扁桃体间充质干细胞的上清液有变应性鼻炎小鼠模型抗过敏作用

抽象

背景与目的。近年来，扁桃体来源的间充质干细胞(T-MSCs)因其易于获取，且比脂肪来源的间充质干细胞具有更强的免疫调节作用而受到各医学领域的广泛关注。然而，关于T-MSCs (T-MSCs- cm)的条件培养基对变应性鼻炎(AR)的影响尚无证据。因此，我们研究了t - msc - cm对AR小鼠模型的影响。方法。我们从人腭扁桃体中分离出T-MSCs并评估T-MSCs- cm的成分。在AR小鼠模型中观察t - msc - cm的作用，随机分为阴性对照组、阳性对照组和t - msc - cm治疗组(0.1 mg、1 mg、10 mg)。为了观察治疗效果，我们分析了鼻炎症状、血清免疫球蛋白(Ig)、炎症细胞和细胞因子的表达。我们还评估了T细胞受体信号，包括MAP激酶(ERK/JNK)、p65和NFAT1。结果。我们鉴定了TGF-的增加β1, PGE2，和HGF在t - msc - cm。在动物实验中，t - msc - cm治疗组鼻黏膜过敏症状及嗜酸性粒细胞浸润明显减轻，而总IgE及ova特异性IgE水平无显著差异。此外，我们发现，与(+)Con组相比，10mg t - msc - cm处理组IL-4 mRNA表达明显下降。在T细胞受体信号分析中，T- msc - cm抑制了MAP激酶的磷酸化、p65的易位和NFAT1的激活。结论。我们的研究结果表明，T-的MSC-CM显示对AR小鼠模型的局部免疫调节作用通过经由MAP的T细胞活化的抑制激酶，P65，和NFAT1。

1.简介

变应性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)是一种常见的慢性鼻腔疾病，表现为打喷嚏、流涕、发痒、鼻塞等症状[1]。它的特点是Th2免疫应答与嗜酸性粒细胞的增加的涌入[1]。到目前为止，各种治疗方案已被引入治疗变应性鼻炎，包括药物治疗，手术和抗原特异性免疫治疗2]。然而，症状的复发是停药和手术后常见的问题。此外，抗原特异性免疫治疗存在一定的局限性，如不良反应和无效结果[3]。因此，为了提高AR患者的长期疗效，需要新的治疗方案。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一种多能祖细胞，能够分化为多种细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞[4]。因此，那些能够促进各种结缔组织的维持和再生，包括骨，肌肉，脂肪，软骨和[五-7]。除了用于组织修复的潜力，越来越多的证据表明，干细胞通过它们与T淋巴细胞，B淋巴细胞，自然杀伤（NK）细胞，和树突细胞（DC）[相互作用也显示出强的免疫调节电位8-10]。出于这个原因，一些研究已经表明，从骨髓充质干细胞和脂肪组织中具有免疫功能的过敏性气道炎症的影响[11-14]。

最近，腭扁桃体组织也被鉴定为骨髓间充质干细胞的来源，与来源于骨髓和脂肪组织的间充质干细胞相比，扁桃体来源的间充质干细胞(T-MSCs)表达丰富的免疫调节蛋白[15，16]。此外，对于T-MSC的研究中所述的变性或炎性疾病的免疫调节作用[17-20]。我们以前的研究还表明了在过敏性鼻炎的小鼠模型中T-MSC的免疫调节效应[21]。然而，T-MSCs释放的条件培养基(t - msc - cm)比T-MSCs本身更具有制备和应用的可行性。因此，在本研究中，我们研究了T- msc - cm对变应性鼻炎小鼠模型的免疫调节作用，并评估了T- msc - cm对T细胞活化的抑制机制。

2.材料和方法

2.1。的扁桃体衍生的隔离间充质干从T-的MSC细胞（T-MSCs）的条件培养基的制备

从人腭扁桃体中分离T-MSCs [21，我们在扁桃体切除术后收集扁桃体组织，并在干细胞富集条件下培养，该条件由rmi -1640培养基(Gibco, Grand Island, NY)和1%的青霉素和链霉素(Gibco)组成，密度为 。次日，将细胞转移到无血清的RPMI-1640培养基。3天后，收集细胞上清液，离心除去细胞碎片。将上清液冷冻干燥，使T-的MSC-CM的浓度。被用于T-的MSC-CM代通道4和7之间的T-的MSC。本研究是通过檀国大学医院的机构审查委员会（2015-005）。

2.2。流式细胞术

T-MSCs用表面标记物进行流式细胞术鉴定。使用以下推荐稀释倍数的抗体:CD90-FITC(克隆5E10;CD105-PE(克隆266;CD31(克隆JC70A;Dako, Glostrup，丹麦)，CD34(克隆B1-3C5;Millipore, Billerica, MA)， CD45-FITC(克隆F10-89-4;Alexa Fluor 488抗小鼠IgG (Invitrogen公司)和Alexa面粉594抗兔IgG (Invitrogen公司)。

2.3。过敏性小鼠模型的实验设计

雌性BALB/c小鼠20只(4周龄，18-20 g;(-) Con(磷酸盐缓冲生理盐水- (PBS-)处理组; ),（+）CON（AR模型组， ),和0。1 mg, 1 mg, and 10 mg T-MSCs-CM groups (T-MSCs-CM-treated groups, each )。简单地说，实验组的小鼠被25致敏μ克的卵清蛋白（OVA; Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO，USA）溶解在300 μl of PBS in the presence of 2 mg of aluminum hydroxide gel as an adjuvant by intraperitoneal injection on days 0, 7, and 14. The negative control group was injected with PBS. And then, the mice were immunized with 5 μ在21-27天通过鼻腔灌注进行卵子测定。阴性对照组鼻腔使用PBS代替OVA。在t - msc - cm处理组中，t - msc - cm有20μl在试验期的第14天至18天和第21天至25天经鼻给予条件培养基。第29天通过颈椎脱位处死小鼠，所有实验重复3次。动物使用和照料委员会批准了所有的动物实验，我们严格遵循政府和国际动物实验指南(DKU-2014-039)。

2.4。评价症状评分、血清总免疫球蛋白E和ova特异性IgE

第28天最后的OVA攻击后，不知情的观察者记录打喷嚏的15分钟内的频率和鼻部摩擦。小鼠最后的OVA攻击后24小时处死，并收集组织样本。用3.7％多聚甲醛灌注后，从各组鼠的头整块除去，然后被固定在3.7％多聚甲醛。除去剩余的小鼠头部的鼻腔后，通过使用小刮匙被精心除去鼻粘膜。鼻粘膜立即浸入液氮中，随后由-70℃下贮存，直到反转录 - 聚合酶链式反应进一步使用。总的和OVA特异性免疫球蛋白E（IgE）的血清水平通过固相酶联免疫测定法测量。

2.5。细胞因子和总IgE的组织匀浆测量

脾的单细胞悬浮液在24孔组织培养板中的终浓度接种 通过使用RPMI-1640培养基（Gibco，格兰德岛，NY）。将细胞在CO与OVA一起温育₂37℃培养箱保存72小时，-70℃保存直到细胞因子测定。细胞因子使用三明治酶联免疫吸附试验试剂盒(R&D Systems, Minneapolis, MN)在培养上清中按照说明书进行测定。测定450nm处的光密度后，白细胞介素- (IL-) 4、IL-5、IL-6、IL-17、干扰素- (IFN-)的浓度γ， eotaxin-2由标准曲线插值确定，所有数据均以毫微克/毫升表示。

2.6。定量实时PCR

使用TRIzol试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA)从各组小鼠鼻腔粘膜提取总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad Laboratories;大力神,CA)。信使RNA (mRNA)表达分析采用Applied Biosystems公司7500 Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)。表中细胞因子和趋化因子对应的引物和探针1均购自Applied Biosystems公司。

2.7。Western印迹分析

使用BCA试剂盒(Pierceprotein限量®Inc.， BCA蛋白检测试剂盒，Thermo Scientific USA)，共50个μSDS-PAGE的克蛋白质通过后电泳分离，将硝酸纤维素膜（Hybond ECL，GE医疗集团生命科学，UK）被转移。The protein is a membrane to transfer 3% skim milk (BD Difco, USA) after each block with diluted primary antibodies phospho-ERK (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA, USA), ERK (1 : 2,000, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), phospho-JNK (1 : 500; Santa Cruz, CA), JNK (1 : 500; Santa Cruz, CA), p65 (1 : 1,000; Cell Signaling, Danvers, MA, USA), NFAT1 (information), andβ-actin (1 : 10000; Sigma-Aldrich, USA) antibody overnight. Tris-buffered saline with Tween 20 (+0.1% Tween 20; TBS-T) as a cleanser and secondary antibodies ((p)-ERK, p38, (p)-(p)-p65, HRP-anti-rabbit; p-JNK, HRP-anti-goat; andβ肌动蛋白，JNK，HRP-抗小鼠）触发的反应。ECL Western印迹和检测溶液（Amersham公司的检测试剂; GE医疗生命科学，UK）与Gel Doc凝胶图像分析系统（Bio-Rad公司，大力神），将其使用的蛋白条带证实反应。

2.8。统计分析

采用GraphPad Prism 4软件进行统计分析。结果显示为 。一曼 - 惠特尼比较两组的结果。一个< 0.05为差异有统计学意义。< 0.05用”表示。“;值<0.01被“指示”和<0.001由“”。

3.结果

3.1。扁桃体间充质干细胞的表征

为了表征T-MSC的轮廓，我们进行了流式细胞术分析（图图1（a）)。我们发现，细胞均与人MSC标记，如CD90（THY-1）和CD105（内皮糖蛋白）标记的，而有用于人内皮细胞标记物（CD34，CD31，和KDR）和造血细胞标记的阴性表达（CD45）。基于表面抗原表达，我们的研究结果表明，扩增的细胞包括大量人口T-MSC的，但这些细胞不与内皮细胞和造血细胞污染。接下来，我们评估T-的MSC-CM，其中预计将有免疫调节作用的成分。在这项研究中，我们测量前列腺素E2（PGE2）的浓度，转化生长因子β（TGFβ)，肝细胞生长因子(HGF)， IL-10，一氧化氮(NO)，吲哚胺吡咯2,3-双加氧酶(IDO)(图)图1（b）)。我们发现TGF-的浓度β1、PGE2、HGF升高超过200 pg/ml，而IL-10、NO、IDO的升高可以忽略不计。

3.2。扁桃体来源间充质干细胞条件培养基的免疫调节作用

为了研究在变应性鼻炎T-的MSC-CM的治疗潜力，我们使用过敏性鼻炎的鼠模型（图2(一个))。小鼠模型显示，(-)组的症状评分为23.6分，(+)组为53.2分，0.1 mg t - msc - cm组为42.2分，1 mg t - msc - cm组为33.2分，10 mg t - msc - cm组为35.0分。这些结果表明，与(+)Con组相比，1mg或10mg t - msc - cm治疗组的症状评分明显下降(图)图1（b）)。然而，有在总IgE或OVA特异性IgE（+）CON和T-MSC的-CM处理的组之间没有差异显著（图1（C））。We also observed that the numbers of infiltrated eosinophils and neutrophils were significantly decreased in the 1 mg or 10 mg T-MSCs-CM-treated groups compared to the (+) Con group (Figures1（d）和1(e))。接下来，为了验证t - msc - cm治疗后嗜酸性粒细胞浸润的变化，我们评估了鼻细胞因子mRNA表达谱(图)1（F））。的（+）CON组具有增加的IL-4，IL-5，IL-6，IL-17，IFN-γ和γmRNA expression in the nasal mucosa, whereas only the 10 mg T-MSCs-CM-treated group showed a significantly reduced expression of IL-4 mRNA level, compared to the (+) Con group.

3.3。扁桃体来源间充质干细胞条件培养基对T细胞活化的抑制作用

为了研究T- msc - cm是否能抑制T细胞的激活，我们评估了CD3和CD28抗体刺激Jurkat T细胞的T细胞受体信号，如MAP激酶(ERK/JNK)、p65和NFAT1转录因子(图)3)。我们检测根据蛋白质印迹T-的MSC-CM的浓度ERK / JNK磷酸化，p65的磷酸化，和NFAT1活化的表达减少。一个dditionally, the phosphorylation of ERK/JNK and P65 was significantly decreased by 10 mg T-MSCs-CM, compared with only anti-CD3/CD28-stimulated Jurkat T cells.

4。讨论

据我们所知，这是第一次研究，以评估T-的MSC-CM在为AR的小鼠模型的治疗效果。在本研究中，我们发现，T-的MSC-CM显示出增加的TGF-ββ1，这被认为是免疫调节因子PGE2，和HGF表达。在动物研究中，在加入的T-的MSC-CM诱导的（+）CON和T-MSC的-CM处理的组之间的显著降低过敏症状，嗜酸性粒细胞浸润，和Th2细胞因子（IL-4）的表达，虽然有总IgE和OVA特异性IgE水平没有影响。此外，我们观察到，T细胞受体信号传导，诸如MAP激酶（ERK / JNK），P65，和NFAT1的T-的MSC-CM处理的组中被抑制，相对于（+）Con组。因此，T-MSC的-CM可能具有通过经由MAP的T细胞活化的抑制上过敏性炎症的局部免疫调节效应激酶（ERK / JNK），P65，和NFAT1转录因子。

人们已经知道，干细胞具有通过表面分子和可溶性介质，以调节免疫反应，然后协助将细胞在避免了对成功植入同种异体反应的能力[22-24]。骨髓和脂肪组织被认为是间充质干细胞的主要来源。最近有报道称人腭扁桃体是间充质干细胞的来源，而t -间充质干细胞也具有潜在的免疫调节作用[25]。与MSC的其他来源的对比，我们可以很容易地获得人腭扁桃体组织扁桃腺切除手术后，常用进行外科手术，儿童[26]。这意味着人类腭扁桃体是一个有吸引力的MSC来源的临床应用，因为组织收集不需要不必要的侵入技术。然而，迄今为止，t - msc - cm与T-MSCs的作用还没有得到充分的研究。既往对慢性结肠炎模型的研究显示，t - mscs - cm治疗组在免疫调节作用方面与t - mscs治疗组效果相当[27]。与此相一致，增加对AR小鼠模型T-的MSC-CM的表现出相似的免疫调节作用，以及关于对AR小鼠模型T-的MSCs以前的研究比较。它是一种临床上有意义的发现，因为T-的MSC-CM是比较容易准备和管理病人。

MAP激酶家族包括ERK、p38和JNK。MAP激酶通路是T细胞受体刺激诱导的主要通路，在T细胞的发育和功能中发挥重要作用[28，29]。NF -κB /相对家族包括五个成员，包括P50，P52，P65（REL-A）中，c-Rel的，和Rel-B蛋白质。NF-κ乙亚基在调节T细胞的发育和效应功能[发挥具体作用30.，31]。在这些，形态最丰富的NF-κBκ乙通过病理刺激激活是P65：P50异二聚体[32]。的转录因子的NFAT家族由五个成员（NFAT1-NFAT5）和T细胞表达四分之三的钙调节NFAT蛋白质，如NFAT1，NFAT2，和NFAT4的。NFAT蛋白质被激活下面的T细胞受体连接，并且因此，这些蛋白质的T细胞分化和发育[关键调节33，34]。有趣的是，我们的研究结果显示，t - msc - cm抑制了MAP激酶的磷酸化，p65向细胞核的迁移，并降低了NFAT1转录因子的激活。提示T- msc - cm可能通过抑制T细胞的激活而表现出对过敏性炎症反应的免疫调节作用。

总之，t - msc - cm在AR小鼠模型中表现出部分免疫调节作用。此外，T-MSCs-CM的成分，如TGF-β1，PGE2和HGF具有的T细胞活化的通过T细胞受体信号的抑制的抑制效果。因此，可以预期T-的MSC-CM的给药，而不是T-的MSC本身可以施加在患者的AR具有治疗效果。这个应用程序是可取的，因为它会更容易进行，并也会受到副作用较少陪同。

数据可用性

作者证实，支持这项研究发现的数据可以在文章中找到。

利益冲突

作者宣称，他们有无相关利益冲突。

作者的贡献

In-Su Park和Ji Hye Kim对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

这项研究是由来自韩国的健康科技R＆d项目，卫生部和福利，韩国（HI14C2161）共和国和由韩国政府资助的韩国国家研究基金会（NRF）的赠款（MEST）（第NRF-2018R1D1A3B07048683支持)。

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