤在62°C 2 - 6 h,然后脱蜡、水化。细胞质是沾有不同程度的红色或粉色,蓝色细胞核形成了鲜明的对比。切片在显微镜下观察(BA210T、Motic、新加坡)。

3.17。尼氏小染色

脑组织固定用4%多聚甲醛在室温下24 h。样本在梯度乙醇脱水,嵌入到一个蜡块。每个样本都切成2 - 3μ片。片被烤在62°C 2 - 6 h,然后脱蜡、水化。片添加尼氏小染色溶液和孵化为5分钟。片用尼氏小分化溶液添加到核和粒子都清楚。切片在显微镜下观察(BA210T、Motic、新加坡)。

3.18。统计分析

所有数据分析GraphPad Prism 8.0软件(GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)。未配对的 - - - - - -测试两组之间使用符合正态分布。比较在多个组由单向方差分析(方差分析),其次是图基的事后考验。的值 被认为是具有统计学意义。

4所示。讨论

本研究的目的是确定是否TSG-6分泌bmsc可以保护BBB SAH后通过调节NF -κB / MAPK信号通路。为此,我们讨论了在体外和体内的水平。体外实验表明,TSG-6由bmsc分泌调节ZO-1的表达,occludin, claudin 3,表达下调伊诺的表达和细胞凋亡,促进细胞入侵,抑制NF -κ在星形胶质细胞B / MAPK信号通路。在星形胶质细胞沉默TSG-6 bmsc取消这个效果。进一步抑制NF -κB / MAPK信号通路表明,星形胶质细胞的炎症反应减少,ZO-1的表情,occludin, claudin 3调节和细胞凋亡抑制。此外,体内研究证实,bmsc移植可以有效地通过分泌TSG-6保护BBB。

目前,早期脑损伤(EBI)和延迟脑缺血(DCI)是SAH的主要表现在两个阶段。神经保护和antivasospasm方向是研究最多的许多研究[21,22]。颅内动脉瘤破裂后,SAH通常是灾难性的,因为没有有效治疗合并脑损伤(23]。在大多数国家,nimodipine是唯一批准药物治疗SAH的因为没有其他干预工作已被证明24]。因此,迫切需要研究潜在的分子靶点SAH优化治疗效果。近年来,研究BMSC移植很热。前任验证了有效性和安全性综合治疗创伤性脑损伤的老鼠(25]。我们有针对性的星形胶质细胞,BBB密切相关,治疗SAH bmsc的静脉移植。血管内穿孔的SAH模型确实是无法复制的。近年来,血管内穿孔模型复制的早期病理生理学长官。它已被广泛用于研究SAH后早期脑损伤(26- - - - - -29日]。血管内穿孔模型已经提出了临床试验(30.]。因此,在这个项目中,我们构造了一个血管内穿孔鼠模型来研究bmsc对星形胶质细胞的影响,通过分泌TSG-6 BBB SAH后。后bmsc激活TNF -α是通过静脉移植,bmsc分泌大量TSG-6。我们发现TSG-6可以调节星形胶质细胞的激活,保护BBB,有效治疗SAH。

BBB破坏和神经炎症的主要病理改变是脑损伤,导致预后不良SAH后(31日]。研究已经证实,TSG-6是一种强大的抗炎因子。其强大的抗炎作用主要包括蛋白酶的抑制炎症网络,绑定到相应的疏水酸碎片和阻塞的促炎效应和抑制中性粒细胞迁移到炎症的中心(32]。研究还建立了一个老鼠脑外伤模型确认大量的旁分泌TSG-6 bmsc可以改善静脉移植后大鼠的神经功能障碍(33]。以前的研究主要表明,外生TSG-6消炎展出。我们在此基础上进行了实验,结果是一致的。我们的研究的重点放在针对TSG-6调节星形胶质细胞在大鼠SAH模型。我们的数据表明,TSG-6在脑组织的表达是SAH后下降。TSG-6 bmsc提升ZO-1的表达分泌,occludin, claudin 3在星形胶质细胞,减少伊诺的表达和细胞凋亡水平,提升细胞入侵,保护BBB,减轻早期脑损伤。星形胶质细胞损伤和在某种程度上加重了脑损伤后早期TSG-6 bmsc沉默。这些结果表明,bmsc的神经保护作用是通过TSG-6星形胶质细胞的表型相关监管易位。但行动的方式还不清楚,这是我们的下一个研究的内容。考虑到有限的预算和空间,我们没有评估neurobehavior BMSC和功能障碍治疗后 在这个项目中。在未来的研究中,我们将进一步提高。有必要表明bmsc进入大脑,他们是否能释放TSG-6 SAH的大脑。它可以进一步证实体内bmsc是否作用于星形胶质细胞在大脑和TSG-6是否分泌bmsc保护BBB SAH后。我们假设bmsc分泌TSG-6 BBB的某种形式的保护。在接下来的项目中,我们将探讨这个猜想通过荧光标记体内和体外。结果需要确认使用TSG-6 KO小鼠内生TSG-6排除的影响。由于资金有限和动物处理设施不足,TSG-6 KO并非用于这项研究排除内生TSG-6干扰。我们将改善在以下研究。这个项目为下面的研究奠定了坚实的基础。

许多重要的分子参与的毁灭BBB通过各种独立或相关信号转导途径。NF -κB是一个关键的转录因子调节各种促炎基因的表达(34]。阐明TSG-6抗炎作用的分子机制,我们首先对NF -评估其影响κB的活动。结果显示,TSG-6 bmsc抑制p65的表达和分泌p-p65 LPS-activated星形胶质细胞和炎症反应减轻。沉默TSG-6 bmsc了相反的效果。除了NF -κB通路,它也被观察到,MAPK可以调解GFAP的表达和各种星形胶质细胞调控分子在体内和体外35]。MAPK通路可能是由氧化应激引起的,这可能会阻碍经济复苏的BBB。这可能与促炎细胞因子的浓度的增加和介质(IFN -γ、il - 6和il - 1β)。我们的研究结果表明,TSG-6分泌bmsc抑制LPS-activated星形胶质细胞- 38,p-p38,物,p-JNK、ERK和p-ERK水平和减少了炎症反应。沉默TSG-6 bmsc提升- 38的表达,p-p38,物,p-JNK,兵,p-ERK和炎症反应。体内的结果一致的细胞。我们假设TSG-6由bmsc保护BBB和星形胶质细胞分泌抑制NF -κB / MAPK信号通路。为了测试这个猜想,我们进一步抑制NF -κ在星形胶质细胞B / MAPK信号通路。我们发现星形胶质细胞的炎症反应是减少。ZO-1的表情,occludin, claudin 3调节。细胞凋亡抑制。考虑到空间和预算的限制,我们没有执行抑制NF -κB / MAPK信号通路体内观察bmsc移植对大鼠SAH的BBB的影响分泌TSG-6。由于小样本大小,我们没有进行样本量估算的分析,需要进一步改善。在未来的项目中,我们将进一步探索bmsc移植的潜在机制通过分泌TSG-6保护BBB在SAH老鼠。我们也感兴趣的炎症因素是否影响到BBB浓度的方式,和我们进一步研究思想的特殊方式的监管。在未来的研究中,我们将更加注重临床静脉移植治疗SAH的bmsc。

5。结论

总之,我们的数据表明,TSG-6分泌bmsc SAH后可以玩内源性脑保护。体外,我们证明了TSG-6分泌从bmsc可以促使星形胶质细胞通过NF -抗炎κB / MAPK通路。体内,我们表明,综合调控星形胶质细胞的激活通过分泌TSG-6保护BBB SAH后。我们的发现可能提供新思路和依据bmsc在SAH的研究和治疗。

数据可用性

数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

本研究动物实验伦理委员会批准的第一附属医院南昌大学和南昌大学第二附属医院进行了严格按照美国国立卫生研究院的实验动物保健和使用指南。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

缕广域网进行实验,分析了数据,并写了初稿;分钟的歌,荀谢,甄,紫云高,吴,鲁伊·黄进行实验;分钟陈指导实验、审查和编辑了手稿。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81760224)和青年基金会南昌大学第二附属医院(2019 ynqn12014)。