在胶原抗体诱导的关节炎小鼠模型中评估孤雌内酯对炎症、骨丢失和胶质细胞的影响

摘要

类风湿性关节炎的特征是慢性炎症反应，导致关节破坏和明显疼痛。尽管有一系列治疗方法可用于控制类风湿性关节炎的疾病活动，但尽管炎症受到抑制，骨破坏和关节疼痛仍然存在。本研究旨在评估单性酚内酯的作用（PAR）对轻度胶原抗体诱导的关节炎（CAIA）小鼠模型的爪子炎症、骨破坏和疼痛样行为的影响 mg/kg或4 每日1次，每周一次，评估机械性超敏反应，最后用微型CT评估足的骨体积和肿胀度，用PAW组织切片评估炎症和破骨细胞样前体细胞。对脑的头端腹髓（RVM）区域进行胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和离子钙结合接合器分子1（IBA1）染色，以评估胶质反应性。CAIA小鼠的Paw评分在第5-10天增加，在第1天降低 mg/kg和4 在8-10天时，mg/kg的PAR，桡骨腕关节骨表面和后肢软组织内的破骨细胞样细胞在PAR治疗后显著降低。 ）.PAG和RVM中GFAP-和iba1阳性细胞在1 mg/kg处理后显著降低( 和 ,分别为4毫克/千克（ 和 ,分别)。在腰脊髓中，4 mg/kg PAR ( ）.结果表明，在轻度CAIA小鼠模型中，低剂量和中剂量PAR对爪炎症、破骨细胞存在和胶质细胞反应均有抑制作用。

背景

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性全身性疾病，其特征是关节炎症、滑膜增生以及软骨和骨骼的相关破坏。疼痛与关节破坏有关，是类风湿性关节炎患者报告的最令人衰弱的症状之一[1.,2.]RA的发病机制包括免疫细胞慢性浸润到滑膜关节和产生促炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子α（TNF）-α），白细胞介素-1β（IL-1β），以及白介素-6（IL-6）[3.]．这些细胞因子不仅延长滑膜关节内的炎症反应，但它们的生产过剩促进骨破坏[4.,5.]．

上述炎性细胞因子已被证明使周围神经敏感，导致疼痛敏感性增加[6.]此外，神经胶质细胞已被确定为慢性炎症状态下中枢敏感性和超敏反应的关键驱动因素[7.]．先前有报道称，炎性关节炎小鼠出现机械性超敏反应，也观察到胶质细胞数量增加[8.]．然而，在炎症症状出现之前就观察到机械过敏，这表明RA炎症和疼痛的时间不一定一致[8.]．被称为痛觉过度的夸张疼痛，即使在没有临床症状的类风湿性关节炎患者中也会持续存在[9]．正如在RA中观察到的，在无外周炎症的情况下存在疼痛之间的脱节支持了新的神经免疫体证据(Grace等人综述了[10.]）。

目前，缓解疾病的抗风湿药物(DMARDs)针对炎症，允许慢性骨侵蚀进展。直接靶向破骨细胞分化已被证明可以减缓类风湿性关节炎患者骨侵蚀的进展[11.];然而，滑膜关节的炎症随之而来。到目前为止，还没有足够的研究同时评估抗炎治疗对炎症、关节破坏和神经胶质反应的影响。

爬山虎内酯（PAR）是一种倍半萜内酯，存在于菊科药用植物中，包括白芍[12.]，并且被报道具有抗癌以及抗炎，antibone骨吸收，和镇痛在两个动作在体外和体内模型(13.–16.]．在体外， PAR已被证明可以防止破骨细胞的形成和骨吸收[17.，并抑制IL-1的作用β和tnf-α对人体软骨细胞[18.]，这是RA发病机制的关键驱动因素。体内研究表明，PAR(0.5和1 mg/kg)可阻断脂多糖诱导的骨溶解[17.]，并抑制磨损颗粒诱导的小鼠颅骨模型表面骨丢失[19.]．Within a collagen-induced arthritis (CIA) rat model, PAR 1 mg/kg reduced inflammation and pannus formation [18.]．值得注意的是，没有发现骨侵蚀明显减少，也没有对机械过敏进行研究[18.]．在一项针对偏头痛患者的临床试验中，发现PAR没有重大安全问题[20.]，但仍需进一步研究。

据我们所知，目前的研究还没有进行调查的效果的PAR，直接或间接地对中枢神经系统和疼痛，胶原蛋白抗体诱导的关节炎（CAIA）小鼠模型中。因此，目前的研究旨在调查PAR（低，中剂量）是否会减少在轻度CAIA小鼠模型炎症，骨质流失，机械过敏，和胶质反应。

2.方法

本研究得到了阿德莱德大学动物伦理委员会(M-2015-255)的批准，并符合澳大利亚国家卫生和研究委员会(澳大利亚)《动物研究和训练护理实践规范》(2014)。小鼠被安置在批准的条件下，以12小时的光照-黑暗周期饲养。疾病诱导前给予小鼠自由饮水和食物，并给予防水软橡胶垫褥作为床上垫褥。

2.1.胶原抗体诱导的关节炎模型

32岁的雌性BALB / c小鼠六到八周获得阿德莱德大学的实验动物服务和随机分配控制(没有关节炎或治疗),CAIA(无治疗关节炎),CAIA + PAR - 1毫克/公斤(关节炎治疗1毫克/公斤PAR),和CAIA + PAR 4毫克/公斤(关节炎治疗4毫克/公斤标准)。

关节炎是通过尾静脉注射诱导的，共150例 μl（1.5） mg/只小鼠）的抗II型胶原单克隆抗体混合物（Arthrogen CIA Arthritogenic单克隆抗体，Chondrex Inc.，Redwood，WA，USA），然后腹腔注射20 μ升（10 μg /鼠标)大肠杆菌第3天的脂多糖(LPS)，如前所述[21.–23.].对照组动物注射200 μ升磷酸盐缓冲在两个时间点的盐水（PBS）。

PAR (Enzo Life Sciences, Inc.， Sapphire Bioscience, NSW, Australia)的剂量为1 mg/kgμ的升10％DMSO于PBS [18.，或在200毫升中为4毫克/公斤μ从第4天到第10天，通过腹腔注射PBS中的0.8%二甲基亚砜，每天交替两侧注射。使用经批准的关节炎研究临床记录表，每天监测小鼠的体重和一般健康因素。每天检查临床足肿胀是否存在红肿、压痛、肿胀和炎症所有爪子，由两名盲法观察者使用之前描述的临床爪子评分方法[22.,24.]．

2.2.机械敏感性评估

当BALB/c小鼠对行为试验产生耐受性时，每隔一天（即第2天、第4天、第6天、第8天和第10天）使用von Frey爪子退出试验评估后爪子的机械敏感性[8.,25.]．老鼠被放置在底部有金属网的塑料笼子里，让它们的后爪可以完全接触到，并允许它们进行15分钟的行为调节。行为测试遵循了之前发表的Dixon上-下方法，并计算出了50%的爪子缩回阈值[25.]．由于CAIA诱导后，各爪间炎症的严重程度不同，因此确定后爪脱爪概率最低的50%进行机械过敏检查[22.,23.]．

2．3.Microcomputed断层扫描分析

第11天，采用4%多聚甲醛麻醉(175 mg/kg戊巴比妥钠)进行心脏灌注。然后收集大脑、脊髓和爪子组织，并进行48小时的显微ct和组织病理学评估。

使用微型计算机断层扫描（micro-CT）扫描仪（SkyScan 1076，比利时Kontich Bruker）评估前爪和后爪的骨体积（BV）和爪体积（PV，软组织肿胀指标）[22.,26.]．扫描设置如下:x射线源电压55 kV，电流180μA、 各向同性像素大小8.5 μm、 0.5 mm厚的铝过滤器，0.6旋转步长，帧平均值为1，扫描时间为35分钟。重建所有爪子的横截面图像（N-Recon软件，比利时Kontich Bruker），以8位格式保存，并沿图像的上下方向与每个爪子的长轴重新对齐（Dataviewer，比利时康提奇布鲁克），如前所述[26.]．

对于前爪，感兴趣的圆柱形体积(VOI;采用直径4.5 mm，长度2.4 mm的280个连续断面，从桡腕关节生长板远端200个断面(1.7 mm)开始，向近端80个断面(0.68 mm)，用于骨和软组织分析[22.]．在后爪中，从跟骨后表面延伸至跗骨和跖骨近端的600个断面(5.1 mm长)用于BV分析，并在跟骨、跗骨和跖骨周围(不包括胫骨和腓骨)绘制多边形VOI。PV分析采用圆柱形VOI, 200个横截面(直径5.5 mm，长度1.7 mm)，从跖骨最后侧面延伸，不包括跟骨和长方体。对于这些VOIs, BV (mm^3.）和PV（毫米^3.)采用统一阈值进行三维定量(CT分析仪软件，V1.15.40, Bruker) [22.,26.]．

２.４.桡腕关节和后爪的组织学分析

前和后爪，用10％乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙，加工成石蜡和矢状切片切口（5 μm） 常规苏木精-伊红（H&E）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色。使用先前发布的半定量评分方法，对H&E切片中是否存在炎性细胞、软骨和骨降解以及血管翳形成进行组织学评估[27.,28.]．

多核TRAP阳性细胞（>3核）的数量在一个一致的感兴趣区域（2.16）进行计数 嗯^2.），以包括骨表面上发现的细胞[27.]，以及r关节和后爪周围的软组织[22.]．

2．5．脊髓和脑组织的组织学分析

免疫组化检测神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和离子化钙结合接头分子1 (IBA1)μm)腰椎脊髓(L3-L5)和大脑。切片在100%乙醇中脱蜡和脱水，然后用0.5%过氧化氢酶去除内源性过氧化物酶活性。玻片用1x PBS (pH 7.4， 对于GFAP和1x PBS+0.3%Triton X（BOH化学品，澳大利亚，IBA1分钟)。在柠檬酸盐(0.1 mol/l, pH 6.0)中热介导抗原检索后，非特异性结合被3%的正常马血清阻断(NHS;30分钟。主要抗体(GFAP;Dako 72.5μg/ml，目录#Z0334和IBA1;Wako 0.05μ克/μl，目录#019-19741)在室温下孵育过夜，然后用山羊生物素化抗兔IgG抗体孵育(6μg / ml;媒介实验室)30分钟。1次PBS/1次PBS+0.3% Triton X洗涤后，玻片与链霉亲和素过氧化物酶结合物孵育(2μg / ml;赛默飞世科学）和二氨基联苯开发，并用苏木复[29.]．

在腰椎脊髓内计算IBA1阳性细胞（0.38mm^2.感兴趣的区域)。PAG (2.72 mm)中也有阳性细胞^2.感兴趣区域）和RVM（0.079 嗯^2.，因为这些区域已被证明有助于伤害性感受的处理[30.,31.]．使用Fiji软件和colour deconvolution method统计腰椎脊髓和大脑相同区域的gfap阳性细胞[32.的门槛 像素^2.和 像素^2.,分别。

2.6。统计分析

统计分析使用GraphPad Prism®软件(V7.03;GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)和SPSS Statistics (V25;IBM SPSS软件，新南威尔士州，澳大利亚)。用双向方差分析评估足部炎症。对于von Frey分析，采用线性混合效应模型，并使用方差分量协方差结构随时间重复测量。通过检验残差和预测值的直方图和散点图，发现线性模型的假设是成立的。1 =对照组，2 = CAIA, 3 = CAIA+PAR 1 mg/kg, 4 = CAIA+PAR 4 mg/kg，日交互作用(试验日)。对于micro-CT、爪子和大脑组织学数据，使用非参数Kruskal-Wallis检验分析组间差异，如果有显著差异，则使用Mann-Whitney分析组间差异测试。对腰椎脊髓细胞计数进行曲线下面积(AUC)分析。事后评估统计学意义 -测试组之间。显示的所有值为 平均值（SEM）和显着性水平设为 .

3.结果

3.1。评估局部爪子炎症和机械超敏反应

在LPS处理后的第3天，CAIA诱导的所有疾病组的爪子显著发红、触痛和炎症(图)1（a））.相比于从第5天的对照小鼠到第10天CAIA小鼠表现出更大的显著爪评分（ ;数字1（b）在第8, 9天和第10天，PAR 4 与CAIA小鼠相比，mg/kg处理的小鼠的paw评分显著降低( , ,和 ,分别;数字1（b）第10天，票面金额1 与CAIA小鼠相比，mg/kg处理的小鼠的paw评分也显著降低( ;数字1（b））.在对照组和CAIA小鼠之间，以及CAIA小鼠与PAR 1 mg/kg和4 mg/kg处理小鼠之间，爪脱阈值没有显著差异(图)1 (c)）.

３.２．骨体积(BV)和足体积(PV)的显微ct分析

CAIA小鼠桡腕关节中测得的BV显著降低( 毫米^3.)与对照组小鼠相比( 毫米^3.; ;数字2(一个)和2 (b)）.PAR 1毫克/公斤- ( 毫米^3.)及4毫克/公斤- ( 毫米^3.)治疗小鼠的桡腕关节BV较CAIA小鼠略低，但无统计学意义。

CAIA小鼠的后爪BV显著降低( 毫米^3.; )及PAR 1毫克/公斤- ( 毫米^3.; )及4毫克/公斤- ( 毫米^3.; )与对照组小鼠( 毫米^3.图形2 (c)）.PAR 4 mg/kg处理的小鼠后爪BV明显低于CAIA处理的小鼠( ;数字2 (c)）.在后爪舟状骨的三维微ct图像上可见凹陷的证据(图)3.)，有和没有PAR治疗的CAIA组。

CAIA小鼠（ 毫米^3.)的桡腕关节PV明显高于对照组小鼠( 毫米^3., ;数字2 (d)）.PAR 1 mg/kg-和4 mg/kg-处理小鼠的桡腕关节PV测量值较低( 毫米^3.和 毫米^3.分别与Caia小鼠相比。但是，这并没有显着差异（图2 (d)）.PV在PAR治疗组之间没有差异。

在CAIA小鼠的后爪中也观察到PV显著增加( 毫米^3.和PAR 1 毫克/千克-( 毫米^3.)及4毫克/公斤- ( 毫米^3.)，与对照组小鼠( 毫米^3.; ;数字2 (e)）.cia和PAR处理组及PAR 1 mg/kg和4 mg/kg处理组后爪PV均无显著差异。

３．３．桡腕关节及后爪的组织学分析

图中为桡腕关节H&E染色的代表性图像4(一)虽然PAR 1 mg/kg或4 与CAIA小鼠相比，mg/kg治疗组在桡腕关节的细胞浸润、软骨和骨降解以及血管翳形成方面的得分降低，这在统计学上并不显著（图1）4 (b)）.类似地，所有幼肠和癌癌群之间的后爪中的组织学评分没有显着差异（图4（c））.

与对照组小鼠相比，在CAIA和PAR处理组小鼠的所有爪骨表面和周围软组织中观察到大量多核trap阳性细胞( ;数字5（a）–图5（e））.与CAIA小鼠相比，PAR 4 mg/kg处理小鼠桡腕关节骨表面多核trap阳性细胞数量显著降低( ;数字5（b）)，且与CAIA小鼠和PAR 1 mg/kg处理的小鼠相比，周围软组织内多核trap阳性细胞数量减少，然而，这没有统计学意义(图)5（c））.与PAR 1 mg/kg处理的小鼠相比，PAR 4 mg/kg处理的小鼠后爪骨表面的多核trap阳性细胞数量更少，然而，这在统计学上没有显著性意义(图)5（d））.在后爪周围的软组织中，与CAIA小鼠相比，PAR 1 mg/kg-和4mg /kg处理小鼠的多核trap阳性细胞数量显著降低( 和 ,分别;数字图5（e））.然而，PAR处理组之间没有显著差异。

3.4。神经胶质细胞的组织学分析

3.4.1.GFAP在中枢神经系统内的表达

图中为脊髓腰椎区GFAP染色和PAG的代表性图像图6（a）和6（b）,分别。与对小鼠相比，在CAIA小鼠中，在腰椎脊髓，PAG和RVM中观察到显着大量的GFAP阳性细胞（ , ,和 ,分别;数字6（c）–6（e））.PAG中gfap阳性细胞数量显著减少，在PAR 1 mg/kg- ( 细胞/毫米^2.)及4毫克/公斤- ( 细胞/毫米^2.)，与CAIA小鼠( 细胞/毫米^2., ;数字6（d））.在PAR 4 mg/kg处理的小鼠中，gfap阳性细胞的减少明显大于PAR 1 mg/kg处理的小鼠( ;数字6（d））.在RVM中，在PAR 1 mg/kg- ( 细胞/毫米^2.)及4毫克/公斤- ( 细胞/毫米^2.）处理的小鼠相比，CAIA小鼠（ 细胞/毫米^2., 和 ,分别;数字6（e））.

3.4.2。IBA1在中枢神经系统中的表达

图中为腰椎脊髓内IBA1染色和PAG的代表性图像7（a）和7（b）,分别。与对照组小鼠相比，CAIA小鼠腰椎脊髓、PAG和RVM中iba1阳性细胞数量显著增加( , ,和 ,分别;数字7（c）–7 (e)）.在4mg / kg处理的小鼠中，腰椎脊髓中的IBA1阳性细胞数量显着较低（ 细胞/毫米^2.）与Caia小鼠相比（ 细胞/毫米^2., ;数字7（c）PAR 1中PAG中IbA1阳性细胞显著减少。 毫克/千克-（15.83） ± 0.72个细胞/毫米^2.)和4 mg/kg-(13.25±0.86细胞/mm^2.）处理的小鼠相比，CAIA小鼠（ 细胞/毫米^2., 和 ,分别;数字7（d））.与PAR 1 mg/kg处理的小鼠相比，PAR 4 mg/kg处理的小鼠中iba1阳性细胞的数量也显著降低( ;数字7（d））.此外，在RVM中，在PAR 1 mg/kg- ( 细胞/毫米^2.)及4毫克/公斤- ( 细胞/毫米^2.)，与CAIA小鼠( 细胞/毫米^2., 和 ,分别;数字7 (e)）.

4.讨论

这项研究利用了商业上可获得的和建立良好的CAIA小鼠模型，该模型可快速启动与RA相似的致病特征[23.]．根据我们实验室内的先前研究诱导了较温和的疾病形式[21.,26.].轻度CAIA模型中存在Paw炎症，从第5天到第10天，与非疾病对照组相比，Paw得分显著增加。这些Paw得分在第8天最大，与先前报告的疾病时间线一致[23.]．爪子仍然在模型的结论中发炎，如婴儿小鼠在评估时的控制比较离体微CT。如所预期的，温和的CAIA模型导致轻度关节破坏并与非患病对照时显著降低BV在腕关节和后爪。神经胶质反应性在脊柱和脊髓上区域两CAIA小鼠内增大，表明该模型是不仅能够外围形成炎症模型，而且还具有一个中央神经免疫的影响。

目前的研究发现，每日1 mg/kg和4 mg/kg的PAR可显著减少CAIA小鼠所有爪部的局部炎症。与CAIA小鼠相比，PAR 4 mg/kg从第6天开始降低了局部炎症，从第8天到第10天进一步降低。PAR 1 mg/kg对局部炎症的影响较小，第8天和第9天的爪子评分证明了这一点。第10天，两组局部炎症水平相同。

作为一种客观的炎症测量方法，PV的Micro-CT分析在终点时与爪子评分一致。CAIA小鼠的PV与PAR 1 mg/kg-或4 mg/kg处理小鼠相似，PAR处理小鼠的桡腕关节PV较CAIA小鼠略低，但差异不显著。虽然不显著，但后爪PV在PAR 1 mg/kg处理的小鼠中略高。这是出乎意料的，但可以归因于全身使用CAIA和PAR后足部炎症的大变异性，以及所有CAIA组在终点测量的炎症水平较低。

桡腕关节和后爪在端点处的组织学分析也支持PAR治疗后局部炎症的减少。在PAR处理的小鼠中，与CAA小鼠相比，炎症细胞浸润和血管翳形成减少，但在PAR 1之间没有观察到差异。 mg/kg-和4 Mg/kg处理的小鼠，这是出乎意料的，因为先前的研究已经显示了PAR 1。 mg/kg可抑制TNF的促炎作用-α和IL-1β，从而减少CIA大鼠后爪滑膜关节的炎症和翳的形成[18.]．

面值1毫克/公斤,4毫克/公斤治疗不影响BV在前面和后爪的老鼠,而TRAP-positive骨表面的多核细胞减少桡腕关节和后爪的PAR 1 mg / kg-treated老鼠,PAR 4毫克/ kg-treated老鼠表现出更大的减少。尽管micro-CT和组织学结果并不相互支持，但它们都与之前的一项研究一致，该研究表明，在种植体周围骨溶解的小鼠颅骨模型中，PAR处理对减少聚乙烯颗粒诱导的骨表面吸收有显著影响，仅限于骨表面。但对整体BV无影响[19.]．同样,在当前的研究中,有可能暗示减少骨吸收的减少TRAP-positive细胞(骨表面)所看到的微观分析可以部分地补偿由大量的骨头(体积)分析了ct机在桡腕关节和后爪。可能需要进一步量化前、后爪腕骨和跗骨的BV，以显示在使用PAR治疗后，CAIA小鼠的BV在体积上的可量化骨损失减少。

目前的研究发现，1 mg/kg和4 mg/kg的PAR可减少局部爪炎，但前爪和后爪的总BV没有变化。这与之前的一项研究一致，该研究报告了在CIA大鼠模型中，1 mg/kg PAR可减少炎症，但对整体骨流失影响甚微[18.]．这可以归因于PAR的低剂量在两个治疗组中使用，如在复杂CAIA模型中，低剂量的PAR可能无法同时抑制局部炎症和随后的炎症效果已在刺激骨破坏。

PAR处理没有降低CAIA小鼠的机械过敏反应，证据是爪脱阈不一致。尽管存在轻微的足部炎症，但从2-8天开始，CAIA小鼠的足部退出阈值与未患病的对照组阈值保持一致。这与之前的一项研究不一致，该研究显示在BALB/c小鼠中度CAIA模型中，伴随关节炎症发作的强大机械过敏[8.]．在该研究中，使用von Frey评估的爪退阈值在关节炎症减轻4周后没有恢复到基线[8.]．值得注意的是，在目前的研究中，没有调查缓解阶段，研究之间观察到的差异可能是由于内源性镇痛的发生。先前的小鼠疼痛模型已经检测了内源性镇痛的效果，其中通过von Frey评估的机械过敏达到基线戒断阈值评分;然而，在给予阿片类受体拮抗剂纳洛酮后，情况发生了逆转[33.]．这表明潜在的疼痛敏感也可能发生在炎症性疼痛模型中，如CAIA。未来的研究应包括自动步态分析，如t型台评估[34.]在评估炎症性关节炎的动物模型中的疼痛状行为，因为它们检查肢体保护时，关节和神经病疼痛中的常见临床症状[35.]．此外，作为自发性疼痛评估，人行道的步态分析可以更准确地检查疼痛的更复杂的决策[35.]．

由于观察到小胶质细胞和星形胶质细胞与神经病理性疼痛相关，因此假设PAR治疗小鼠的机械性超敏反应减少[36.,37.]．Lampa等人的发现表明，炎症性实验性关节炎小鼠模型的痛觉是由于外周和中枢神经系统的变化[38.]．我们建议，外周炎症促进通过我们CAIA模型中增加神经胶质反应观察中心适应。卡皮茨克等。回顾2011多项研究表明阿片受体在炎症动物模型[被激活39.]．因此，我们的胶质细胞的增加可能与由于外周免疫效应细胞变化引起的外周镇痛反应引起的机械超敏反应的变化不一致。我们的结果提示PAR作为神经免疫介质，尽管这没有被直接评估。

PAR以前已被证明在穿过血脑屏障时有效[40,41.];然而，很少有关于疼痛和炎症的研究同时检测了PAG和RVM中的胶质反应。我们的研究结果表明，在par处理的小鼠中脊髓和脑胶质细胞的反应性降低。在PAG和RVM中，与CAIA小鼠相比，在PAR 1 mg/kg-和4 mg/kg处理的小鼠中GFAP-和iba1阳性细胞显著减少。然而，在腰椎脊髓中，仅在PAR 4 mg/kg处理的小鼠中观察到iba1阳性细胞显著减少。这些发现表明，在CAIA小鼠中，PAR 1 mg/kg和4mg /kg对减少脊髓上神经胶质反应最有效，而不是腰椎脊髓。

在CD1神经病变小鼠模型中，已经观察到疼痛感知和神经胶质反应的性别特异性差异。Vacca等人观察到，在腰椎L4-L5脊髓内，与雄性小鼠相比，雌性小鼠在星形胶质细胞和小胶质细胞中的反应性增加[42.]．此外，Vacca等人测量了机械超敏反应，结果表明雌性小鼠比雄性小鼠恢复到基线需要更长的时间[42.]Doyle等人发现，在PAG内，雌性Sprague-Dawley大鼠的小胶质细胞反应性水平比雄性大鼠高[43.]．在今后的研究中，雄性小鼠CAIA的纳入将信息进行调查，如果性别特异性差异存在于CAIA模型。

与过去的研究相比，关于骨质流失和炎症的矛盾发现[18.,19.也可能是用于诱发CAIA的方法的结果。尽管CAIA模型在BALB/c小鼠中有很高的外显率，但由于全身给药，关节受到随机影响[23.]．因此，响应于两个疾病和治疗的大鼠的变异可以解释在目前的研究结果。也有可能是在吸收变异性和可能，也影响了结果的循环内PAR的活性代谢物的可用性。由于PAR没有健康小鼠进行评估，我们无法确定在缺乏外周炎症的中枢神经系统PAR的效果。此外，机械性超敏反应应评估的症状发作之前和之后缓解期，因为它是更临床相关的。为了实现更有效的结果，在复杂体内环境、通过关节内注射抗原靶向特定关节的动物模型，以及关节内注射PAR，可能为未来的研究提供更好的策略。

5.结论

本研究表明，在轻度CAIA小鼠模型中，1mg /kg或4mg /kg PAR可抑制局部炎症，并独特地证明了外周炎症对脊髓和脊柱上伤害性感受加工通路的影响。进一步的研究涉及到新的策略，以研究骨和关节的胶质反应性破坏，辅以对CAIA小鼠模型中疼痛样行为的分析，以阐明潜在治疗RA特异性疼痛、炎症和骨丢失的作用。

缩写

AUC:	曲线下的区域
BV：	骨体积
曹：	胶原蛋白antibody-induced关节炎
情报局:	胶原诱导的关节炎
CCI:	坐骨神经收缩性损伤
乙二胺四乙酸：	diaminetetraacetic酸乙烯
GFAP:	胶质纤维酸性蛋白
健康与环境：	苏木精和伊红
IL-1β:	Interleukin-1β
il - 6:	白细胞介素- 6
IBA1：	离子化钙结合接头分子1
有限合伙人:	脂多糖
ct机:	Microcomputed断层扫描
NF -κB:	核因子κB
帕特：	副蛋白
PAG：	周围的灰色
PBS:	磷酸盐
PV:	爪子体积
类风湿性关节炎:	类风湿关节炎
排名:	核因子κ B受体激活因子
RANKL:	核因子κB配体的受体激活剂
数位视讯	吻侧ventromedulla
扫描电镜:	均值的标准误差
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子
陷阱：	Tartrate-resistant酸性磷酸酶
美国之音：	体积感兴趣的。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。

伦理批准

根据《澳大利亚国家卫生和医学研究委员会关于研究和训练中动物护理的实践守则》，阿德莱德大学动物伦理委员会(M-2015-255)获得了伦理批准。

的利益冲突

提交人声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

TC和MH构思了这项研究，并参与了实验设计和数据解释。BW和ET进行动物模型实验。BW、ET、EP对足组织进行显微ct扫描分析和免疫组化染色分析。FL对脊髓和脑组织进行免疫组化染色和分析。BW和FL进行了统计分析和数据解释，并对手稿的撰写做出了贡献。所有作者阅读并批准了最终的手稿。B.威廉姆斯和F.李斯对这份手稿的贡献相同。

致谢

我们想承认阿德莱德大学的阿德莱德显微镜，以便于阿德莱德大学动物实验室服务，为动物模型提供援助，以及阿德莱德大学的组织学实验室，为加工和切割组织提供援助。MRH是澳大利亚研究委员会研究奖学金的受援人员（DP110100297，截至2016年）和未来的奖学金（2018年FT180100565）。FL是阿德莱德大学卫生和医学院分部奖学金以及南澳大利亚的英联邦奖学金计划的受援者。BW是澳大利亚政府研究培训方案奖学金的接受者。该项目由关节炎澳大利亚资助（Tania N Crotti博士）资助。

参考文献

1. Y. C. Lee，J. Cui，B.Lu等人，“疼痛在Das28类风湿性关节炎缓解但不在ACR / ECR / ECR / ECR / ECR / ECORESTIONATION）研究中，”关节炎研究与治疗，卷。13，不。3，p。R83，2011年。浏览：出版商网站|谷歌学者
2. T. Heiberg和T. K. Kvien，“对1024名类风湿性关节炎患者健康状况改善的偏好调查:疼痛是最重要的。”关节炎和风湿病，第47卷，第47期。4，页391-397,2002。浏览：出版商网站|谷歌学者
3. G. Schett，《腐蚀性关节炎》关节炎研究与治疗，卷。9，物品AR2166，补充1，p。S2，2007。浏览：出版商网站|谷歌学者
4. E. M. Gravallese，Y. Harada，J.T. Wang，A. H. Gorn，T. S. Thornhill和S. R.Goldring，“负责类风湿性关节炎和青少年类风湿性关节炎中骨吸收的细胞类型的鉴定”美国病理学杂志，第152卷，第4期，第943-9511998页。浏览：谷歌学者
5. A.Gough，P.Sambrook，J.Devlin等人，“破骨细胞激活是导致类风湿性关节炎继发性骨质疏松的主要机制，”风湿病学杂志，第25卷，第2期7，第1282-1289页，1998。浏览：谷歌学者
6. F. Fregnan，L. Muratori，A. R.Simões，M.G.Giacobini-Robecchi，以及S. Raimondo，“炎症细胞因子在周围神经损伤中的作用”，神经再生研究，第7卷，第5期29, pp. 2259 - 2266,2012。浏览：出版商网站|谷歌学者
7. S. Taves, T. Berta, G. Chen和r - r。持续性疼痛中的小胶质细胞与脊髓突触可塑性神经可塑性， 2013年，10页，2013年。浏览：出版商网站|谷歌学者
8. D. B. Bas, J. Su, K. Sandor等，“胶原抗体诱导的关节炎引起脊髓胶质累及和短暂前列腺素依赖的持续性疼痛，”关节炎和风湿病，卷。64，没有。12，第3886-3896，2012。浏览：出版商网站|谷歌学者
9. A. I. M.面包车Laarhoven，F. W. Kraaimaat，O. H.怀德史密斯，P. L. C. M.面包车瑞尔，P. C. M.范·德Kerkhof的，和A. W. M.埃弗斯，“灵敏度在牛皮癣患者和类风湿性关节炎痒和疼痛，”实验皮肤病学，卷。22，没有。8，第530-534，2013。浏览：出版商网站|谷歌学者
10. P.M.Grace、M.R.Hutchinson、S.F.Maier和L.R.Watkins，“病理性疼痛和神经免疫界面，”自然评论。免疫学第14卷第2期4, pp. 217-231, 2014。浏览：出版商网站|谷歌学者
11. S. B. Cohen, R. K. Dore, N. E. Lane等，“Denosumab治疗对类风湿关节炎的结构性损伤、骨密度和骨转换的影响:一项为期12个月、多中心、随机、双盲、安慰剂对照的II期临床试验，”关节炎和风湿病，第58卷，第2期5, pp. 1299-1309, 2008。浏览：出版商网站|谷歌学者
12. P. M. Bork, M. L. Schmitz, M. Kuhnt, C. Escher，和M. Heinrich，“含有墨西哥印第安药用植物的倍半萜内酯和纯倍半萜内酯作为转录因子NF-kappaB的有效抑制剂”，费用字母，第402卷，第1期，第85-901997页。浏览：出版商网站|谷歌学者
13. I. H. Hall, K. H. Lee, C. O. Starnes et al， "倍半萜内酯和相关化合物的抗炎活性，"药学杂志第68卷第2期5，第537-542页，1979。浏览：出版商网站|谷歌学者
14. V.B.Mathema、Y.S.Koh、B.C.Thakuri和M.Sillanpä，“单性酚内酯，一种倍半萜内酯，表达多种抗癌和抗炎活性，”炎症第35期2, pp. 560-565, 2012。浏览：出版商网站|谷歌学者
15. M. R. Kreuger, S. Grootjans, M. W. Biavatti, P. Vandenabeele, and K. D’herde，“倍半萜内酯作为癌症治疗的多靶点药物:关注孤雌内酯，”抗癌药物，第23卷，第9期，第883-8962012页。浏览：出版商网站|谷歌学者
16. S.Materazzi，S.Benemei，C.Fusi等人，“孤雌内酯通过靶向TRPA1通道抑制三叉神经血管系统中的伤害性刺激和神经源性血管扩张，”疼痛第154卷第1期12, pp. 2750-2758, 2013。浏览：出版商网站|谷歌学者
17. 叶国华，郑明辉，冯海涛，j.h. Steer, D. A. Joyce，和J. Xu，“倍半萜内酯通过抑制NF-kappaB活性阻断脂多糖诱导的骨溶解”，骨矿物研究杂志，第19卷，第11期，第1905-1916页，2004年。浏览：出版商网站|谷歌学者
18. Q. Liu, J. Zhao, R. Tan et .，“孤雌内酯抑制促炎细胞因子的产生，并在胶原诱导的大鼠关节炎模型中显示保护作用，”斯堪的纳维亚风湿病杂志，第44卷，第5期。3, pp. 182-191, 2015。浏览：出版商网站|谷歌学者
19. M. S. Zawawi, V. Marino, E. Perilli等，“孤雌内素减少聚乙烯颗粒诱导的小鼠颅骨周围骨溶解模型中的空腔隙和破骨细胞骨表面吸收，”生物医学材料研究杂志。部分号，第103卷。11, pp. 3572-3579, 2015。浏览：出版商网站|谷歌学者
20. B. Wider, M. H. Pittler和E. Ernst，《小白菊预防偏头痛》，Cochrane系统评论数据库，第4卷，第Cd002286条，2015年。浏览：谷歌学者
21. A.A.S.S.K.Dharmapatni，M.D.Cantley，V.Marino等，“X-连锁凋亡抑制蛋白抑制剂Embelin抑制胶原抗体诱导的关节炎小鼠的炎症和骨侵蚀。”炎症介质文章编号564042,10页，2015。浏览：出版商网站|谷歌学者
22. B. Williams, E. Tsangari, R. Stansborough等人，“咖啡酸苯乙基酯(CAPE)对胶原蛋白抗体诱导关节炎小鼠模型中的关节炎症、骨损失和胃肠道炎症的混合效应”，Inflammopharmacology，第25卷，第2期1, pp. 55-68, 2017。浏览：出版商网站|谷歌学者
23. L. M. Khachigian，《胶原蛋白抗体诱发关节炎》自然协议，卷。1，没有。5，第2512至2516年，2006年。浏览：出版商网站|谷歌学者
24. K. S. Nandakumar，L. Svensson的，和R. Holmdahl，“胶原蛋白在小鼠II型特异性单克隆抗体诱导的关节炎：所述疾病和年龄，性别，和基因的影响的描述中，”美国病理学杂志第163期5，页1827-1837,2003。浏览：出版商网站|谷歌学者
25. S. R. Chaplan，F. W.Bach，J.W.Pogrel，J.M.Chung和T.L. Yaksh，术语术中触觉异常的定量评估，“神经科学方法杂志，第53卷，第53期1，页55-63,1994。浏览：出版商网站|谷歌学者
26. E. Perilli，M. Cantley，V.Marino等，“不仅定量骨质损失，而且量化的软组织肿胀，在小鼠炎症性关节炎模型中使用微计算断层扫描”斯堪的纳维亚免疫学杂志，第81卷，第2期，第142-150页，2015年。浏览：出版商网站|谷歌学者
27. M. D. Cantley, D. P. Fairlie, P. M. Bartold, V. Marino, P. K. Gupta，和D. R. Haynes，“抑制组蛋白去乙酰化酶1抑制关节炎中的炎症和骨丢失，”风湿病学，卷。54，没有。9，第1713至1723年，2015年。浏览：出版商网站|谷歌学者
28. P. P. Tak, T. J. Smeets, M. R. Daha等，“早期类风湿性滑膜组织中滑膜细胞浸润与局部疾病活动的关系分析”，关节炎和风湿病，第40卷，第5期。2，页217 - 225,1997。浏览：出版商网站|谷歌学者
29. H. R. Wardill, R. J. Gibson, Y. van Sebille等人，“伊立替康诱导的胃肠功能障碍和疼痛是由常见的tlr4依赖机制介导的，”分子癌症治疗，第15卷，第6期，第1376-13862016页。浏览：出版商网站|谷歌学者
30. Ho Y.C.Ho，J.K.Cheng和L.C.Chiou，“神经病理性疼痛大鼠模型中脑导水管周围灰质腺苷酸环化酶介导的谷氨酸能突触可塑性受损，”生理学杂志，卷。593，没有。13，第2955至2973年，2015年。浏览：出版商网站|谷歌学者
31. M. J. Neubert, W. Kincaid，和M. M. heinrich，“伤害性刺激促进延髓口侧腹内侧神经元”，疼痛，卷。110，没有。1，pp。158-165,2004。浏览：出版商网站|谷歌学者
32. S. C. Helps, E. Thornton, T. J. Kleinig, J. Manavis，和R. Vink，“使用颜色反褶积的免疫组化可视化抗原含量的自动非主观估计，”应用免疫组织化学与分子形态学，第20卷，第2期。1，页82-90,2012。浏览：出版商网站|谷歌学者
33. A. Campillo, D. Cabañero, A. Romero, P. García-Nogales，和M. M. Puig，“阿片类拮抗剂在小鼠中系统给药揭示的延迟术后潜伏性疼痛致敏”，欧洲药理学杂志，第657卷，第1-3期，第89-962011页。浏览：出版商网站|谷歌学者
34. k。Möller, H. Svärd, A. Suominen, J. Immonen, J. Holappa，和C. Stenfors，“临床前关节疼痛研究中的步态分析和负重”，神经科学方法杂志， 2018, vol. 300, pp. 92-102。浏览：出版商网站|谷歌学者
35. N.S.Gregory、A.L.Harris、C.R.Robinson、P.M.Dougherty、P.N.Fuchs和K.A.Sluka，“疼痛动物模型概述：疾病模型和结果测量，”疼痛日记，第14卷，第11期，第1255-12692013页。浏览：出版商网站|谷歌学者
36. D. Amorim, S. Puga, R. Bragança等，“二甲胺四环素减少1型糖尿病大鼠的机械异常痛和抑郁样行为，”行为大脑研究， vol. 327, pp. 1-10, 2017。浏览：出版商网站|谷歌学者
37. H. Ikeda, T. Kiritoshi，和K. Murase，“小胶质细胞和星形胶质细胞对幼年大鼠中枢致敏、炎症和神经性疼痛的贡献，”分子的痛苦，第8卷，第1744-8069页，2012年。浏览：出版商网站|谷歌学者
38. J. Lampa, M. Westman, D. Kadetoff等人，“人类和小鼠中中枢激活IL-1系统相关的外周炎症性疾病”，美国国家科学院院刊，卷。109，没有。31，pp。12728-12733,2012。浏览：出版商网站|谷歌学者
39. D.卡皮茨克，I.维特和P. J.卡博特，“内源性阿片样物质镇痛的外周组织和控制疼痛的临床意义，”治疗学和临床风险管理，卷。1，没有。4，pp。279-297,2005。浏览：谷歌学者
40. D. K. Pandey, R. Rajkumar, R. Mahesh和R. Radha，“孤雌内酯在啮齿动物行为抗抑郁试验中的类似抑郁效果”，《药学与药理学杂志》，第60卷，第2期12, pp. 1643 - 1650,2008。浏览：出版商网站|谷歌学者
41. C. Rummel，R.Gerstberger，J. Roth和T.Hübschle，“帕拉什内酯衰减了LPS诱导的发烧，循环细胞因子和大鼠脑炎的标记，”细胞因子，第56卷，第3期，第739-748页，2011年。浏览：出版商网站|谷歌学者
42. V. Vacca, S. Marinelli, L. Pieroni, A. Urbani, S. Luvisetto，和F. Pavone，“女性对神经性疼痛的更高的疼痛感知和缺乏恢复:小鼠性别相关差异的行为、免疫组化和蛋白质组学研究，”疼痛，卷。155，没有。2，第388-402，2014。浏览：出版商网站|谷歌学者
43. H. H. Doyle, L. N. Eidson, D. M. Sinkiewicz, and a . Z. Murphy，“大鼠导水管周围灰质小胶质细胞活动的性别差异:一种驱动吗啡二形效应的潜在机制，”神经科学杂志，第37卷，第12期，第3202-3214页，2017年。浏览：出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2020 B. Williams等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。