文摘

肥厚性疤痕(高温超导)是一个复杂的病理过程诱导主要由烧伤和创伤,异常增生的成纤维细胞和成纤维细胞的变换myofibroblasts。PAPPA-AS1,差异表达长非编码RNA (lncRNA)高温超导组织,吸引了我们的利益在其潜在作用和机制在高温超导的发展过程。在目前的研究中,监管效果lncRNA PAPPA-AS1 toll样受体4 (TLR4)信号通路,以及分子机制的研究。利用生物信息学分析屏幕lncRNAs在高温超导组织中表达的差异。PAPPA-AS1显著调节高温超导组织和肥厚性瘢痕成纤维细胞(HTsFb)细胞。TLR4的表达水平,MyD88 TGF -β1,胶原蛋白,胶原蛋白三世αsma在HTsFb细胞大大升高。被推倒PAPPA-AS1 HTsFb细胞的增殖,TLR4、TGF -β1信号通路和纤维化标志物的表达在HTsFb细胞和高温超导组织被抑制。这是伴随着缓解高温超导组织病理状态,由cotransfecting显著逆转pcDNA3.1-TLR4向量。之间的正相关和交互观察PAPPA-AS1 TAF15 TAF15之间和TLR4的启动子,分别。总之,lncRNA PAPPA-AS1可能诱导高温超导的发展,移植TLR4通过与TAF15交互。

1。介绍

肥厚性疤痕(高温超导)烧伤或创伤的并发症,主要临床特征与当地发红,瘙痒疼痛,增生变得困难,当地的挛缩,关节运动障碍,甚至多次断裂或癌化1,2]。不仅正常生理功能和外观,而且心理的病人明显受到高温超导的影响,导致受损的社会互动和通常被认为是一个公共卫生问题。高温超导的病理特征是成纤维细胞的异常增殖,myofibroblasts的变换成纤维细胞,细胞外基质(ECM)的过度积累(3,4]。虽然提出了多种假说声称高温超导的发病机制,病理高温超导的机理仍然未知。具有重要意义,探索可能的分子机制基本高温超导高温超导的临床治疗。

表观遗传学是生物学研究方法调查表型的变化,不是根植于DNA序列,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑,非编码RNA (5]。lncRNAs长度大于200核苷酸编码rna,最初被视为“噪音”在没有生物功能基因组转录。据报道,然而,近年来,lncRNAs参与多种细胞生物过程,如表观遗传,转录,转录后的调控基因表达,X染色体的沉默,转录的激活和核传输(6- - - - - -8]。累积证据建议lncRNA的重要功能的过程和发展高温超导和纤维化9- - - - - -11]。在我们的初步实验,我们发现lncRNA PAPPA-AS1是高温超导的差异表达组织和正常皮肤组织基于生物信息学分析。lncRNA PAPPA-AS1讨论的是一个只有很少研究lncRNA腺病毒感染(12],胎盘percreta [13),和骨质疏松症(14在其属性],非常有限的信息。它吸引了我们感兴趣的潜在作用和机制发展和高温超导的过程。

toll样受体(通常)是位于细胞膜跨膜蛋白,它承认其为病原体保守的分子模式(pamp)。它包括脂多糖(LPS),细菌脂蛋白,CpG DNA, RNA病毒double-strain,透明质酸,热休克蛋白(休克),和S100蛋白(15]。多个内部和外部的物质,如紫杉醇,fibulin,透明质酸,低聚糖,HSP60, HSP70、纤维蛋白原、高机动组框1 (HMGB1),可以通过TLR4被认可,使TLR4承诺目标领域的抗病毒、抗菌等,组织维修(16- - - - - -18]。塞其报道的假受体转化生长因子(TGF -β)、骨形态形成蛋白、苯丙酸诺龙膜结合抑制剂(小鹿斑比)可以通过刺激TLR4表达下调对肝星状细胞的膜,进而激活TGF -β1信号通路,导致肝纤维化(19]。

受伤的皮肤组织和肺组织的硬皮病患者的异常表达TLR4 Smad信号通路激活成纤维细胞,成纤维细胞的敏感性增强,TGF -β1,加速胶原蛋白的合成,调节多个基因的表达参与组织的重构和细胞外基质内稳态20.]。最近,据报道,TLR4的表达水平相对较高的高温超导组织比正常皮肤组织(21]。高温超导的发展和过程可以加速通过激活TLR4通过上调TGF -β1、结缔组织生长因子、胶原蛋白I,胶原蛋白3 (22- - - - - -24),符合数据实现在我们之前的研究25,26]。然而,上游的TLR4在高温超导的发病机制仍然未知。

在我们的初步实验,我们发现PAPPA-AS1可以结合TLR4在高温超导组织,进一步鼓励我们去探索PAPPA-AS1的角色和作用及其可能的TLR4在高温超导的发展目标。在目前的研究中,差异表达lncRNA高温超导的组织和正常皮肤组织将筛选和PAPPA-AS1的潜在生物功能的开发和过程将探索高温超导调查PAPPA-AS1和TLR4之间的相关性。

2。材料和方法

2.1。生物信息学分析高温超导组织和正常皮肤组织

lncRNA和mRNA表达的数据从基因表达获得综合数据库存储库(GEO),公开的基因组学数据库的国家生物技术信息中心(NCBI)。数据集GSE151153 3高温超导样品和正常样本。数据集GSE158155有24个高温超导样品和4正常样本。数据集GSE151153 RMA和数据集GSE158155标准化的算法使用limma包 分别计算环境。接下来,微分分析( ,调整 值< 0.05)各自被确定。火山的地图显示。相关性分析coexpression差异表达模式lncRNA信使rna是由pheatmap包,和一个热地图了。基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)浓缩的差异表达mRNA分析GSE158155 clusterProfiler的使用功能 ,和重要途径,分别调整 值< 0.05)。

2.2。动物、细胞和治疗

48 BALB / c裸小鼠(每6周大,20 g)随机分为6组,每组半男半女。老鼠从北京购买重要河流实验动物技术有限公司环境温度保持在26°C,和相对湿度保持在50% - -60%。所有的老鼠都自由水和食物摄入。正常人类皮肤成纤维细胞(NsFb)获得武汉大学细胞库,贝利和人类HTsFb细胞是购自上海生物科技有限公司他们孵化完成的DMEM培养基中含10%胎牛血清(的边后卫)37°C公司为5%2。

2.3。转染

HTsFb细胞收集和孵化6-well盘子。短发卡rna(成分)对lncRNA PAPPA-AS1 (sh-PAPPA-AS1 # 1和sh-PAPPA-AS1 # 2)利用减少PAPPA-AS1。相应的消极控制sh-NC (sh-NC)。的表达水平lncRNA PAPPA-AS1被提升,使转染pcDNA3.1-PAPPA-AS1向量。PcDNA3.1-NC作为消极的控制。TLR4是调节通过使转染pcDNA3.1-TLR4向量(2.5μg),消极的控制两个超表达质粒是pcDNA3.1-NC。TAF15被使转染表达下调sh-TAF15和调节与over-TAF15使转染。消极控制sh-NC over-NC,分别。所有的向量(2.5μg)转染入HTsFb细胞伴随着lipofectamine 3000 (5μL,表达载体、钙、美国),其次是在37°C和5%收获有限公司2经过48小时的孵化。所有的质粒被HonorGene合成(长沙,中国)。

2.4。慢病毒转染

Sh-NC sh-PAPPA-AS1 # 1, sh-PAPPA-AS1 # 2, pcDNA3.1-NC, pcDNA3.1-TLR4插入向量pLVX-IRES-tdTomato慢病毒。质粒构建和包装质粒cotransfected成HTsFb细胞。病毒粒子被转染后48小时超速离心法收获。最后,准备病毒粒子被注入到老鼠。

2.5。实时定量PCR(存在)

在实验结束时,收集不同治疗组的细胞和组织中提取总RNA,试剂盒试剂(热费希尔,没有。15596026)。随后,2μL HiFiScript cDNA合成装备的总RNA (CWbiotech,没有。CW2569)被用来合成互补。PAPPA-AS1的引物,GAPDH U6, TAF15, TLR4、β肌动蛋白是由使用Primer5软件设计后在NCBI搜索目标基因的信使rna序列。中存在的引物是列在表中1:

表1
引物中存在的基因。

我们使用UltraSYBR混合物(CWbiotech,没有。CW2601)存在,根据制造商的指示,在95°C 10分钟和40周期在95°C 15秒和60°C,持续30秒。 方法被用来比较基因的相对表达。

2.6。免疫印迹分析

收集细胞和细胞溶解里帕裂解缓冲(细胞信号技术,波士顿,美国)。15% sds - page是用于分离蛋白质。随后,分离出蛋白质转移到PVDF膜(美国波士顿细胞信号技术),半干的转移。5 - 10% BSA的解决方案是添加和孵出1 - 2 h。然后,膜与初级抗体对TLR4、孵化MyD88,胶原蛋白,胶原蛋白三世,TGF -β,αsma,或β肌动蛋白(Abcam 1: 1000年,马萨诸塞州,美国)在25°C 2 h。清洗后,辣根peroxidase-conjugated二级抗体(Abcam 1: 3000年,马萨诸塞州,美国)被用来孵化与膜25°C。一到两个小时后,屁股被孵化与ECL试剂(英国Amersham)和暴露在Amersham成像仪600 (GE)。

2.7。亚细胞分离试验

我们提取和纯化细胞的细胞质和核rna通过巴黎™工具(英杰公司)根据制造商的指示。PCR用于检测RNA在细胞质和细胞核的内容。U6被用作核RNA标记和GAPDH可溶性细胞质标记。CT值的数量是指周期当每个反应管的荧光信号到达设定阈值。我们使用了 价值衡量PAPPA-AS1的内容;越高 价值,PAPPA-AS1含量越低。

2.8。荧光原位杂交(FISH)测定

鱼试验用于检测PAPPA-AS1本地化的细胞(如前所述)(27]。PBS是用来洗细胞生长的幻灯片。4%多聚甲醛用于修复幻灯片。共焦显微镜捕获的图像。

2.9。高温超导裸小鼠模型的建立

高温超导组织获得临床高温超导自初始损伤患者至少6个月。多余的皮下脂肪被从人类高温超导组织,被切成紧随其后 幻灯片。裸体小鼠吸入了3%异氟烷(tsbiochem,没有。通过鼻锥,T19651)麻醉和 切口的鼠标剪了,其次是人类高温超导组织移植到受伤的部分和包装。缝合了15天时间均与坏死组织高温超导的老鼠被排除在实验。所有的老鼠被静脉注射巴比妥酸盐150毫克/公斤。死亡是由观察心跳和呼吸。这个实验已经认可了中南大学湘雅医院动物实验伦理委员会(没有。2019 sydw0009),中南大学湘雅医院医学伦理委员会(没有。202004121)。

2.10。免疫荧光染色(如果)

简单,建模后,小鼠灌注冷PBS,然后注射4%的福尔马林24小时。孤立的高温超导组织与4%福尔马林浸泡在4°C,紧随其后的是使用30%蔗糖脱水为7天。随后,组织被安装在10月,保存在冰箱里。4%多聚甲醛用于修复细胞生长的幻灯片。主要抗体兔子anti-collagen我anti-collagen三世,或反αsma(1: 200)被用来孵化与细胞或片由cryosections 10μ米厚度。二次抗体共轭FITC和DAPI(核标志,蓝色)培养荧光染色。用荧光显微镜拍摄的照片。

2.11。他走时染色

高温超导组织分离得到每只动物的网站受伤,随后被PBS洗几个小时。脱水后用70%、80%、和90%的乙醇溶液先后组织孵化了平等的乙醇和二甲苯的质量。被孵化15分钟后,相同质量的二甲苯用于混合15分钟的组织。步骤是重复,直到组织看起来透明。然后,样本嵌入在石蜡,切片,苏木精和伊红染色。这些照片是被一个倒置显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。

2.12。细胞生存能力分析

细胞MTT试验确定可行性。这些细胞被收集和孵化96 -孔板包含DMEM培养基为24小时,之后用新准备通过改变培养基中含有MTT解决方案孵化2小时37°C。删除介质后,MTT的解决方案被DMSO溶液溶解在37°C 15分钟;在490纳米的吸光度检测根据先前描述的协议(28]。每组的OD值记录来评估每组细胞的可行性。

2.13。染色质免疫沉淀反应(芯片)化验

TAF15和启动子区域之间的相关性评估TLR4的芯片分析使用一个EZMagna芯片工具包(美国Billerica微孔)。简单地说,这些细胞被孵化1%甲醛10分钟,其次是与125 nM甘氨酸被终止。随后,收集细胞的提取DNA片段长度从200年到1000年,英国石油(bp),其次是在4°C特定抗体孵育过夜。然后,DNA浓缩是通过添加Dynabeads蛋白G(美国沃尔瑟姆热费希尔科学)和孵化2小时。存在是用来检测沉淀DNA,免疫球蛋白是作为一个消极的控制系统中。

2.14。RNA拉试验

细胞与缓冲区包含Tris-HCl细胞溶解,EDTA,氯化钠,NP-40,蛋白酶抑制剂,磷酸酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂。其次是离心分离,上层的收集。生物素标记RNA组合工具包(罗氏、Rotkreuz、瑞士)是用于biotinylate提取RNA,然后在体外转录。随后,DNase我(美国沃尔瑟姆热费希尔科学)和交联葡聚糖G-50快速旋转列(σ,密苏里州,美国)被用来混合标记RNA,这是培养细胞上清液在4°C 2小时。随后,混合物被孵化Dynabeads™MyOne™链霉亲和素T1(美国加州英杰公司)在4°C 1小时。清洗后,sds - page和Coomassie蓝色染色被用来检测蛋白质lncRNA PAPPA-AS1。乐队的蛋白质质/ MS质谱分析进行评估。

2.15。荧光素酶报告实验

TLR4的TAF15疑似结合位点被克隆到萤火虫荧光素酶启动子区域的pGL3向量(美国加州表达载体)。HTsFb细胞的转染质粒和TAF15表示向量(TAF15构造)或消极的控制(空向量),这是coincubated lipofectamine 3000(美国加州英杰公司)根据制造商的协议。孵化后48小时,相对荧光素酶活性被dual-luciferase记者分析评估系统(Promega,麦迪逊,WI)。

2.16。RNA免疫沉淀反应(RIP)测定

TLR4之间的相关性和TAF15验证了使用EZMagna RIP工具(微孔,麻萨诸塞州,美国)根据制造商的指示。短暂,HTsFb细胞细胞溶解在4°C与RIP裂解缓冲半个小时,随后被孵化RIP缓冲区包含磁珠,这是共轭抗体Ago2(美国波士顿中科)或anti-rabbit免疫球蛋白(消极的控制,春秋国旅,波士顿,美国)。沉淀RNA分析RT-qPCR技术和总RNA被作为输入控制。

2.17。统计分析

本研究中的数据都显示为 。GraphPad棱镜8用于数据分析。学生的 - - - - - -测试两组之间使用符合正态分布。比较在多个组由单向方差分析(方差分析),其次是图基的事后考验。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。通过生物信息学分析lncRNA PAPPA-AS1上映

地理数据集被用来屏幕差异表达lncRNA和mRNA在临床高温超导组织和正常皮肤组织。如图1(一),lncRNA PAPPA-AS1调节公然在高温超导组织与正常皮肤组织( , 值< 0.05)。大约464 mrna筛选(图1 (b))。其中,385年和79年mrna表达下调和调节,分别与正常皮肤组织。特别是,TLR4的表达,MyD88和TGF都显著调节和表达不同的倍数是3.26,2.39,2.87 ( 值< 0.05)。前30名的相关调节lncRNAs和相关mRNA如图1 (c)。其中,的表达lncRNA PAPPA-AS1与TLR4显著相关,MyD88, TGF和表达相关性大于0.5。我们选择显然调节mrna进行功能富集分析。去丰富分析的结果表明,该mrna在各种生物过程中发挥了重要作用,包括次生代谢物生物合成的过程中,黑色素生物合成的过程中,黑色素代谢过程,细胞外基质,collagen-containing细胞外基质,黑素体膜,细胞外基质结构组成,细胞外基质的结构成分赋予抗拉强度、和肝素绑定(图1 (d))。KEGG分析的结果提出相关的mrna主要是PI3K-Akt信号通路、蛋白质消化吸收,细胞粘附分子(图1 (e))。因此,我们推测高温超导的发展有关的异常激活lncRNA PAPPA-AS1和TLR4 / MyD88 / TGF信号通路。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图1
通过生物信息学分析lncRNA PAPPA-AS1上映。(一)火山的情节差异表达lncRNAs高温超导和正常皮肤组织之间。(b)火山的高温超导之间的差异表达mrna和正常皮肤组织。(c)的相关聚类热图lncRNA和mRNA表达矩阵。(d, e) mRNA的监管途径去KEGG浓缩是在高温超导组织进行分析。
3.2。临床高温超导lncRNA PAPPA-AS1显著调节组织和HTsFb细胞

来验证这些lncRNAs的相对表达水平在高温超导和挑选最重要的一个,的表达这些lncRNAs NsFb HTsFb细胞被评估。如图2(一个),大约三倍表现的变化对lncRNA PAPPA-AS1 HTsFb细胞中观察到,相比NsFb细胞( 与NsFb)最多的lncRNA意义。TLR4信号通路下游的状态评估,确定相关的蛋白质的表达水平在NsFb和HTsFb细胞。如数据所示2 (b)和2 (c)我们发现TLR4 MyD88,胶原蛋白,胶原蛋白三世,TGF -β1,αsma在HTsFb显著调节细胞,而NsFb细胞( 比NsFb)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图2
临床高温超导lncRNA PAPPA-AS1显著调节组织和HTsFb细胞。(a)中存在被用来检测的表达PAPPA-AS1 NsFb和HTsFb细胞。(b, c) TLR4的表达水平,MyD88,胶原蛋白,胶原蛋白三世,TGF -β1,α通过免疫印迹sma进行评估。NSFB组:正常培养NSFB细胞;HTsFb组:正常培养HTsFb细胞( 比NsFb)。
3.3。推倒PAPPA-AS1抑制HTsFb细胞的增殖抑制TLR4 / MyD88和TGF -β1信号通路在体外

评价的功能在HTsFb PAPPA-AS1细胞,建立的击倒PAPPA-AS1 HTsFb细胞短发卡RNA(成分)技术。如图3(一个)PAPPA-AS1明显的表达抑制sh-PAPPA-AS1 # 1或sh-PAPPA-AS1 # 2组,而sh-NC集团( 比sh-NC)。我们进一步发现转染细胞的增殖能力。如图3 (b),OD值sh-PAPPA-AS1 # 1或sh-PAPPA-AS1 # 2组显著降低,而sh-NC集团( 与sh-NC),指示一个抑制作用被推倒PAPPA-AS1 HTsFb细胞增殖能力。此外,通过使转染细胞HTsFb sh-PAPPA-AS1 # 1或sh-PAPPA-AS1 # 2, TLR4的表达水平,MyD88, TGF -β1(图3 (c))HTsFb细胞明显抑制( 比sh-NC)。图3 (d)显示纤维化标记的荧光强度,胶原蛋白,胶原蛋白三世αsma, HTsFb细胞治疗。我们发现,胶原蛋白的荧光强度,胶原蛋白三世αsma大大减少sh-PAPPA-AS1 # 1或sh-PAPPA-AS1 # 2组,而sh-NC组。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图3
推倒PAPPA-AS1抑制HTsFb细胞的增殖抑制TLR4 / MyD88和TGF -β1信号通路。(a)中存在被用来检测PAPPA-AS1的表达。(b) MTT试验被用来检查细胞增殖能力。(c) TLR4的表达水平,MyD88, TGF -β1通过免疫印迹进行评估。(d)胶原蛋白的表达水平,胶原蛋白三世α如果染色sma进行评估。与sh-NC sh-NC组:HTsFb细胞转染质粒;sh-PAPPA-AS1 # 1组:HTsFb与sh-PAPPA-AS1 # 1细胞转染质粒;sh-PAPPA-AS1 # 2组:HTsFb sh-PAPPA-AS1 # 2细胞转染质粒( 与sh-NC, 比sh-NC)。
3.4。推倒PAPPA-AS1缓解高温超导的纤维化状态小鼠体内

评估的影响lncRNA PAPPA-AS1,我们插入成分进入慢病毒粒子,这是进一步注入到高温超导组织。如图4(一)与sh-NC相比,成纤维细胞的数量,毛细血管的数量,上皮厚度减少sh-PAPPA-AS1 # 1和sh-PAPPA-AS1 # 2组。此外,TLR4的表达水平,MyD88, TGF -β1(图4 (b))在高温超导组织明显抑制sh-PAPPA-AS1 # 1或sh-PAPPA-AS1 # 2组,而sh-NC集团( 比sh-NC)。图4 (c)显示胶原蛋白的荧光强度,胶原蛋白三世α每组sma的高温超导组织。胶原蛋白的荧光强度,胶原蛋白三世αsma被大大抑制sh-PAPPA-AS1 # 1或sh-PAPPA-AS1 # 2组,而sh-NC组。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
推倒PAPPA-AS1减轻纤维化的高温超导老鼠。他染色(a)是用来评估高温超导组织的病理状态,和成纤维细胞的数量,毛细血管,上皮厚度计算( 比sh-NC)。(b) TLR4的表达水平,MyD88, TGF -β1高温超导组织进行评估通过免疫印迹( 比sh-NC)。(c)胶原蛋白的表达水平,胶原蛋白三世αsma在高温超导组织评估如果染色。sh-NC组:老鼠注射sh-NC慢病毒;sh-PAPPA-AS1 # 1组:老鼠注射sh-PAPPA-AS1 # 1慢病毒;sh-PAPPA-AS1 # 2组:老鼠注射sh-PAPPA-AS1 # 2慢病毒。
3.5。lncRNA PAPPA-AS1互动TAF15和调节其表达HTsFb细胞体外

探索机制的监管效果lncRNA PAPPA-AS1 TLR4 / MyD88和TGF -β1信号通路,我们探索的互动lncRNA PAPPA-AS1 rna结合蛋白(RBP), TAF15。如数据所示5(一个)和5 (b),我们发现lncRNA PAPPA-AS1位于HTsFb细胞的细胞核和细胞质。把试验的结果如图5 (c)。以SNRNP70为积极控制,免疫球蛋白g相比,lncRNA PAPPA-AS1 TAF15组显著高表达。进一步确认之间的交互lncRNA PAPPA-AS1 TAF15,我们进行RNA拉试验。如图5 (d)结果表明,lncRNA PAPPA-AS1与TAF15,指示一个明显的互动lncRNA PAPPA-AS1和TAF15 ( 对免疫球蛋白)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图5
lncRNA PAPPA-AS1与TAF15 HTsFb细胞和调节其表达。(a)亚细胞分离分析是用来确定PAPPA-AS1的表达在细胞质和核( 与细胞质)。(b)的表达PAPPA-AS1 RNA在细胞质和细胞核被鱼化验。(c, d) PAPPA-AS1之间的交互和TAF15被撕裂试验和RNA检测下拉试验( 对免疫球蛋白)。
3.6。lncRNA PAPPA-AS1诱导的转录TLR4通过招募TAF15 TLR4启动子的体内和体外

之间的击倒效果几乎等于sh-PAPPA-AS1 # 1和sh-PAPPA-AS1 # 2的shrna被选为后续实验(sh-PAPPA-AS1 # 1)。此外,PAPPA-AS1-overexpressed HTsFb细胞建立了使转染的细胞pcDNA3.1-PAPPA-AS1向量。它表明,过度的转染PAPPA-AS1成功(图6(一))。如图6 (b)相比, ,TAF15 sh-PAPPA-AS1 # 1组中明显表达下调和调节over-PAPPA-AS1组,表明PAPPA-AS1的表达和TAF15之间存在正向关系。如上述所示结果,TLR4信号通路是由lncRNA PAPPA-AS1,这可能与高温超导的发展。我们进一步研究了TLR4的表达水平和TAF15在正常皮肤组织和瘢痕组织。TLR4和TAF15被发现显著调节在瘢痕组织(图6 (c), 比正常组织)。此外,一个积极的TLR4的表达水平之间的相关性和TAF15疤痕组织观察(图6 (d))。探讨TLR4和TAF15之间的关系、TAF15击倒和TAF15-overexpressed HTsFb细胞建立了。如图6 (e)TAF15的表达水平显著抑制sh-TAF15组和高架over-TAF15组。此外,TLR4的表达下调sh-TAF15集团和调节over-TAF15组( 与控制)。芯片分析(图6 (f))透露,TAF15与TLR4的启动子( 对免疫球蛋白)。如图6 (g)中可观察到,重要的荧光素酶活性TAF15-transfected细胞,进一步验证TAF15之间的交互和TLR4 ( 与NC)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
图6
lncRNA PAPPA-AS1诱导的转录TLR4通过招募TAF15 TLR4启动子。(a)的相对表达PAPPA-AS1检测中存在。(b)中存在被用来检测TAF15的表达( vs。 )。(c) TAF15和TLR4的表达水平的组织被RT-qPCR评估( 比正常组织)。(d)之间的相关性TAF15和TLR4的表达在高温超导组织评估。(e) RT-qPCR被用来检测TAF15和TLR4的表达治疗HTsFb细胞( vs。 )。(f)芯片分析评估TAF15之间的交互和TLR4的启动子( 对免疫球蛋白)。(g)之间的交互TAF15和TLR4的启动子被荧光素酶试验验证。对照组:正常培养HTsFb细胞; 组:与sh-NC HTsFb细胞转染质粒同时pcDNA3.1-NC质粒;sh-PAPPA-AS1 # 1组:HTsFb与sh-PAPPA-AS1 # 1细胞转染质粒;与pcDNA3.1-PAPPA-AS1 pcDNA3.1-PAPPA-AS1组:HTsFb细胞转染质粒;正常组织组:人类正常皮肤组织;疤痕组织:人类疤痕组织; 组:与sh-NC HTsFb细胞转染质粒同时over-NC质粒;与sh-TAF15 sh-TAF15组:HTsFb细胞转染质粒;与over-TAF15 over-TAF15组:HTsFb细胞转染质粒。( 与NC)。
3.7。PAPPA-AS1提升HTsFb的增殖细胞通过调节TAF15 / TLR4轴体外

后确认之间的交互lncRNA PAPPA-AS1 TAF15,以及TAF15 TLR4,我们进一步验证是否监管PAPPA-AS1对扩散的影响与PAPPA-AS1在TLR4表达的影响。为了验证TLR4超表达的成功,我们存在进行检测。图7(一)表明TLR4的表达在HTsFb pcDNA-TLR4转染后细胞增加。的PAPPA-AS1击倒HTsFb细胞,和PAPPA-AS1击倒TLR4-overexpressed HTsFb细胞建立了。如图7 (b)细胞,抑制细胞的可行性HTsFb sh-PAPPA-AS1 # 1组明显升高 集团( 与sh-NC, 比sh-PAPPA-AS1 # 1)。此外,表达下调TLR4、MyD88 TGF -β1诱导的击倒PAPPA-AS1大大逆转 组(图7 (c), 与sh-NC, 比sh-PAPPA-AS1 # 1)。如图7 (d)与sh-NC组相比,荧光强度的胶原蛋白,胶原蛋白三世αsma是抑制大大sh-PAPPA-AS1 # 1组,显著升高 组。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图7
PAPPA-AS1提升HTsFb的增殖细胞通过调节TAF15 / TLR4轴。(a)中存在的相对发现TLR4的表达。(b) MTT试验用于检测治疗HTsFb细胞的增殖( ,与sh-NC; 比sh-PAPPA-AS1 # 1)。(c) TLR4的表达水平,MyD88, TGF -β1通过免疫印迹进行评估。(d)胶原蛋白的表达水平,胶原蛋白三世α如果染色sma进行评估。与pcDNA3.1-NC pcDNA3.1-NC组:HTsFb细胞转染质粒;与pcDNA3.1-TLR4 pcDNA3.1-TLR4组:HTsFb细胞转染质粒;与sh-NC sh-NC组:HTsFb细胞转染质粒;sh-PAPPA-AS1 # 1组:HTsFb与sh-PAPPA-AS1 # 1细胞转染质粒; 组:HTsFb细胞转染sh-PAPPA-AS1 # 1和pcDNA3.1-TLR4同时质粒( 与sh-NC, 比sh-PAPPA-AS1 # 1)。
3.8。PAPPA-AS1影响高温超导的纤维化状态小鼠通过调节TAF15 / TLR4轴体内

验证底层机制的功能PAPPA-AS1在高温超导的发展,sh-PAPPA-AS1 # 1和sh-PAPPA-AS1 # 1结合pcDNA3.1-TLR4向量被插入到慢病毒粒子,这是进一步注入到高温超导组织的动物。结果在图7(一)表明TLR4的表达pcDNA-TLR4组高于pcDNA-NC组。这是建议pcDNA-TLR4发挥了重要作用。如图8 (b)的数量与sh-NC组相比,成纤维细胞和毛细血管的数量减少sh-PAPPA-AS1 # 1组,逆转的 组和上皮厚度。抑制TLR4的表达水平,MyD88, TGF -β高温超导组织(图18 (c))由击倒的爸爸明显升高 集团( 与sh-NC和 比sh-PAPPA-AS1 # 1)。此外,胶原蛋白的荧光强度降低,胶原蛋白三世αsma在高温超导组织诱导击倒的爸爸明显升高 组(图8 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图8
PAPPA-AS1影响高温超导的纤维化状态小鼠通过调节TAF15 / TLR4轴。(a)中存在的相对发现TLR4的表达。他染色(b)是用来评估高温超导组织的病理状态。(c), TLR4的表达水平,MyD88, TGF -β1高温超导组织进行评估通过免疫印迹( 与sh-NC, 比sh-PAPPA-AS1 # 1)。(d)胶原蛋白的表达水平,胶原蛋白三世αsma在高温超导组织评估如果染色。pcDNA3.1-NC组:老鼠注射pcDNA3.1-NC慢病毒;pcDNA3.1-TLR4组:老鼠注射pcDNA3.1-TLR4慢病毒;sh-NC组:老鼠注射sh-NC慢病毒;sh-PAPPA-AS1 # 1组:老鼠注射sh-PAPPA-AS1 # 1慢病毒; 组:老鼠注射sh-PAPPA-AS1 # 1和pcDNA3.1-TLR4同时慢病毒。

4所示。讨论

lncRNA被报道参与多种类型的疾病通过调节关键蛋白质的表达,包括恶性肿瘤(29日,30.],纤维化[31日,32),和自身免疫性疾病33,34]。江和郭发现THBS1诱导肥厚性瘢痕成纤维细胞的生长(35]。高温超导是一个复杂的病理过程与多个细胞信号通路和异常表达的蛋白质;最近报道的发展和过程有关的差异表达lncRNA [36]。马和刘声称lncRNA FAM225B促进了高温超导的发展(37]。然而,这种现象的潜在机制仍是未知的。在目前的研究中,差异表达lncRNAs之间正常的皮肤组织和高温超导组织筛选使用lncRNA数组。lncRNA PAPPA-AS1挑出由于其高表达水平HTsFb细胞NsFb相比。据报道,成纤维细胞是主要的参与者的过程和发展高温超导分泌胶原蛋白;的过度增殖的主要诱导物被认为是高温超导的形成(38,39]。因此,在目前的研究中,HTsFb细胞作为研究对象。表达水平的推倒lncRNA PAPPA-AS1 HTsFb细胞,HTsFb细胞的增殖能力和纤维化标志物的表达水平明显抑制,表明潜在的相关性lncRNA PAPPA-AS1 HTsFb细胞和纤维化过程。此外,体内实验证实,高温超导组织的病理状态是缓解和纤维化标志物的表达水平是被注射慢病毒颗粒包含成分对lncRNA PAPPA-AS1。这些初步数据,我们怀疑高温超导的发展可能是相关的upregulation lncRNA PAPPA-AS1。但是我们仍然不知道什么样的分子诱导lncRNA PAPPA-AS1 HTsFb既定的。在未来,我们将使用生物信息学方法探索和预测分子作用于PAPPA-AS1和为更好的高温超导治疗提供更多的可能性。

TLR4 / MyD88信号通路是一个典型的炎症信号通路,据报道,发挥了重要作用的发展和纤维化的过程(40]。通过调节NF -κB信号通路,TLR4 / MyD88信号触发炎症因子的过度生产诱发和加重肝纤维化的病理状态41,42]。此外,TGF -β1可以激活信号通路的刺激TLR4 / MyD88轴[19),这被认为是一个重要的生长因子在纤维发生。通过诱导ECM的形成和防止ECM降解,生产将抑制纤维化myofibroblasts TGF -β1 (43]。此外,TGF -的监管效果β1纤维发生的活动与Smad信号通路的激活通过影响I型受体介导的磷酸化Smad2和Smad344]。抑制TGF -β1证明减轻纤维化在多种动物模型(45,46]。在目前的研究中,我们发现TLR4 / MyD88信号通路和TGF -β1信号通路在HTsFb显著激活细胞,由击倒逆转的表达水平lncRNA PAPPA-AS1,表明lncRNA PAPPA-AS1可能诱导高温超导的过程通过抑制TLR4 / MyD88信号通路和TGF -β1信号通路。然而,可能会有其他分子在TLR4 / MyD88通路,我们仍然不能认为完全TLR4的角色。伤疤TLR4可能更复杂的功能,需要一个更全面的研究探索。因此,我们将进行深入分析并完成实验探讨TLR4 / MyD88通路中的各种分子的作用在高温超导在我们未来的工作。我们还将结合目前的工作比较TLR4的区别及其与PAPPA-AS1协作功能。

进一步研究的分子机制,我们专注于rna结合蛋白,着重结合相关蛋白因子15 (TAF15),属于场效应晶体管家族(47]。场效应晶体管的家庭是广泛表达于不同的组织,和家庭成员的结构非常相似,这是据报道参与转录等生物过程,拼接,microrna的形成、RNA运输、和维持基因组的完整性48]。最近,TAF15广泛报道与lncRNA调节目标基因的转录和翻译。锅等。49)称,在结肠癌的过程,lncRNA TRPM2-AS与TAF15稳定mRNA的瞬时受体电位melastatin 2 (TRPM2),导致结肠癌的发展。LINC010148可以表达水平的升高由USF1和LINC010148与TAF15绑定到YAP1的启动子,这进一步触发鳞状细胞癌的发展(50]。在目前的研究中,之间的交互lncRNA PAPPA-AS1和TAF15证实了RNA下拉和撕裂试验。此外,TAF15之间的绑定和TLR4的启动子芯片和荧光素酶试验证实了。我们进一步证实lncRNA PAPPA-AS1调控TLR4 / MyD88信号通路和TGF -β1在HTsFb细胞信号通路相互作用与TAF15上调TLR4的表达水平,进一步证明了在高温超导裸鼠模型。

然而,在目前的研究中仍有限制。例如,我们验证的功能lncRNA PAPPA-AS1 / TAF15 TLR4轴通过使转染sh-PAPPA-AS1 # 1和pcDNA3.1-TLR4 HTsFb细胞或高温超导组织时,废除sh-PAPPA-AS1 # 1的影响。没有直接证据提供给索赔TAF15的参与。在未来的工作中,移植的TAF15 sh-PAPPA-AS1 # 1-transfected HTsFb细胞或高温超导组织将直接进行验证TAF15的参与。此外,在目前的研究中,异种移植诊所的高温超导组织移植到裸鼠建立动物模型,这是独立的,只有提供了潜在的数据。在我们进一步的工作,其他高温超导动物模型,如高温超导兔模型和转基因动物,将被用来评估lncRNA的biofunction PAPPA-AS1和潜在的底层机制在高温超导的发展过程。

5。结论

通过我们的实验和分析,我们证明了lncRNA PAPPA-AS1可能诱导高温超导的发展,移植TLR4通过与TAF15交互。

数据可用性

使用的数据集或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Pengju风扇以下:概念、方法、软件、数据管理和原创作品草稿准备。Yongjie王以下:可视化,调查,和监督。晶晶李做了如下:软件和验证。人方以下:writing-reviewing和编辑。

确认

作者要感谢的燃烧和塑料,湘雅医院,中南大学的支持。