文摘

Vestigial-like 4 (VGLL4)被发现有多个功能在肿瘤发展;然而,它在心血管疾病中的作用尚不清楚。本研究的目的是调查的影响VGLL4 Ox-LDL-induced障碍和炎症反应的人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)及其机制,提供一个新的理论依据动脉粥样硬化的诊断和治疗。在目前的研究中,VGLL4抑制Ox-LDL-induced凋亡的保护活动,氧化应激,炎症和损伤以及其分子机制研究使用人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)。结果表明,VGLL4的表达降低HUVECs Ox-LDL浓度的增加。此外,功能研究发现VGLL4过度缓解Ox-LDL-induced氧化应激,炎症和功能障碍和抑制细胞凋亡。进一步的研究发现,VGLL4监管Hippo-YAP / TEAD1信号通路和Hippo-YAP / TEAD1信号通路参与HUVECs VGLL4的保护机制。总之,它表明VGLL4防止oxidized-LDL-induced内皮细胞功能障碍通过激活Hippo-YAP / TEAD1信号通路。

1。介绍

动脉粥样硬化(AS)是最常见的心血管疾病,这是一个缓慢渐进的疾病(1]。参与动脉内膜病变开始,还有脂质积累,纤维组织增生,和钙沉积在当地区域,形成斑块(2]。据统计,每年约有2000万人死于动脉粥样硬化在世界3]。随着现代医学药物治疗的不断发展,外科手术治疗、介入治疗,和其他方法,动脉粥样硬化的死亡率是呈现出下降的趋势,但发病率仍在增长4]。

Vestigial-like 4 (VGLL4)是一种重要的血管像蛋白质(VGLL)家庭成员(5]。VGLL是一种新型的蛋白质参与肿瘤近年来发展。有四个成员VGLL蛋白在哺乳动物中,名为VGLL1-4 [6]。以前的研究已经表明VGLL1促进细胞增殖和基底中高度表达的乳腺癌[7]。同样,在软组织肉瘤VGLL3是放大,VGLL3结果的抑制细胞增殖和迁移的减少(8]。与VGLL家族的其他成员,VGLL4包含额外TDU域和功能被认为是不同的(9]。然而,VGLL4的角色在心血管疾病的发展需要进一步探讨。

河马信号通路是一个高度保守的增长控制信号通路(10]。它最初被发现在果蝇细胞抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,在胚胎发育的过程中起着重要的作用,组织和器官的形成,也有直接的关系与肿瘤的发生和发展11]。狂吠,多功能细胞内联接蛋白和转录共激活剂,河马信号通路中起着重要的作用。目前,河马/ Yap研究信号通路在肿瘤更为有限,但近年来,越来越多的报告关于它在心血管疾病中的作用12]。相关研究表明,河马/ Yap信号通路起着重要的作用在心血管开发、肥大、凋亡、自噬、血管再生,再生(13]。然而,河马信号通路的作用在广告的发展尚未完全阐明,这需要进一步探索。此外,VGLL4可以调节河马信号通路的激活。例如,VGLL4调节Hippo-Yap /而信号通路在心脏的发展。VGLL4不仅调节的稳定性而但也调节其与Yap互动(14]。因此,本研究将探讨VGLL4 / Hippo-Yap /而轴在动脉粥样硬化中的作用。

在目前的研究中,我们探索的影响VGLL4 HUVECs和特殊功能障碍的分子机制。我们的研究结果表明,VGLL4防止oxidized-LDL-induced内皮细胞功能障碍通过激活Hippo-YAP / TEAD1信号通路。建议VGLL4可能是一个潜在的目标治疗心血管疾病。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

HUVECs培养在37°C公司为5%2。使用的介质组件包括10%胎牛血清(EBM-2 Lonza) (Solarbio,北京),1%谷氨酰胺(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA), 100 U /毫升青霉素钠,和100年μg / mL硫酸链霉素(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。

2.2。试剂

使用的材料如下:HUVECs(美国圣地亚哥,CA);GAPDH anti-VGLL4 (1: 2000), anti-VCAM-1 (1: 2000), anti-TEAD1 (1: 500), anti-YAP (1: 500), anti-caspase-3 (1: 1000), anti-caspase-9(1: 500),和anti-ICAM-1(1: 1000)(北京TsingKe生物技术有限公司,北京,中国;DMEM (Beyotime生物技术,中国);WST-8 (Solarbio,北京);RNA提取包、rt - pcr试剂盒(Beyotime生物技术,中国),反转录试剂盒,ELISA试剂盒(Westang科技有限公司、上海、中国);和引物合成(北京TsingKe生物技术有限公司,北京,中国)。本研究中使用的引物序列表1。

表1
引物序列用于逆转录定量聚合酶链反应。
2.3。质粒

VGLL4超表达载体的构建根据文学。在这项研究中,所有的质粒pcDNA3.1向量构造在修改。VGLL4序列克隆到质粒pcDNA3.1使用PCR。没有VGLL4 pcDNA3.1基因是一个消极的控制(2μg / mL)。pcDNA3.1-VGLL4转染到HUVECs (6-well板, )。

2.4。转染

pcDNA3.1-VGLL4、si-YAP si-TEAD, Ctrl-siRNA由Tsingke设计和合成生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。HUVECs被接种到6-well板的密度 细胞/。转染试验根据指令执行的细胞转染工具包(Solarbio,北京)。

2.5。CCK-8化验

HUVECs被接种到96孔板和培养24小时37°C。(2)- 2-Methoxy-4-nitrophenyl 3 - (4-nitrophenyl) 5 - (2, 4-disulfobenzene (WST-8) (10μL)添加到板24 h。光密度(OD)值在450纳米是由微型板块读者。

2.6。ELISA试验

肿瘤坏死因子-的浓度α和il - 6在上层清液使用对应的ELISA试剂盒检测(Westang科技有限公司、上海、中国)根据指令。

2.7。膜联蛋白V-FITC /π

HUVECs被接种到6-well板24 h。细胞凋亡的实验研究中发现使用对应的膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(Solarbio,北京)根据指令。我们跟着徐的方法等。15]。

2.8。ROS测量

一夜之间HUVECs被孵化到6-well板块。这些细胞被收集和孵化DCFH-DA ROS指标(20μ米)在PBS 30分钟37°C。使用荧光显微镜分析了荧光(BD生物科学,CA)和荧光标。我们跟着徐的方法等。15]。

2.9。测量NAD+

细胞内NAD+使用EnzyChrom NAD含量测定+/ NADH化验设备(生物测定系统,海沃德、钙、美国)。HUVECs用PBS洗净,然后用提供的NAD提取缓冲细胞溶解。河畔+从溶解产物中提取根据制造商的协议。NAD的测量+是基于一种乙醇脱氢酶循环反应。吸光度的变化在565 nm 15分钟在室温下测量。

2.10。ATP的测量

HUVECs被处理的培养基,取而代之的是消息灵通的缓冲区。洗后,最初存储细胞培养基加入1 h。细胞是细胞溶解10毫米Tris-HCl (pH值7.8),和ATP含量决定使用定量生物荧光分析(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)根据制造商的指示和iMark微型板块吸光度读者(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.11。RT-qPCR

总RNA样本HUVECs孤立使用试剂盒®试剂(Solarbio,北京),和2000年Nanodrop RNA浓度测量。然后,总RNA retrotranscribed进cDNA根据逆转录的指示板。根据qPCR工具包的指示,我们配置相应的系统和设置多个井每组3。qPCR条件如下:95°C 1分钟(1周期),20年代95°C, 60°C 1分钟(32周期)。分析的数据2- - - - - -ΔΔCT方法与GAPDH基因正常化。我们跟着徐的方法等。15]。

2.12。西方墨点法

HUVECs播种在6-well板的密度 细胞/。细胞溶解了HUVECs改善里帕缓冲(Solarbio,北京)。提取的蛋白质(30μg)是分开变性聚丙烯酰胺凝胶,然后转移到PVDF膜,用5%脱脂牛奶(Solarbio,北京)。然后,增强实验室(ECL)暗室开发,Bio-Rad实验室(美国加州)扫描记录,和anti-GAPDH作为内部参考用于分析和比较。我们跟着徐的方法等。15]。

2.13。统计分析

的所有数据了 ,每个实验进行了一式三份。单向方差分析是用来分析统计学意义。所有由SPSS 20.0软件进行统计分析(IL SPSS, Inc .,芝加哥,美国)。 值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。VGLL4较低的表达在Ox-LDL-Induced HUVECs

HUVECs是对待Ox-LDL(25、50、100和200μg / mL)。如图1(一)、细胞的可行性HUVECs显著减少Ox-LDL诱导剂量依赖性的方式(图1(一))。更重要的是,VGLL4的mRNA表达减少Ox-LDL-treated HUVECs(图1 (b))。正如所料,VGLL4的蛋白表达也显著下调在HUVECs(图1 (c))。

(一)
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图1
VGLL4较低的表达在Ox-LDL-induced HUVECs。(一)CCK-8 HUVECs是用来检测细胞的可行性。(b)的mRNA表达VGLL4 HUVECs Ox-LDL对待在25日,50岁,100年和200年μ克/毫升。(c)的蛋白表达VGLL4 HUVECs细胞治疗Ox-LDL在25岁,50岁,100年和200年μ克/毫升。” ”是指与对照组相比 。GAPDH是用作计算蛋白质折叠一个不变的内部控制变化。
3.2。过度的VGLL4减轻Ox-LDL-Induced HUVECs氧化应激和炎症

转染了HUVECs pcDNA3.1 (pcDNA3.1集团)或pcDNA3.1-VGLL4 (p-VGLL4组),分别。pcDNA3.1-VGLL4被转染后,VGLL4蛋白的表达明显增加(图2(一个))。此外,过度的VGLL4减轻Ox-LDL-induced氧化应激。如数据所示2 (b)- - - - - -2 (d),VGLL4显著降低ROS水平Ox-LDL-induced HUVECs,同时显著增加ATP和河畔+级别(数据2 (b)- - - - - -2 (d))。正如所料,il - 6和TNF -的水平αOx-LDL治疗后显著增加,而pcDNA3.1-VGLL4显著下调表达的il - 6和TNF -α(数据2 (e)和2 (f))。

(一)
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图2
过度的VGLL4减轻Ox-LDL-induced HUVECs氧化应激和炎症。HUVECs Ox-LDL处理(100μg / mL)和转染控制向量(pcDNA3.1组)或pcDNA3.1-VGLL4 (p-VGLL4组),分别。(a)的蛋白表达VGLL4未经处理,控制,pcDNA3.1和p-VGLL4组。(b)的ROS水平治疗,控制,pcDNA3.1和p-VGLL4组。NAD (c)+未经处理的水平,控制、pcDNA3.1 p-VGLL4组。(d)的ATP水平治疗,控制,pcDNA3.1和p-VGLL4组。(e)在未经处理的il - 6水平,控制,pcDNA3.1和p-VGLL4组。肿瘤坏死因子- (f)α未经处理的水平,控制、pcDNA3.1 p-VGLL4组。” ”是指与对照组相比 ,和“#”意味着与pcDNA3.1组相比 。GAPDH是用作计算蛋白质折叠一个不变的内部控制变化。
3.3。超表达HUVECs VGLL4抑制Ox-LDL-Induced细胞凋亡

如图3(一个),HUVECs Ox-LDL显著降低细胞的生存能力,而pcDNA3.1-VGLL4显著逆转Ox-LDL的抑制效果(图3(一个))。此外,细胞凋亡率HUVECs增加Ox-LDL治疗后与对照组相比,虽然过度VGLL4减轻Ox-LDL-induced细胞凋亡(图3 (b))。正如所料,caspase-3的蛋白表达和caspase-9 Ox-LDL治疗组明显增加,而pcDNA3.1-VGLL4显著降低caspase-3和caspase-9(图的表达3 (c))。

(一)
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图3
超表达HUVECs VGLL4抑制Ox-LDL-induced细胞凋亡。HUVECs Ox-LDL处理(100μg / mL),转染的控制向量(pcDNA3.1组)或pcDNA3.1-VGLL4 (p-VGLL4组),分别。(一)细胞在未经处理的可行性,控制,pcDNA3.1和p-VGLL4组。(b)的细胞凋亡HUVECs未经处理,控制,pcDNA3.1和p-VGLL4组。(c)的蛋白表达caspase-3和caspase-9治疗,控制,pcDNA3.1和p-VGLL4组。” ”是指与对照组相比 ,和“#”意味着与pcDNA3.1组相比 。GAPDH是用作计算蛋白质折叠一个不变的内部控制变化。
3.4。过度的VGLL4减轻Ox-LDL-Induced HUVECs功能障碍

VCAM-1、ICAM-1 MCP-1是重要的粘附影响心血管疾病的发生和发展的因素(16]。VCAM-1的蛋白表达,ICAM-1, MCP-1 Ox-LDL治疗后显著增加。相比之下,VGLL4显著下调VCAM-1的表达,ICAM-1, MCP-1 HUVECs(数字4(一)- - - - - -4 (d))。正如所料,伊诺的蛋白表达在Ox-LDL治疗组显著增加,而pcDNA3.1-VGLL4显著降低伊诺的表达,而以挪士的表达表现出相反的趋势(图4 (e))。

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(b)
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(c)
(c)
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图4
过度的VGLL4减轻Ox-LDL-induced HUVECs功能障碍。HUVECs Ox-LDL处理(100μg / mL)和转染控制向量(pcDNA3.1组)或pcDNA3.1-VGLL4 (p-VGLL4组),分别。(一)进行免疫印迹证实VCAM-1的蛋白表达水平,ICAM-1, MCP-1,进气阀打开,以挪士。(罪犯)的蛋白表达VCAM-1, ICAM-1,和MCP-1治疗,控制,pcDNA3.1, p-VGLL4组。(e)的蛋白表达NOS和以挪士治疗,控制,pcDNA3.1和p-VGLL4组。” ”是指与对照组相比 ,和“#”意味着与pcDNA3.1组相比 。GAPDH是用作计算蛋白质折叠一个不变的内部控制变化。
3.5。超表达VGLL4促进狂吠的表达和TEAD1 Ox-LDL抑制狂吠的表达和TEAD1

蛋白表达YAP和TEAD1显著增加pcDNA3.1-VGLL4组与对照组相比,pcDNA3.1(图组5(一个))。此外,YAP和TEAD1的蛋白表达减少Ox-LDL-treated HUVECs剂量依赖性的方式(图5 (b))。

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图5
超表达VGLL4促进TEAD1的表达和YAP Ox-LDL抑制TEAD1的表达和狂吠。(a)的蛋白表达TEAD1和控制,YAP pcDNA3.1, p-VGLL4组。(b)的蛋白表达TEAD1和HUVECs YAP细胞治疗与Ox-LDL 25岁,50岁,100年和200年μ克/毫升。” ”是指与对照组相比 ,和“#”意味着与pcDNA3.1组相比 。GAPDH是用作计算蛋白质折叠一个不变的内部控制变化。
3.6。Hippo-YAP / TEAD1信号通路参与HUVECs VGLL4的保护机制

结果表明,si-YAP和si-TEAD1显著降低了细胞的可行性HUVECs(图6(一))。此外,pcDNA3.1-VGLL4 HUVECs显著降低细胞凋亡率,而si-YAP和si-TEAD1逆转VGLL4的抑制效果(图6 (b))。此外,ROS的产生与pcDNA3.1-VGLL4转染后显著降低。相比之下,si-YAP和si-TEAD1逆转的抑制效应VGLL4 ROS(图生产6 (c))。如图6 (d),il - 6水平增加si-YAP和si-TEAD1治疗后与对照组相比在HUVECs(图6 (d))。更重要的是,si-YAP si-TEAD1 VCAM-1的蛋白表达增加,和逆转VGLL4的抑制效果(图6 (e))。

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图6
河马YAP / TEAD1信号通路参与HUVECs VGLL4的保护机制。HUVECs Ox-LDL处理(100μ24 h和g / mL)转染与pcDNA3.1-VGLL4 si-TEAD1,或si-YAP,分别。(一)每组的细胞生存能力。(b) HUVECs在每组的细胞凋亡。每组(c)的ROS水平。(d)每组的il - 6水平。(e)的蛋白表达VCAM-1每组中。” ”是指与对照组相比 ,和“#”意味着与pcDNA3.1-VGLL4组相比 。GAPDH是用作计算蛋白质折叠一个不变的内部控制变化。

4所示。讨论

研究表明,HUVECs已经用于许多心血管疾病模型,包括高血压、高血脂、冠心病和动脉硬化。此外,Ox-LDL-induced HUVECs模型是一种常用的模型在动脉粥样硬化的研究。我们以前的研究已经表明Ox-LDL-treatment促进炎症和HUVECs功能障碍[15]。同样,目前的研究已经得出了一致的结论。在这项研究中,我们发现VGLL4 Ox-LDL-induced减轻氧化应激,炎症,和HUVECs障碍和抑制细胞凋亡。此外,Hippo-YAP / TEAD1信号通路参与HUVECs VGLL4的保护机制。因此,VGLL4可能是心血管疾病的新目标。

先前的研究已经表明,VGLL4作为一个肿瘤抑制,扮演一个关键的角色在各种肿瘤的发展5,6,17]。然而,它在心血管系统中的作用尚未阐明。有必要进一步探索VGLL4在动脉粥样硬化的作用和机制,提供一个新的理论依据动脉粥样硬化的诊断和治疗。因此,本研究的目的是探讨VGLL4在动脉粥样硬化的发展中的作用及其分子机制。在这项研究中,发现VGLL4保护HUVECs免受炎症和损伤。有趣的是,金等。18)报道,VGLL4结合凋亡抑制蛋白(IAP),抑制心肌细胞凋亡,参与心脏的发展,从而保护心脏的生理功能的发展。巧合的是,乙酰化VGLL4控制新生儿的心脏发育通过调节YAP / TEAD1信号通路(14]。与此一致的是,我们发现VGLL4监管关键蛋白质的表达在Hippo-YAP / TEAD1信号通路,包括TEAD1和狂吠,进一步减轻动脉粥样硬化的发展。然而,VGLL4可能在动脉粥样硬化的发病机制发挥生物学作用通过调节其他信号通路。我们都知道,YAP / TEAD1 Wnt /密切相关β连环蛋白,所以接下来,我们将调查的规定VGLL4 Wnt /β连环蛋白信号通路。

目前,仍有争议的机制VGLL4调节Hippo-YAP / TEAD1信号通路(5,19,20.]。以前的研究已经表明VGLL4抑制YAP活动争夺VGLL4的绑定21,22]。而林等人发现另一个特殊的监管机制。他们发现VGLL4结合TEAD1加速退化TEAD1半胱氨酸肽酶。结果表明,VGLL4监管的活动YAP-TEAD1诱导TEAD1退化和抑制YAP-TEAD1的交互14]。因此,监管机制VGLL4 Hippo-YAP / TEAD1信号通路需要进一步探讨。

疾病的发生往往是相关的关键信号通路的功能障碍,如Hippo-YAP信号通路(23,24]。众所周知,Hippo-YAP信号通路中发挥着重要作用的发展,心脏和参与各种生理和病理过程,包括心血管开发、心脏肥大、血管再生和再生25- - - - - -27]。Healen等人已经证实心脏淘汰赛SAV1可以阻止Hippo-YAP / TEAD1信号通路,显著降低Yap磷酸化水平,并导致心脏肥大,这也验证了MST1/2和LATS2基因敲除小鼠(28- - - - - -30.]。此外,Hippo-YAP / TEAD1信号通路密切相关心血管疾病包括动脉粥样硬化。据报道,Hippo-Yap,中医作为目标,保护内皮细胞损伤和抑制细胞凋亡来减缓动脉粥样硬化的过程(31日]。巧合的是,我们发现Hippo-YAP / TEAD1信号通路参与HUVECs VGLL4的保护机制。可以推断,Hippo-YAP / TEAD1信号通路可能是广泛参与心血管疾病的监管网络。

总之,我们探索VGLL4的保护效果和特殊过程的分子机制。我们发现VGLL4缓解Ox-LDL-induced氧化应激,炎症,通过调节Hippo-YAP / TEAD1信号通路功能障碍。这表明VGLL4可能是一个潜在的治疗目标。

数据可用性

本研究中使用的数据集可从作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Kaicheng徐和Haomin赵也作出了同样的贡献。