促炎效应Ubiquitin-Specific蛋白酶5 (USP5)在类风湿性关节炎呈Synoviocytes

文摘

类风湿性关节炎(RA)是一个世界性的慢性自身免疫性炎症性疾病影响大约1%的总人口。它的特点是异常增殖呈synoviocytes (FLS)和增加促炎细胞因子的生产。在当前的研究中,我们旨在调查ubiquitin-specific蛋白酶的作用5 (USP5)在RA-FLS炎症过程。表达USP5被发现在RA-FLS调节相比,在骨关节炎(OA) FLS的,和il - 1β刺激增加USP5表达时间的方式。此外,我们发现USP5超表达显著加剧了促炎细胞因子的生产和相关的核转录因子κB (NF -κB)信号激活。一致,沉默USP5减少细胞因子的释放,抑制NF -的激活κb .此外,USP5被发现与肿瘤坏死因子receptor-associated因子6 (TRAF6)和删除其K48-linked polyubiquitination因此稳定TRAF6链。我们的数据表明,RA-FLS USP5-positive细胞调节炎症过程,建议USP5作为RA治疗的潜在目标。

1。介绍

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性自身免疫性炎症性疾病,特点是关节的炎症,随后的软骨破坏和侵蚀的骨头1,2]。目前,风湿性关节炎的临床治疗策略主要是药物治疗,包括免疫抑制药物和生物制剂。然而,这些治疗产生耐药性,增加了传染病和癌症的风险(3]。因此,探索类风湿性关节炎的机制具有重要意义,确定新的治疗目标。

呈synoviocytes (FLS)是一种特殊类型的mesenchymal-derived细胞正常滑膜衬里层组织(4]。在RA患者中,FLS的惊人的表达一些肿瘤细胞表型相似,被描述为不受监管的扩散,抗细胞凋亡和无视接触抑制(5]。此外,RA-FLS有助于生产促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMPs)导致软骨破坏(6]。最近,FLS的核心作用的风湿性关节炎的进展使得RA FLS的考虑干预治疗的方式(7- - - - - -9]。

泛素化是一种重要的翻译后修饰来调节各种细胞过程(9]。Deubiquitination,泛素化,相反的步骤是由deubiquitinating酶(配音),专门从ubiquitin-conjugated分裂泛素蛋白底物(10]。Ubiquitin-specific蛋白酶5 (USP5)属于Ubiquitin-specific蛋白酶(USP)的家庭,它已被确认为人类肿瘤促进剂在几种类型的癌症。增加ubiquitin-specific蛋白酶5 (USP5)与肿瘤发生有关的恶性肿瘤包括胰腺癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌和肝癌11- - - - - -13]。最近的研究还表明,USP5 TNF -生产至关重要α在粘膜肥大细胞(14]。然而,USP5在RA的影响仍然在很大程度上仍是个未知数。

在当前的研究中,我们旨在探讨il - 1的USP5对炎症反应的影响β刺激RA-FLS。我们发现USP5的表达增加RA-FLS OA-FLS相比。此外,之间存在着正相关USP5表达式和促炎细胞因子的生产。USP5发现加重NF -κ观察B激活,USP5 TRAF6相互作用,导致K48-linked deubiquitination TRAF6。这些数据表明USP5 il - 1的积极的监管机构β全身的炎症反应,它提供了一个新的潜在目标类风湿性关节炎的研究和开发。

2。材料和方法

2.1。FLS的和细胞培养

FLS的分离滑膜组织的RA和OA患者如前所报道(9]。组织收集从8 RA患者和8骨关节炎(OA)患者的解放军总医院的第八骨科医学中心;RA患者完成了2010 ACR /欧洲联盟对风湿病(欧拉描述)对RA分类标准。从所有患者知情同意了,这项协议是我们医院伦理委员会批准。FLS的细胞在DMEM(位于马里兰州Rockville Gibco-Invitrogen Corp .)和补充了青霉素,链霉素,10%胎牛血清的边后卫和37°C 5%孵化有限公司₂条件。FLS的细胞通道三到五。

2.2。定量PCR分析

滑膜组织的总RNA提取或使用试剂盒FLS的细胞试剂(英杰公司、美国),和互补脱氧核糖核酸是合成PrimeScript RT试剂盒(豆类、日本)根据制造商的协议。500 ng cDNA用于定量PCR QuantiTect™SYBR绿色PCR试剂盒(豆类,大津,日本)。循环条件1周期(95°C, 5分钟)和40个周期(95°C, 15秒;55°C, 30秒;和72°C, 30秒);2^{- - - - - -ΔΔCT}方法被用来评估每个放大产品的相对数量的样品(15]。引物序列见表使用1。

2.3。病毒、质粒

所有的慢病毒和质粒是由MDL科技公司(MDL生物技术,北京)。慢病毒包含载体质粒(控制)和超表达质粒USP5是由使用pLenti6 / V5向量(技术);慢病毒包含负控制质粒(sh-NC)和成分的质粒USP5 (sh-USP5)是由使用pLKO。1的向量(Sigma-Aldrich)。慢病毒获得根据制造商的指示和丰富。FLS的细胞在50莫伊的慢病毒感染,和jetPEI的转染试剂(Polyplus-transfection)用于Myc-USP5, Flag-TRAF6, HA-ub质粒。

2.4。免疫印迹分析,免疫沉淀反应和泛素化试验

根据以前的报告(实验进行9]。蛋白质是量化使用BCA蛋白质化验设备(热科学、沃尔瑟姆,MA)和25μg蛋白分离使用10% sds - page和转移到PVDF膜(微孔)。USP5抗体(1:500 # ab155993), TRAF6 (1: 500 # ab33915) p65 (1: 500 # ab16502) phos-p65 (1: 500 # ab76302)我κBα(1:500 # ab32518) phos-IκBα(1:500 # ab133462),β肌动蛋白(1:1000,# ab179467), Myc (1: 1000 # ab32),国旗(1:1000 # ab49763),和K48-ub (1: 500 # ab140601)都从Abcam购买(美国剑桥Abcam)。

2.5。ELISA

白细胞介素- 6 (il - 6)的水平,肿瘤坏死因子-α(TNF -α)和基质金属蛋白酶1(可以是衡量ELISA试剂盒(研发系统)根据制造商的指示。

2.6。Dual-Luciferase报告基因分析

中描述的实验研究[16]。荧光素酶活性的NF -κB子被Dual-Luciferase记者分析评估系统(美国麦迪逊Promega)和探测到spectraMax M5阅读器(美国加州分子设备)。

2.7。统计分析

所有的数据呈现的 三个独立的实验。使用双尾学生的统计显著性测定 - - - - - -测试比较两组。单向方差分析进行比较三个或更多。如果方差分析是很有意义的,Newman-Keuls测试是用来比较每组。USP5的表达的相关性,建立了TRAF6皮尔逊相关分析。被认为具有统计显著性值< 0.05。

3所示。结果

3.1。相比OA-FLS RA-FLS USP5表达增加

探索USP5对RA的影响,我们检查USP5起初的表达。如数据所示1(一)和1 (b)信使rna和蛋白质含量USP5明显调节的滑膜组织的RA患者与OA滑膜组织。此外,我们发现的表达USP5 FLS的细胞从RA和OA患者。一致,信使rna和蛋白质水平的USP5 RA-FLS与OA-FLS相比也增加(数据1 (c)和1 (d))。这些发现暗示我们,USP5表达式在RA患者增加,表明USP5可能参与了RA的发展。Interleukin-1β(il - 1β)是最常见的炎性刺激参与RA发病机理;因此,我们刺激RA-FLS il - 1β调查USP5回应促炎细胞因子的表达。我们发现信使rna和蛋白质水平的il - 1后USP5增加β治疗时间的方式在RA-FLS(数字1 (e)和1 (f))。

3.2。超表达和沉默的USP5使用慢病毒

为进一步的研究中,我们使用慢病毒过度表现或沉默USP5表达式。包含USP5 RA-FLS细胞感染了慢病毒表达质粒,效率在mRNA(图确认2(一个)(图)和蛋白质水平2 (b))。此外,我们构建慢病毒包含shRNA USP5的质粒和沉默效率数据所示2 (c)和2 (d)。

3.3。USP5加剧促炎细胞因子il - 1的生产β对待RA-FLS

促炎细胞因子的生产在FLS的RA的发病机制的关键。因此,我们发现了USP5对促炎细胞因子il - 1生产的影响β对待RA-FLS。我们发现USP5显著促进了细胞因子的生产,如肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、白细胞介素- 6 (il - 6)和基质金属蛋白酶1(可以)(图3(一个))。此外,ELISA数据表明,肿瘤坏死因子的分泌蛋白质含量α、il - 6和MMP1也增强USP5-overexpressed RA-FLS后il - 1β治疗(图3 (b))。一致,信使rna和蛋白质水平的促炎细胞因子也减少USP5-silenced RA-FLS细胞(数字3 (c)和3 (d))。

3.4。USP5提升NF -κ在il - 1 B信号激活β对待RA-FLS

最近,许多研究表明,NF -κB信号对RA的过程是至关重要的,特别是在FLS的促炎细胞因子的生产(4,9,16]。因此,我们发现USP5对il - 1的影响β全身的NF -κB激活。如数据所示4(一)和4 (b),我们发现我的磷酸化κBα和p65既加重USP5-overexpressed RA-FLS细胞。此外,击倒USP5的表达抑制我的磷酸化κBα和p65表明USP5抑制NF -的激活κB(数据4 (c)和4 (d))。此外,我们使用dual-luciferase记者分析调查NF -的激活κB启动子,我们观察到USP5显著促进NF -κB激活(数据4 (e)和4 (f))。在这些实验中,我们还发现USP5可能略有增加NF -κ没有il - 1 B激活β;然而,USP5的影响是极大地增强了il - 1的补充β。

3.5。USP5 TRAF6针对性和互动

通过使用dual-luciferase记者分析,我们发现在NF USP5——的影响κB由不同的适配器激活诱导USP5找到目标。如图5(一个),USP5显著增加TRAF6-induced NF -κB激活但没有影响TAK1或IKK的存在β。此外,我们发现USP5可能与USP5没有il - 1βil - 1后,这种内源性交互增强β治疗时间的方式(图5 (b))。一致,证实了这种交互外生实验通过使用标记的质粒(图5 (c))。

3.6。从TRAF6 USP5移除K48-Linked Polyubiquitination共轭

先前的研究表明,USP5能够移除K48-linked polyubiquitination链从不同的基质影响不同的生理过程17]。然而,在NF USP5——的目标κB信号仍然在很大程度上仍未知。因此,我们假设USP5可能影响TRAF6表达式。事实上,我们发现TRAF6表达式在USP5的存在大大增加剂量依赖性的方式(图6(一))。表达的一致,击倒USP5导致TRAF6的减少(图6 (b))。的表达USP5 TRAF6和皮尔森相关(值)从RA患者也发现(FLS的人物6 (c)和6 (d))。K48-linked蛋白质polyubiquitination众所周知的退化导致相应的蛋白质通过26 s蛋白酶体;因此,我们进行了泛素化试验检查USP5对TRAF6 polyubiquitination。我们观察到的存在是广泛使用的蛋白酶体抑制剂Mg132,野生型polyubiquitination和K48-linked polyubiquitination TRAF6水平明显减少USP5中RA-FLS细胞,但K63-linked polyubiquitination USP5 TRAF6并不影响的超表达(图6 (e))。这些数据表明,USP5可以删除K48-linked polyubiquitination共轭从TRAF6因此增强RA-FLS TRAF6的表达。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查的表达USP5 RA-FLS和探索的功能USP5 FLS的细胞在炎症过程。我们所知,这是第一个发表显示USP5在RA的影响,第一次,我们说明USP5规范NF -的目标κB信号通路。

FLS的细胞是滑膜炎症的重要监管机构在RA的进展。这些细胞可以分泌多种促炎细胞因子和介质,调节生长因子的表达,引发更多FLS的激活反馈,导致软骨的破坏(18]。最近,许多研究发现,FLS的是一个非常重要和有效的治疗类风湿性关节炎(11,19- - - - - -21]。因此,为了说明USP5在RA的效果,我们使用FLS的细胞在目前的研究中,我们发现的表达USP5 RA-FLS而OA-FLS增强。此外,对il - 1 USP5水平增加βRA-FLS刺激,这表明USP5可能在RA的发展发挥着重要作用。由于由FLS的细胞分泌促炎细胞因子的函数,我们主要发现FLS的USP5对炎症反应的影响。我们发现mRNA和蛋白分泌的多种促炎细胞因子增加水平USP5-overexpressed RA-FLS细胞il - 1β治疗,建议USP5可以调节炎症RA-FLS il - 1β刺激。

il - 1β,这被认为是与炎症病理,是一个重要的促炎细胞因子调节NF -κB信号激活(22]。NF -κB在RA的发病机制被广泛报道,和NF -κB禁忌也一直在探索作为RA治疗方法(23]。评估如何USP5调节促炎细胞因子的生产,我们下一个检查USP5 NF -的作用κB激活。我们发现我的磷酸化κBα和p65 USP5表达水平正相关。此外,dual-luciferase记者试验结果还表明,USP5-positive细胞调节激活NF -κB。

USP5表达式被发现在胶质母细胞瘤,增加黑色素瘤、肝细胞癌(11]。在目前的研究中,我们证实USP5的表达也增强RA-FLS OA-FLS相比。deubiquitinating酶,USP5总是报道deubiquitination参与调节不同的生理过程的功能。据报道,USP5可以稳定等蛋白质p53, Cav3.2,β连环蛋白,蛞蝓,FoxM1通过抑制K48-linked polyubiquitination水平(11,12,24,25];然而,在NF USP5——的目标κB信号尚不清楚。在目前的研究中,我们发现USP5可以与TRAF6内生和外生条件。此外,过度USP5显著增强的表达TRAF6 FLS的。一致,沉默USP5导致TRAF6水平下降。最重要的是,我们发现USP5抑制K48-linked polyubiquitination TRAF6水平但不影响其K63-linked polyubiquitination。这些数据表明USP5把K48-linked polyubiquitination链从TRAF6和稳定表达,导致NF -的激活κB和促进促炎细胞因子的表达。

在我们的实验中,没有il - 1β政府,我们观察到USP5也可以稍微与TRAF6交互,促进NF -κB活化和细胞因子的表达。然而,与外源性il - 1β存在,这些现象得到明显加强。我们猜测这可能与促炎细胞因子的自我保护RA-FLS,即使没有il - 1β管理;低剂量的细胞因子可以促进USP5的表达,促进之间的交互TRAF6 USP5,也表明USP5 RA-FLS的炎症过程是至关重要的。

总之,我们的研究显示,USP5 RA-FLS炎症状态的是一个积极的监管机构,并建议USP5作为RA治疗的潜在目标。

数据可用性

原始数据用来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

小博罗和习剪成同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(编号81702173和81702173)。

引用

1. i . b .麦克因尼斯和g . Schett”类风湿性关节炎的发病机制,”《新英格兰医学杂志》上,卷365,不。23日,第2219 - 2205页,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. j . s . Smolen d Aletaha, i . b .麦克因尼斯“类风湿性关节炎”,《柳叶刀》,卷388,不。10055年,第2038 - 2023页,2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. 张y:燕,x, y, y王,“mir - 129 - 5 - p调节细胞增殖和细胞凋亡通过IGF-1R / Src / ERK / Egr-1通路RA-fibroblast-like synoviocytes,”生物科学报告,39卷,不。12日,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. g . Li z夏,y刘et al .,“SIRT1抑制类风湿性关节炎呈synoviocyte侵略性并通过抑制NF -炎症反应κB通路。”生物科学报告,38卷,不。3,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. 傅焦t . y . Wang, w . et al .,“mir - 410 - 3 - p调节增殖和凋亡呈synoviocytes通过瞄准YY1在类风湿性关节炎,“生物医学和药物治疗第109426条,卷。119年,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. f .江H.-Y。周,L.-F。周,黄懿慧温家宝,h·h·盖和通用汽车,“微- 421促进炎症反应呈synoviocytes风湿性关节炎的针对SPRY1,”欧洲医学和药理科学审查,23卷,不。19日,8186 - 8193年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. x x, z . Chen风扇et al .,“抑制DNM1L和线粒体分裂对抗炎症反应呈synoviocytes风湿性关节炎,“细胞和分子医学杂志》上,24卷,不。2、1516 - 1528年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. l, l . Li y . Wang问:高,Y.-Q。耿,RANKL对的增殖和凋亡的影响呈synoviocytes通过调节NF -在类风湿性关节炎κB信号通路。”欧洲医学和药理科学审查,23卷,不。21日,第9221 - 9215页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. Q.-Z。香港,L.-T。郭,J.-N。杨et al .,“纤维母synoviocytes TRAF-interacting蛋白质类风湿性关节炎的抗炎作用,”炎症介质卷,2016篇文章ID 3906108、9页,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 凌x,黄问:y徐et al .,“deubiquitinating酶Usp5调节切口和RTK信号在果蝇眼睛的发展过程中,“2月的信,卷591,不。6,875 - 888年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. X.-Y。李,H.-Y。吴,x。毛,L.-X。江,y。王”,USP5促进胰腺癌的肿瘤发生和发展稳定FoxM1蛋白质,”生物化学和生物物理研究通信,卷492,不。1,48-54,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. x, w . Qi, h·潘,f·杨和j·邓USP5导致肿瘤发生的超表达通过稳定的非小细胞肺癌β连环蛋白的蛋白质。”美国癌症研究杂志》上,8卷,不。11日,第2295 - 2284页,2018年。视图:谷歌学术搜索
13. 刘W.-M y。王,Y.-F。陆et al .,“Usp5功能作为刺激的致癌基因在肝细胞癌肿瘤发生,”Oncotarget,8卷,不。31日,第50664 - 50655页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 吉冈y、y .问:你们k·冈田克也et al .,“Ubiquitin-specific肽酶5 vialinin的目标分子,是一个关键分子TNF -α生产RBL-2H3细胞。”《公共科学图书馆•综合》,8卷,不。12篇文章e80931 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. k . j . Livak和t . d . Schmittgen相对基因表达数据的分析利用实时定量PCR和2^−ΔΔ_C__T方法。”方法,25卷,不。4、402 - 408年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. 林y和z罗,”NLRP6促进TAB2/3之间的交互和TRIM38风湿性关节炎呈synoviocytes,”2月的信,卷591,不。8,1141 - 1149年,2017页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. 崔x x徐、黄,et al .,“泛素特定的肽酶5调节大肠癌细胞生长稳定你翻译延长因子,”开展,9卷,不。14日,第4220 - 4208页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 勒费弗,a . Knedla c Tennie et al .,“风湿性关节炎滑膜成纤维细胞扩散影响关节。”自然医学,15卷,不。12日,第1420 - 1414页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. j·吴,y, Y.-P。张,J.-X。邓,Q.-H。Yu”RHAMM诱发风湿性关节炎的发展增强的功能呈synoviocytes,”BMC肌肉骨骼疾病,19卷,不。1,p。455年,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. c . Casnici d . Lattuada k Crotta et al .,“生长抑素类似物的抗炎作用对风湿性关节炎synoviocytes octreotide,”炎症第41卷。。5,1648 - 1660年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. n . y . Wang, s .赵et al ., " mir - 410 - 3 - p抑制细胞因子释放呈synoviocytes通过调节NF -κ在类风湿性关节炎B信号”,炎症,42卷,不。1,第341 - 331页,2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. y . j . Choi W.-S。李,如敞开式。李,M.-S。唱,W.-H。柳:“萝卜硫素抑制il - 1β全身的风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的增殖和基质金属蛋白酶的产生,cox - 2和PGE2,“炎症,37卷,不。5,1496 - 1503年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. m . w . j . Chen Wu, c·陈,“Taraxasterol il - 1的抑制炎症β全身纤维母synoviocytes风湿性关节炎和风湿性关节炎进展在老鼠身上,“国际免疫药理学卷,70年,第283 - 274页,2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. h . Potu l·f·彼得森a Pal et al .,“Usp5链接抑制BRAF p53在黑色素瘤和FAS水平的途径,”Oncotarget,5卷,不。14日,第5569 - 5559页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. j .孟x Ai, y Lei et al .,“USP5促进epithelial-mesenchymal通过稳定过渡段塞在肝细胞癌中,“开展,9卷,不。2、573 - 587年,2019页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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