基于综合生物信息学的结直肠癌致癌性和预后的核心基因的鉴定

摘要

结肠直肠癌（CRC）患者的高死亡率和常规肿瘤节点转移（TNM）阶段的局限强调了探索与CRC中致癌和预后密切相关的枢纽基因的必要性。该研究旨在鉴定与CRC的致癌和预后相关的枢纽基因。我们鉴定并验证了来自六个基因表达综合（Geo）数据集和癌症基因组Atlas（TCGA）数据库的212个差异表达的基因（DEGS）。我们调查了Degs的功能性浓缩分析。构建蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络，提取CRC癌发生中的轮毂模块和基因。基于Cox比例危害回归分析，开发和验证了预后签名。DEG主要受调节涵盖刺激，代谢过程和含有蛋白质结合和催化活性的影响的分子功能的生物过程。DEGS在CRC相关途径中发挥了重要作用，涉及促塑性病变，致癌，转移和预后差。提取与CRC致癌发生密切相关的轮毂基因，其在1（CXCL1，CXCL3，CXCL8，CXCL11，NMU和PPBP）和模型2中的两种基因和金属硫蛋白（MTS）中的六个基因（SLC26A3和SLC30A10）。其中，CXCL8也与预后有关。 An eight-gene signature was proposed comprising AMH, WBSCR28, SFTA2, MYH2, POU4F1, SIX4, PGPEP1L, and PAX5. The study identified hub genes in CRC carcinogenesis and proposed an eight-gene signature with good reproducibility and robustness at the molecular level for CRC, which might provide directive significance for treatment selection and survival prediction.

1.介绍

结直肠癌(CRC)在女性中被诊断为第二大癌症，在男性中被诊断为第三大癌症，它一直是一个主要的全球公共健康问题[1］.诊断的案件数量预计将从现在通过世界卫生组织的2040年从18亿到3093 000升起[2］.虽然现代医学已经取得了很大的进步，但CRC仍然是癌症相关死亡的第三大原因[3.］.众所周知，CRC的早期检测对降低其死亡率并发现前体病变的发现甚至可以减少发病率[4.］.早诊断生存率高，晚诊断预后差，这是毫无疑问的。TNM分期是由美国癌症联合委员会根据病理和临床因素确定的，它不仅是治疗的基础，也是判断CRC预后的金标准[5.那6.］.I期5年生存率超过90%，IV期5年生存率仅为10% [7.］.然而，20%的II期患者经历了癌症特异性死亡，一些III期患者面临的结果比一些II期患者更好[8.］.因此，由于TNM分期的局限性，识别新的预后生物标志物对早期诊断和改善预后是非常必要的。

近几十年来，CRC致癌和进展中分子和遗传机制的研究加速了TNM分期系统补充剂的遗传预后标志物的研究[9.］.微阵列和高通量测序技术的进展也促进了解释表观遗传或癌症发生中的关键基因变化，并破译了用于癌症诊断、治疗和预后的有希望的生物标志物[10.那11.］.公开可用的基因组数据库，如癌症基因组图谱(TCGA)和基因表达综合(GEO)，为临床医生和生物信息学提供了更便利的关于不同癌症含CRC的基因组探索，这在过去通常是不可能的[12.-15.］.同时，综合生物信息学方法已应用于癌症研究，并挖掘大量有价值的信息，这是探讨克服受限制或不和谐的结果，因为应用小型样本量或不同类型的技术平台[16.-19.］.

在该研究中，我们从基因表达谱和人CRC的RNA测序数据中鉴定和整合差异表达基因（DEGS）。该DEG是进一步预先形成的功能性富集分析，以研究由DEGS调节的生物过程，分子函数和反应途径。构建了反映了DEG之间相互作用的蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络，并且捕获并破译了集线网络模块，其体现了CRC癌发生中的代表性基因。最后，总存活数据的患者随机分为两组，火车组和试验组。火车组用于揭示与存活相关的基因，并在预后构建CRC基因签名。试验组旨在全面评估预后模型。

2.材料和方法

2．1.GEO识别DEG

从Geo数据库中提取基因表达谱数据（GSE21510，GSE24514，GSE32323，GSE89076，GSE110225和GSE113513）[20.-24.］.所有纳入的数据集包含至少10个样本。归一化和对数₂对每个GEO数据集的矩阵数据进行转换，通过R[中的Limma包过滤掉肿瘤组织与对照组织之间的DEGs [25.］.使用基于强大的等级聚合方法使用robustrankaggreg（rra）包来执行从六个数据集中屏蔽的DEG的基因集成。26.］. 和调整值< 0.05设置标准过滤具有统计学意义的deg。

２.２.TCGA的DEG验证

利用TCGA COADREAD数据集的RNA测序数据，对GEO数据集中整合的重要deg进行验证。从TCGA数据库中提取原始RNA测序数据，包括647个COADREAD样本和51个匹配的非癌样本，并下载患者的临床信息。采用Mann-Whitney检验对TCGA数据进行归一化和分析。基因与 和调整值<0.05被认为是显着差异的表达。GEO和TCGA数据库之间的重叠参数被保留进行以下研究。

２.３.功能富集分析

利用Cytoscape 3.2.1的BINGO插件评估重叠DEGs潜在的生物学过程和分子功能[27.］.在此过程中，显着性水平设定为0.05，和生物体被选为智人。进行了途径富集分析利用Reactome FI插件Cytoscape的3.2.1，并且所述阈值电平被定义为 ［28.］.功能富集分析的十大术语使用Bubble软件包进行可视化[29.］.

２.４.PPI网络和模块分析

通过STRING数据库鉴定重叠基因之间的蛋白-蛋白相互作用，以及与之结合的基因 被选择用来构成PPI网络[30.］.在PPI网络是可视化，并通过Cytoscape的3.2.1进行分析。和轮毂网络模块进行与所述的Cytoscape插件分子复合物检测（MCODE）与参数程度的帮助捕获 那节点分 那和 ［31.］.然后，还计算了拓扑参数，并且使用临床信息通过用于轮毂模块的存活包来进行存活分析。

2．5．COX模型的构建与验证

消除没有整体存活数据的患者后，617名患者的数据用于存活分析。伴随着名唤醒包，火车组和试验组的所有患者随机分为两组[32.］.火车组用于构建COX预后签名，并且测试组用于验证签名。火车组执行了单变量的Cox比例危害回归分析，以识别与存活相关的候选基因。然后，采用套索惩罚回归模型同时实现收缩和可变选择，并防止预装的预装。随后，进行多元COX比例危害回归模型，并在列车组中计算相应的系数。基于预后基因的表达水平及其列车组中的相应系数评估预期的每位患者的风险评分的预测整体存活信息。根据火车组的中位风险评分，两组患者分为低风险群体。利用存活包装绘制存活曲线，以评估两组高风险患者的生存率差异。此外，基于Survivalroc包构建接收器操作特性（ROC）曲线，测量曲线（AUC）下的区域以评估预测签名对临床结果的预测能力。列车和试验组中患者的风险分配，存活时间和基因表达模式在R中可视化。

3.结果

3．1.DEG的识别和验证

本研究中六个Geo数据集的详细信息如表所示1．通过对6个数据集Limma包的筛选和RRA包的整合，共得到254个DEGs，包括80个上调基因和174个下调基因(表)S1)．综合分析后的前20个上调和下调基因如图所示1（a）．从TCGA数据库中提取的DEGS包含1386个上调和2142个下调基因（表S2)．最后，共鉴定出212个重叠的DEGs，其中包含46个上调基因和166个下调基因(图)1 (b)和表格S3.)．此外，对患者的临床资料进行整理，进行生存分析(表)S4)．

３．２．功能富集分析

为了解释这212个重叠DEGs的潜在生物学功能，我们进行了生物学过程、分子功能和反应通路富集分析。生物过程主要涉及对刺激的反应和代谢过程(图)2(一个)和表格S5)．分子函数在蛋白质结合和催化活性中显着富集（图2 (b)和表格S6)．根据反应性途径富集分析，上调基因主要与GPCR和细胞外基质组织的信号传导相关（图2 (c)和表格S7)．下调基因参与对金属离子、代谢、信号转导和小分子跨膜转运的响应(图)2 (d)和表格S8)．

３．３．PPI网络和模块分析

结合STRING数据库挖掘37个上调基因和131个下调基因之间的PPIs 那显示PPI网络，其中包含168个节点和417个交互（图3(一个)和表格S9.)．为了进一步研究集线器网络模块从复杂网络，两个集线器模块一个 是基于MCODE提取的(图3 (b)和3 (c))．通过计算度、接近中心性和间中心性三个拓扑参数来度量枢纽网络模块中的枢纽节点(表3)S10和S11)．考虑参数大于每组均值的枢纽基因来反映网络模块中的关键生物学特性。然而，模型1中所有参数均相同，但CXCL家族基因占了一半。在模型2中，将SLC26A3和SLC30A10定义为枢纽基因。然后，研究了两个模块对路径的影响。模型1中的基因在9个通路中显著富集，且前5个通路与46个上调基因主要调控的通路相一致，这可能表明模型1中的上调基因是显性的(图)3 (d))．在模型2的基因主要聚集在六个途径，而前五名的途径是与受166个下调基因的途径，这表明，金属硫蛋白（MTS）发挥了模型2的一个重要作用是一致的（图3（e）)．hub模块的生存分析显示CXCL8、CXCL13和CLCA1与预后相关( )，和高表达组呈现更好的预后（图3（f）-3（h）)．

3．4．COX模型的构建与验证

617例患者资料随机分为两组，训练组(309例)和试验组(308例)。在训练组中，通过单变量Cox比例风险回归模型共捕获了102个基因，这些基因与生存时间显著相关( ）并且都属于高风险基因（ ）（桌子S12)．然后，通过火车组中的套索惩罚回归模型同时筛选16个代表性基因通过收缩和可变选择（图4(一)和4 (b)和表格S13)．使用多元COX比例危害回归模型，覆盖穆勒斯抑制因子（AMH），跨膜蛋白270（WBSCR28），表面活性剂相关蛋白2（SFTA2），肌苷-2（MYH2），开发了八个基因的预后基因签名。，pou结构域，4类，转录因子1（pou4f1），homeobox蛋白六4（six4），吡戈替莫基肽酶1样蛋白（pgpep1l）和配对盒蛋白pax-5（pax5）（表2)．所有的八个基因 被鉴定为危险预后基因，提示患者的风险随着基因表达的升高而增加。根据基因表达值和相关系数计算风险评分，根据训练组的中位数风险评分将所有患者分为高、低风险组(图)5（a）和5（b）)．在数字中展出了高风险群体的生存时间统计数据5（c）和5（d）．很明显，在图中训练组中，高风险组和低风险组的生存率有显著差异5（e）,图5（f）验证存在测试组的显着差异。低风险组的存活率为94.3％（95％CI：90.6％-98.2％），88.6％（95％CI：82.1％-95.6％）和65.3％（95％CI：49.3％-86.4％）分别为1,3和5年，与85.8％（95％CI：80.2％-91.8％），70.3％（95％CI：62.0％-79.7％），50.4％（95％CI）：列车集团的高风险集团37.0％-68.5％。存活预测中的预后基因签名的准确性分别为50.713和0.614，用于列车组和试验组（图5（g）和5 (h))．随着风险评分的升高，基因表达趋势分布如图所示5(我)和5 (j)．

4.讨论

目前，TNM分期是CRC患者治疗选择和预后预测的主要依据。在临床实践中，组织病理特征相似的CRC患者预后明显不同或对治疗反应不同，这可能与CRC的高分子异质性有关，暴露了CRC精准医学TNM分期的局限性[33.-35.］.此外，虽然关于生物标志物的研究不断增加已累计集中在肿瘤的诊断，治疗和预后，有利于早期诊断，治疗选择，并在临床预测结果利用稀缺的生物标志物。因此，能够区分患者预后的可靠的预后标志物仍然拼命地需要CRC。

在该研究中，将254℃含有80个上调基因和174个下调基因，并从六个Geo Datasets集成并从TCGA映射到RNA测序数据中，以提取含有46个上调的212重叠的含量和166个下调基因。生物过程分析表明，上调基因主要涉及多种代谢过程，包括胶原蛋白分解生成工艺，多细胞组织分解代谢过程，胶原代谢过程，多细胞机构大分子代谢过程和多细胞机构代谢过程。下调基因主要涉及刺激的各种反应，对化学刺激等趋化性，如趋化性，以及对营养素的反应，对外部刺激等出租车和对细胞外刺激的反应，以及对与糖皮质激素刺激相应的内源刺激，对皮质类固醇刺激相应的反应，对类固醇激素刺激的反应，并对激素刺激反应。分子函数分析表明，上调基因主要影响含趋化因子活性的蛋白质结合，趋化因子受体结合，细胞因子活性，G蛋白偶联受体结合，受体结合等。下调基因对催化活性如裂解酶活性有很大影响，氧化还原酶活性，转移酶活性和水解酶活性。对于反应性途径富集分析，上调基因主要集中在监管免疫系统和炎症和癌细胞侵袭和转移[36.那37.］.下调基因在癌前病变、癌变、转移和不良预后等crc相关通路中发挥重要作用[38.-40］.

两个集线器模块也被识别，并且PPI网络中，计算拓扑参数。在模块1基因的拓扑参数没有显著不同，但途径富集结果主要累积在46倍上调的基因，结果发现CXCL1，CXCL3，CXCL8，CXCL11，NMU和PPBP的主要状态调节的途径。增加CXCL1水平与肿瘤大小，浸润程度，推进阶段，转移，预后差[正相关关系41那42］.CXCL3在癌前腺瘤和CRC组织中高表达，CXCL3在肝转移中较原发肿瘤明显下调。而CXCL3在局部相对于全身性疾病患者中明显高表达[43］.相反，CXCL8的过表达促进了细胞增殖，迁移，和CRC细胞，将其强烈CRC血管生成，转移，预后不良相关的侵袭，和无病存活[44那45］.然而，CXCL8的高表达可作为CRC肝转移的保护屏障，并伴随较好的预后[46那47］.客观地说，CXCL8的作用仍然存在争议。本研究证实CXCL8与预后相关，提示CXCL8高表达组预后优于低表达组。除血管生成外，CXCL11是CRC炎症进展的重要细胞因子，诱导肿瘤相关巨噬细胞浸润，增强了CRC细胞的增殖和侵袭，导致预后不良[48-50］.NMU能够促进CRC细胞的增殖、迁移和侵袭[51］.PPBP，又称CXCL7，在CRC中过表达，与预后不良和无病生存相关[52］.研究发现SLC26A3和SLC30A10是模型2中的枢纽基因，前2个显著通路位于MT1M、MT1X、MT1F、MT1G、MT1H和MT1E，占据了模型2的单侧子网络。SLC26A3在CRC中下调表达，发挥抑癌作用，有望成为CRC的候选上皮标志物[53那54］.在CRC中，SLC30A10可用于甲基化表观基因型的分类，并与分子发生相关[55］.MTS，低分子量和充满半胱氨酸的蛋白质家族，含有至少11个功能性同种型并涉及锌和氧化还原代谢。MTS在CRC早期进展（尤其是MT1G）中表现出对象性下降，并倾向于诱导更差的预后[56］.MT过表达是溃疡性结肠炎相关CRC发展的关键早期步骤[57］.MT表达也是影响淋巴结转移的潜在提示，特别是在伴有同步肝转移的患者中[40］.MT1G揭示了肿瘤抑制因子通过锌信号促进CRC分化的能力[58］.此外，MT1G过表达通过激活p53和抑制NF-使CRC细胞对奥沙利铂和5-氟尿嘧啶敏感κB活动(59］.此外，hub模块中的CXCL13和CLCA1下调，高表达的CXCL13和CLCA1预后较好。CRC中CXCL13表达显著降低，且CXCL13缺失患者复发风险显著升高[60］.CLCA1也被报道参与CRC的病理生理学，CLCA1的上调与良好的预后相关[61那62］.

在本研究中，我们通过招募309例患者的3528个基因的RNA测序数据，检测了CRC患者的基因表达与预后之间的关系，并确定了102个与CRC患者总生存显著相关的基因。在去除高度相关的基因信息后，我们开发了一个8个基因标记，并评估了风险评分，将CRC患者分为高危组和低危组，总生存率有显著差异。实验组验证了8基因标记具有良好的重现性和稳健性，提示8基因标记可以在分子水平上改善常规TNM阶段以外的预后预测。由于CRC的分子异质性，八基因标记也推动了传统TNM分期在预测预后方面的局限性。目前，已经报道了几种预测CRC预后的基因标记[63-66］.相较于报告的签名，在这项研究中的独特性是套索回归分析可以执行特征选择和收缩和屏幕高度相关的基因，确定了最优的基因参与后续的标志性建筑[66］.LASSO回归可以防止基因签名过拟合，提高生物信息学分析的准确性[67］.我们探索了ROC曲线和试验验证来评估特征的预后性能。在未来，八基因标记的价值仍然需要在临床指南中检验。8个基因标记可以分层CRC患者术前选择生存风险，提示患者受益于预后良好的治疗，避免预后不良的不必要治疗。

最后，在人类肿瘤中或多或少地研究了这一特征的基因。一种靶向抗穆勒激素受体II (AMHRII)的单克隆抗体通过肿瘤相关巨噬细胞参与晚期/转移性CRC，已进行2期研究[68］.WBSCR28在人类肿瘤中还没有得到很好的研究，但在前列腺癌中它被雄激素受体抑制[69］.SFTA2被鉴定为结肠癌的潜在无病的存活预后基因，以及用于区分肺腺癌和鳞状细胞癌的潜在生物标志物[70那71］.MYH2被证实在肝细胞癌中有显著的变化，并且在有头颈部恶性肿瘤病史的患者的肺部的鳞状细胞癌起源中高表达[72那73］.小细胞肺癌中POU4F1上调并诱导神经内分泌表型[74］.SIX4通过激活AKT通路促进CRC肿瘤血管生成和转移[75那76］.通过表达式Atlas数据库在CRC中进行确认PGPep11，并首先提出独立于独立的预后因素（表S14)．PAX5被证实与CRC合并腹膜转移相关[77］.

5.结论

综上所述，我们通过整合生物信息学分析确定了参与CRC发病机制的枢纽基因。我们还提出了由AMH、WBSCR28、SFTA2、MYH2、POU4F1、SIX4、PGPEP1L和PAX5组成的8个基因标记，这对CRC的预后预测和治疗选择具有指导意义。然而，八基因标记的应用仍需在临床中进行评估和验证。

缩写

儿童权利公约:	结肠直肠癌
TNM：	Tumor-node-metastasis
度:	差异表达基因
地理:	基因表达综合
TCGA：	癌症基因组图谱
PPI:	蛋白质相互作用
MTS：	金属硫蛋白
基本:	RobustRankAggreg
MCODE:	复杂的分子检测
中华民国:	接收器操作特征
AUC:	曲线下的区域
AMH：	Muellerian-inhibiting因素;她们血液中的抗苗勒氏管激素
WBSCR28:	跨膜蛋白270
SFTA2:	Surfactant-associated蛋白2
MYH2:	Myosin-2
POU4F1:	POU结构域，4类，转录因子1
SIX4:	Homeobox蛋白质素64.
PGPEP1L：	Pyroglutamyl-peptidase 1蛋白质
pax5：	配对盒蛋白Pax-5。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

龚本姣和高彦磊对这项工作贡献相当。

致谢

山东省重点研发计划项目(No. 2019GSF107096)资助

补充材料

补充1．表S1：254 Degs由Limma包筛选，由Rra包从六个Geo数据集中集成。

补充2．表S2：从TCGA数据库中提取的DEG。

补充3．表S3：重叠6个GEO数据集和TCGA数据库之间识别DEGS。

补充4．表S4:用于生存分析的患者的临床资料。

补充5．表S5:重叠二基因的生物学过程分析。

补充6．表S6:重叠二基因的分子功能分析。

补充7．表S7:重叠DEGs上调的反应通路。

补充8．表S8:重叠基因下调后富集的反应体通路。

补充9．表S9:经联合鉴定的重叠DEGs之间的蛋白-蛋白相互作用 ．

补充10．表S10：模块1计算的三个拓扑参数。

补充11．表S11：模块2计算的三个拓扑参数。

补充12．表S12:训练组单因素Cox比例风险回归分析。

补充13．表S13:对训练组进行LASSO惩罚回归。

补充14．表S14: PGPEP1L在人体内的差异表达。

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