整体转录谱显示白细胞介素6在人血管内皮细胞中的新自分泌功能

抽象的

背景白细胞介素6（IL6）是由多种细胞产生的多功能细胞因子，包括血管内皮细胞。IL6具有促炎和非/抗炎功能，对IL6的反应取决于它是否通过膜结合的IL6受体发挥作用α（IL6R）α)或受体的可溶形式(转导)。人内皮细胞在产生IL6的同时表达IL6Rα，我们假设IL6可能具有自分割功能。方法.使用siRNA在培养的人内皮细胞中敲除IL6。使用ELISA评估敲除效率。使用RNA测序表征IL6敲除的转录结果，并使用Ingenuity通路分析进一步探索IL6的功能作用。结果．IL6在培养内皮细胞中的敲低导致IL6释放的84-92％。IL6的敲低导致转录模式的巨大变化;在没有可溶性IL6R的情况下敲低IL6α(sIL6Rα)导致了1915基因的差异调控，以及在sIL6R存在时IL6的敲除α导致1967年基因的差异调控(fold change 1.5， ）.通路分析显示，IL6在人内皮细胞中的自分泌功能主要与细胞周期、信号转导、细胞运动等基础细胞功能有关。此外，我们发现，下调IL6激活内皮细胞的粘附、结合和相互作用相关功能，这些功能似乎主要是通过STAT3介导的。结论. 在这项研究中，在人类内皮细胞中发现了大量受IL6自分泌调节的新基因。总的来说，我们的数据表明IL6以自分泌方式调节基本细胞功能，如细胞周期调节、信号传导和细胞运动，并表明IL6在人类内皮细胞中的自分泌功能是通过IL6经典信号传导介导的。

1.背景

血管内皮是维持正常血管稳态的至关重要。健康的内皮有血管舒张，抗炎和抗血栓形成。然而，在血管疾病（例如，动脉粥样硬化）期间，内皮函数受损，其通常被称为内皮功能障碍，并且与促炎和普形细胞性质相关，以及减少的血管肠肠肠疾病相关[1]．内皮细胞在健康条件和血管疾病期间表达大量基因和调节蛋白，包括促炎和抗炎细胞因子[2]．白介素6 (Interleukin 6, IL6)是多种细胞产生的多功能细胞因子，包括血管内皮细胞[3.- - - - - -5]．IL6通过控制靶向细胞的分化，增殖，迁移和凋亡来对炎症作出核心作用，并且涉及许多疾病的病理学，例如类风湿性关节炎，全身性红斑狼疮和动脉粥样硬化[6，7].IL6与其特异性非信号受体IL6受体结合α（IL6R）α)，它与信号转导受体gp130 (IL6ST)形成二聚体复合物，进而介导信号[8]．而gp130普遍表达，IL6R表达α局限于某些细胞类型(例如肝细胞和白细胞)[9]．但是，IL6R.α也以可溶性形式存在（sIL6Rα)，由质膜的选择性剪接或酶切产生[10，11]．的sIL6Rα与IL6形成复合物，这个复合物与gp130/IL6ST结合，然后介导信号，也在不表达IL6R的细胞中α[12]．因此，缺乏IL6R的细胞α如果IL6R的可溶性形式α通过可溶性IL6R形式发出信号α，通常被称为IL6转导信号，主要介导促炎反应，而通过膜结合形式的信号(被称为IL6经典信号)被认为介导非或抗炎反应[12]．

IL6主要用在许多白细胞中的自分泌和细胞内时尚，表达IL6和膜结合IL6R的许多白细胞α[13，14]类似地，在内皮细胞中也显示了IL6的自分泌功能，但仅在存在外源性sIL6R的情况下α然而，我们最近证明血管内皮细胞也表达功能性IL6Rα能够介导细胞内信号[5]，表明膜结合的IL6R介导了真正的自分泌效应α内皮细胞表面的受体。

在本研究中，我们通过sirna介导的IL6基因沉默来评估IL6在人血管内皮细胞中的自分泌作用。通过RNA测序分析il - 6在血管内皮细胞中的转录活性，并通过ingenious Pathway Analysis (IPA)进一步探讨il - 6的功能作用。

2.方法

在这项研究中，我们在人类内皮细胞中进行了IL6的敲低，然后进行RNA测序，以解开IL6的自分泌功能。

2．1．细胞培养

人脐静脉内皮细胞（HUVECs，来自多个供体）（Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）在补充有血管内皮生长因子（VEGF）生命因子试剂盒（Lifeline Cell Technology，Frederick，MD，USA），青霉素0.1的VasculaLife基础培养基中培养 U/ml（Gibco）和链霉素100 纳克/毫升（吉布科）。细胞在75℃培养 厘米²细胞培养瓶（Sarstedt，Nümbrecht，德国），并在95%空气和5%CO中保持37°C₂.每48-72天更换一次培养基 h、 细胞融合后传代，传代5-7代。

2.2. siRNA介导的人脐静脉内皮细胞IL6基因沉默

利用siRNA和Lipofectamine在HUVECs中敲除IL6。HUVECs以每孔200,000细胞的密度接种于6孔板(Sarstedt)中，接种于补充了VEGF LifeFactors Kit、青霉素0.1 U/ml和链霉素100 ng/ml的VascuLife基础培养基中，并在37℃95%空气和5% CO中培养₂过夜。第二天早晨，在Opti-Mem I还原血清培养基（Gibco）中，将细胞进行一次冲洗一次，然后加入700 μl Opti MEM I还原血清培养基，含4 μl Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)和每孔20 pmol 3个il6靶向隐形RNAi™siRNA (Thermo Fisher Scientific)或60 pmol非靶向隐形RNAi™siRNA阴性对照(Thermo Fisher Scientific)。培养皿在37°C 95%的空气和5%的CO中培养₂每孔加入1.3 ml含VEGF LifeFactors Kit的VascuLife基础培养基。在有或无可溶性IL6受体的情况下，在4个重复中进行IL6的敲除，同时伴有未敲除的对照样品。重组体人sIL6Rα引入siRNA 6 h后，向孔中加入100 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)。48 h后收集细胞和细胞培养基，-80℃保存待分析。细胞培养基用于分析释放到培养基中的IL6，细胞用于RNA的分离。

２．３．利用sgp130Fc融合蛋白阻断il6转导信号

用sgp130Fc融合蛋白1处理HUVECsμg/ml (R&D Systems)，可单独或与(1)重组IL6 (50 ng/ml)或(2)重组IL6 (50 ng/ml)与重组sIL6R联合使用α(10 ng/ml）。人脐静脉内皮细胞暴露30分钟 使用Western Blot测定STAT3、AKT或ERK1/2磷酸化的最小值和48 h用于基因表达分析。

2.4.酶联免疫吸附试验（ELISA）

根据制造商的说明书，使用研发系统(R&D Systems)对细胞培养基中IL6的释放情况进行分析。在450 nm处进行吸光度测量，在540 nm处使用Multiscan Ascent分光光度计(Lab Systems, Thermo Fisher Scientific)进行波长校正。

2.5. RNA样品制备和测序

根据制造商的说明，使用E.Z.N.A.Total RNA Kit I（美国佐治亚州诺克罗斯Omega Bio-tek）从HUVEC中分离RNA。细胞裂解物用PureLink®DNAse（Thermo Fisher Scientific）处理15分钟 RNA在无RNA酶的水中洗脱，并使用NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）测量RNA浓度。

2.5.1。图书馆准备

测序文库是从1 μ使用TruSeq链mRNA样本准备试剂盒，包括poly-A选择(Illumina, San Diego, CA, USA)，根据制造商的协议(#15031047 revE)。简单地说，poly-A-selected RNA被片段化，然后使用随机序列引物和SuperScript™III逆转录酶(Thermo Fisher Scientific)将RNA逆转录为cDNA。用AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA)纯化cDNA，用条形码引物扩增15个周期，然后用AMPure beads纯化。使用片段分析仪(Advanced Analytical Technologies, Ankeny, IA)和dsDNA试剂试剂盒(Advanced Analytical Technologies)评估文库的质量。在聚类生成和测序之前，利用Illumina文库定量试剂盒(Library Quantification Kit for Illumina, KAPA Biosystems, Wilmington, MA)在StepOnePlus仪器(Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific)上对适配器连接的片段进行定量pcr。

2.5.2.集群生成和排序

测序由SNP&SEQ技术平台完成，该平台是国家基因组基础设施(NGI)的一个国家设施，由位于瑞典乌普萨拉的生命科学实验室(https://www.scilifelab.se/facilities/ngiuppsala/).根据制造商的说明，在Illumina HiSeq2500仪器（HCS版本2.2.58/RTA版本1.18.64）上进行测序，其中使用50 bp成对末端读取（每个样本读取6000-8000万次）。使用Illumina提供的CASAVA软件（版本1.8.4）执行多路复用并转换为FASTQ格式。使用来自FASTQ文件、RTA和CASAVA输出文件的内部脚本汇编了关于测序质量的其他统计数据。

2.6。互补脱氧核糖核酸的合成

cDNA由1合成 μg RNA在20μl根据制造商的说明，使用高容量cDNA反转录试剂盒（应用生物系统公司，Thermo Fisher Scientific）进行反应。cDNA通过以下热循环合成：10 25°C时的最低温度，120 37°C和5°C条件下的最小值 在85°C条件下至少保存一次。将样品冷却至4°C，并在-20℃条件下保存，直至分析。

2.7。定量实时聚合酶链反应

采用实时荧光定量PCR (qPCR)对所选基因进行基因表达分析。以1:2稀释的cDNA为标准，制备了6点标准曲线。10个培养皿进行qPCRμl含有LuminoCt®qPCR ReadyMix的反应™ （美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich）、Taqman引物/探针（应用生物系统公司、赛默飞世尔科学公司）、cDNA和水。使用以下循环条件：在95℃下初始化20分钟 s、 然后在95℃下进行40次循环，持续1小时 s和60°C，温度为20℃ 在QuantStudio 7 Flex实时PCR系统（应用生物系统公司，Thermo Fisher Scientific）中，根据标准曲线计算相对数量，并标准化为管家基因（GAPDH）的表达。

2.8.蛋白质印迹法

使用冰冷的ripa缓冲液（Millipore，Burlington，Ma，USA）裂解细胞。根据制造商的说明，使用Micro BCA TM蛋白测定（Pierce，Thermo Fisher Scientific）测量蛋白质量。使用细胞3次成像读取器（Biotek Instruments Inc.，Winooski，VT，USA）以562nm测量吸光度，以获得蛋白质浓度。将细胞裂解物与SDS样品缓冲液混合，并在95℃下使蛋白质变性5分钟。蛋白质（10-15 μ使用MOPS运行缓冲液（Invitrogen，USA），在4-12％Nupage®Novex（Invitrogen，USA）上分离出G）分离。包括蛋白梯（MagicMark™XP西蛋白标准，Invitrogen）以确定蛋白质的分子量。将蛋白质呈涂涂在免疫印迹™PVDF膜上（0.2 μM）（Bio-rad，Hercules，Ca，USA）和膜在TBS-T（10mM Tris-HCl，pH 8.0; 150mM NaCl;和0.1％（/) Tween-20)。随后的洗涤步骤使用TBS-T进行。为了评估STAT3磷酸化，用抗phospho- stat3tyr705抗体检测细胞膜(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA， #9131;1: 1000稀释)稀释5% BSA在TBS-T。膜也被探测β- 使用抗ubulinβ-微管蛋白抗体（微孔，#05-661；1 : 2000稀释）在TBS-T中的5%BSA中稀释，作为负载对照。然后将膜与辣根过氧化物酶-（HRP-）结合的山羊抗兔IgG（细胞信号技术，#7074；1）孵育 : 2000）或马抗鼠IgG（细胞信号技术，#7076；1 : 膜随后被Immobilon覆盖™ Western化学发光HRP底物溶液（美国密理博），使用LI-COR Odyssey Fc成像系统（英国LI-COR生物技术有限公司）检测化学发光。使用Image Studio软件（LI-COR生物技术）对蛋白质条带进行定量。

2.9。基因表达测序数据分析

所有16个样品(含/不含可溶性受体，含/不含敲除，4个重复)均通过快速qc质量控制[15]．用cutadapt处理序列[16]删除适配器序列并过滤质量差的序列。序列的最小长度为20 保留质量分数至少为20分的nt和。然后使用星形比对器将修剪和筛选的读数映射到人类转录组上[17]，以及ENSEMBL人类基因组/转录组GRCh38序列和注释文件，可从ENSEMBL网站[18] (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/000/001/405/GCA_000001405.15_GRCh38/seqs_for_alignment_pipelines.ucsc_ids/GCA_000001405.15_GRCh38_no_alt_analysis_set.fna.gz）.使用Samtools将对齐序列转换为BAM格式[19]．

2.10.差异基因表达分析

所有样本的原始计数数据被加入到一个公共数据表中，然后使用edgeR包进一步分析。首先，读数与总读数和库之间的组成差异进行了标准化[20.]，然后拟合两因子区组设计（击倒/不击倒，1中的实验区组） : 4，表示四个重复），分别用于可溶性受体存在或不存在的情况[21]．

2.11。ELISA数据统计分析

采用单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni的事后试验分析ELISA测定的IL6释放。图表和统计分析来自GraphPad Prism版本5.01（GraphPad软件，美国加利福尼亚州拉霍拉）。

2.12。创新途径分析

Ingenuity途径分析（IPA，Qiagen Bioinfinomatics 2017年4月4日）用于分析IL6敲低对途径和基因组的影响[22]．进行了三种不同的比较：（1）IL6敲低在不存在可溶性IL6受体的影响下的影响，（2）IL6敲低在可溶性IL6受体存在下的影响，（3）单独的可溶性IL6受体的影响。对于每个比较，执行核心分析。过滤基因 还有Benjamini Hochberg的 ．从核心分析，规范途径以及疾病和功能与a -得分>2或<-2被认为是显著的。确定每个通路中受调控基因的数量并用于计算受调控基因的比例。绘制所有富集的典型通路及其相应的差异调控基因，以评估通路之间的重叠。

所有受显著调控的疾病和生物功能都根据它们在Ingenuity知识库中所属的主要类别进行分类[22]，并在每个类别中绘制激活和抑制功能的数量。由于一些范畴重叠，一些功能或疾病被分为多个范畴。只包括包含3个或3个以上功能的类别。

此外，将“心血管系统发育与功能”范畴中富集功能的所有差异调控基因用于生成合并网络。5种富集功能几乎完全重叠，其中“内皮细胞的相互作用”包含了在其他4种功能中发现的所有42个差异调节基因。这42个基因和已知的IL6信号转导的“核心基因”(IL6、IL6R、IL6ST、STAT3、JAK1、JAK2和SOCS3)一起被包含在这个网络中。合并后的网络是通过在人类样本中实验观察到的直接连接，将所有42个基因连接在一起而产生的。IL6“核心基因”连接在相同的设置下，形成两个独立的网络。随后，使用“Path Explorer”将这两个网络合并，允许直接连接，在人体样本中进行实验观察，并允许最大单个分子的一个节点，不包括化学和生物药物。四种分子未连接(TSTA3, FOLH1, mir-126和S1PR2)。这些分子被从网络中移除。

为了评估在IL6敲除后发现的人类内皮细胞差异调节基因是否先前已知受IL6调节，我们使用了IPA和STRING数据库[23]为了确定IL6的已知交互伙伴。在字符串数据库（版本10）中，我们选择了直接和间接交互伙伴（第一个和第二个邻居），使用实验和数据库作为来源，人类样本的置信度为0.9。在IPA中，我们评估了直接和间接的相互作用伙伴，包括上游和下游调节器，考虑到一个节点，以及人类样本实验的证据（2019年10月17日）。

结果

使用siRNA对人血管内皮细胞中的IL6进行敲除。通过ELISA在细胞培养基中确认敲除，48 h在引入靶向IL6的siRNA后（图1）.在无sIL6R和有sIL6R时，敲除效率分别为84%和92%α,分别。治疗sIL6Rα仅此一项就导致IL6在培养基中的释放增加了88%。

3.1。IL6在人血管内皮细胞中敲低基因的转录调节

分别在有无sIL6R的情况下，对il - 6下调后的人血管内皮细胞进行RNA测序，以评估il - 6在人血管内皮细胞中的自分泌功能。差异表达基因定义为>1.5和a ．在缺少sIL6R的情况下击倒IL6α导致1915个差异表达基因(886个上调，1029个下调)，以及在sIL6R存在时IL6的敲减α结果有1967个差异表达基因(903个上调，1064个下调)。在有无sIL6R的情况下，il - 6敲低后的前25个上调和下调基因α在补充表格中1–2．最调节白细胞介素6基因后击倒,我们发现细胞因子和细胞因子受体(IL1A、TGFB2和TGFBR1),对细胞粘附蛋白重要(NEGR1, PDZD2, LGALS3BP)和蛋白质调节细胞分化(DACT1 MEDAG),而大多数基因表达下调基因参与细胞周期调控(ESCO2 MCM10,和SKP2)，转录调控因子(E2F2, PRRX1)，以及不同的转运蛋白(RAB27B, SLC7A14, SLC44A4)。治疗sIL6Rα单独表达效果有限，仅导致59个差异表达基因(51个上调，8个下调)(补充表)3.）.

如图维恩图(图2)在sIL6R缺失和存在的情况下，受IL6敲除差异调节的基因之间存在主要重叠α. 总的来说，1549个基因在这两种情况下是共同的，相当于大约80%的所有差异表达基因。

为了评估在人内皮细胞中IL6敲低后差异调控的基因是否被已知的IL6调控，我们使用IPA和STRING数据库来识别已知的IL6调控因子和调控靶点。在我们的数据中发现的1915年IL6敲除后的差异调节基因中，1354个(70.7%)以前在STRING数据库或智颖性知识库中没有被描述为IL6邻居(图)3（a））.完整的基因列表可以在补充表中找到7．另外，在10%高表达基因和低表达基因中，比例略低(66.4%， ）之前在STRING或智慧型知识库中没有被识别为第一个或第二个邻居(图3（b））.

3.2。IL6核心基因的转录调节

正如预期的那样，IL6的敲低影响已知参与IL6信号传导（称为“IL6核酸”）的基因的转录。如图所示4（和补充表4)IL6敲除后，IL6R和IL6ST/gp130以及STAT3、JAK1和JAK2上调。相反，作为IL6信号负调节因子的SOCS3被IL6基因敲除下调。在IL6受体存在的情况下，IL6基因敲除的模式非常相似（数据未显示）。

3.3.IL6经典信令和传输信令

接下来，我们评估了IL6下调后的差异表达基因是通过IL6经典信号还是转导信号来调控的。HUVECs用sgp130Fc融合蛋白(sgp130Fc)处理，该蛋白可以特异性阻断IL6转信号[24]．首先，我们在我们的模型中验证了sgp130Fc确实可以阻断il6介导的转导信号。如图所示5，sgp130Fc显著降低IL6转导-（IL6+sIL6R-）介导的STAT3磷酸化，而IL6经典信号-（仅IL6）诱导的STAT3磷酸化不受影响。然后，从差异表达最显著的基因中选择三个基因的基因表达（见补充表）1）在SGP130FC处理的样品中分析，以及IL6敲低样品和未处理的对照。如图所示5，这些基因均未受sgp130Fc的影响，说明这些基因受IL6经典信号通路的调控。

3．4．IL6下调调控基因的功能分析

为了阐明il - 6在血管内皮细胞中调控哪些功能，我们进行了基因本体论研究[25]使用Ingenuity路径分析进行富集分析。在IL6敲除后，共发现10条标准路径富含差异表达基因（补充表5).在应用Benjamini-Hochberg的FDR阈值为5%后，其中6个GO基因组仍然显著富集。在存在和不存在sIL6R的情况下击倒IL6α显示了类似的模式（数据未显示），其中大多数途径在两种条件下都富集。为了调查富集途径重叠的程度（即，如果同一组基因包含在多个富集途径中）在缺少sIL6R的情况下，IL6敲除后的十条富集途径及其差异表达基因α被绘制(图6）.10条富集途径共包含140个差异表达基因，其中95个(68%)仅在一条富集途径中发现。其余45个基因(32%)存在于两条或两条以上的通路中，而19个基因(14%)属于三条或三条以上的通路。对应的数字6丰富通路仍在应用Benjamini-Hochberg罗斯福阈值在5%如下:总共有89个基因,其中有67独特的(75%),22个基因(25%)被发现在两个或两个以上的途径,和11个基因(12%)属于三个或更多途径。

接下来，我们评估了IL6敲低后富集的疾病和生物功能。在缺乏sIL6R的情况下，IL6敲低后，总共有32种功能被富集α34在sIL6R存在下α（补充表6).与经典途径相似，在存在和不存在sIL6R的情况下，IL6被击倒α显示了类似的模式，其中大多数功能在两种情况下都得到了丰富。所有显著丰富的功能或疾病都根据它们在Ingenuity知识库中所属的主要类别进行分类，并绘制了每个类别中激活和抑制功能的数量。如图所示7丰富的生物功能包括细胞周期；细胞运动；DNA复制、重组和修复；细胞组装和组织；细胞间信号和相互作用；心血管系统发育和功能。

我们进一步研究了属于“心血管系统发展与功能”范畴的功能。如表所示1，此类别中的所有五种功能由IL6敲低激活，它们均与内皮细胞的内皮相互作用，结合或粘附相关。所有这五种功能都有相当大的重叠，并且42个差异表达的分子在功能“内皮细胞的相互作用”覆盖其他四个功能中包括的所有差异表达基因。使用来自“内皮细胞的相互作用”功能与IL6核心基因一起使用42个差异表达基因产生网络（图8）.

该网络表明，IL6核心基因之间的大多数相互作用和参与内皮细胞内皮细胞的内皮细胞结合和内皮细胞结合的基因将通过Stat3介导。

4.讨论

在本研究中，我们通过sirna介导的基因沉默和RNA测序来研究IL6在培养的人内皮细胞中的自分泌功能。与一般的假设相比，IL6Rα仅在白细胞和肝细胞上表达[9]，我们最近显示人类内皮细胞表达功能性IL6Rα暴露于il - 6会导致人内皮细胞的细胞内信号传导[5]．我们进一步报道了人类内皮细胞中的IL6经典信号传导和转铁症诱导不同的分子信号传导事件，导致不同的细胞反应[5]．在目前的研究中，在sIL6R存在和不存在的情况下进行IL6的敲减α为了研究白细胞介素6在人内皮细胞中的自分泌功能，在既允许经典信号又允许转导信号的条件下。

本研究获得的数据证实，IL6在人内皮细胞中以自分泌的方式发挥作用，IL6的下调会导致大量基因表达的改变。此外，内皮细胞暴露于sIL6Rα诱导IL6释放增加，表明IL6转导信号的激活诱导正反馈回路，导致IL6的进一步合成和释放。这一概念已被提出用于IL6介导的转导[26]，但迄今尚未发现il6介导的经典信号传导。我们也报道了IL6R的mRNA表达α同时，信号转导子gp130在IL6基因敲除后上调。这与我们之前在蛋白质水平上所显示的一致[5]这表明细胞通过增加受体的表达来补偿IL6信号的丢失。

众所周知，JAK/STAT通路是许多不同细胞因子的重要信号转导级联[27]．具体来说，已知JAK1、JAK2和STAT3是由IL6诱导的下游信号分子[28]．虽然它们的活性主要受蛋白磷酸化调控，但我们在这里报道，它们也受IL6敲低的转录调控。SOCS3是IL6信号的负调控因子[29]已知由IL6信号诱导[30].在我们的数据中，SOCS3因IL6敲除而下调，这并不奇怪，因为IL6水平降低时IL6信号降低。

大量证据表明，il6介导的转信号在不同的细胞中引起了大量的促炎反应[12]．当人内皮细胞产生和释放IL6时，暴露于sIL6Rα理论上应该激活IL6介导的经次分子，从而导致许多不同基因的基因表达改变。然而，在本研究中，当用重组SIL6R处理细胞时，只有59个基因差别调节59个基因α．这与近2000个在IL6敲除后受到差异调控的基因形成了对比。此外，在有或没有sIL6R的情况下，IL6的下调α结果发现了非常相似的转录模式，这表明这些基因中的大多数调控独立于sIL6Rα受体。这表明IL6在人内皮细胞中的自分泌功能主要是通过IL6经典信号途径介导的。我们的数据进一步表明，IL6经典信号在培养的人内皮细胞中持续活跃，因为IL6的敲除显著改变了转录模式。对于IL6敲除后的三个顶级调节基因（NEK7、TMEM87B和ESCO2），我们还表明，使用sgp130Fc特异性阻断IL6转导[24]不会改变这些基因的基因表达，表明它们是由IL6经典信号调节的。虽然暴露于SIL6Rα单独导致差异表达59个基因，可能比内皮细胞能够产生更高水平的IL6，以产生诱导血管内皮细胞中的透析介导的肾上腺炎的促炎反应。

通过将IL6敲低回到公共数据库（字符串和IPA）之后的差异调节基因进行比较，我们注意到，大约百分之七十分之一的差异调节基因尚未被报告为IL6的第一或第二邻居。当对10％最高和下调的基因进行相同的比较时，在先前报道的IL6的第一和第二邻居中发现了略微较高的基因比例。然而，在公共数据库中的第一个或第二个邻居到IL6中，在第一个或第二个邻居中不能发现大约三分之二的大约三分之二的基因。因此，在本研究中，我们确定了前面尚未被报告为IL6调节的大量基因。虽然最先前的研究已经评估了高水平的IL6的影响，模仿炎症条件，我们选择一种不同的方法，在那里我们检查了从细胞中减少IL6生产的结果。这种方法使我们旨在鉴定在人类内皮细胞中通过IL6进行自分割调节的新型基因。

通过使用IPA，我们发现与基本细胞功能相关的途径和功能（如细胞周期、信号或细胞运动的调节）作为IL6敲除的结果进行调节。与细胞周期调节相关的途径和功能被抑制，作为对IL6敲除的反应，表明IL6以自分泌方式控制细胞周期进程。这与先前的研究结果一致，表明暴露于IL6可促进人内皮细胞的细胞周期进程上皮细胞[31]，以及其他类型的细胞[32- - - - - -34]此外，IL6敲除导致与迁移和细胞移动相关的功能激活，表明IL6以自分泌方式控制细胞移动和迁移。

为了评估富集的典型途径是否重叠，我们将这些途径及其相应的基因绘制在一起。正如预期的那样，在被抑制的途径中，大多数基因表达下调，而在激活的途径中，大多数基因表达上调。这些典型通路之间的重叠相对较小，大约三分之二的基因在一个通路中是独特的，这表明，在人类内皮细胞中，il - 6的下调会影响与信号传导和细胞周期调节相关的几个不同的典型通路。

当我们使用人类血管内皮细胞作为模型来研究IL6的自分泌功能时，我们进一步评估了与“心血管系统发育和功能”相关的丰富功能这一类中的所有富集功能都与内皮细胞的结合、粘附或相互作用有关，并且所有这些功能都被预测在IL6敲除后被激活。通过将这些功能中的差异调节基因与已知在IL6介导的信号传导中起中心作用的基因相结合，形成了一个合并的网络该网络表明，IL6介导的信号传导与内皮细胞的相互作用、结合和粘附之间的相互作用主要通过STAT3介导。综上所述，我们的数据表明，IL6以自分泌方式抑制血管内皮细胞的结合、粘附和相互作用。而高水平的外源性IL6具有据报道，een可增加淋巴细胞与内皮细胞的粘附[35]我们的数据表明，IL6的自分泌功能可能与此相反，并可能促进非粘附性内皮表型。

5.结论

本研究表明，人类内皮细胞中IL6的敲低导致转录模式的显着变化，并确定了在人内皮细胞中对IL6的自分泌调节下的大量新基因。本研究还揭示了IL6在人内皮细胞中的自分泌功能似乎与基底细胞功能有关，例如细胞周期，信号传导或细胞运动的调节，并表明IL6在人内皮细胞中的自分泌功能介导通过IL6经典信令。

缩写

FDR：	错误发现率
人脐静脉内皮细胞：	人脐静脉内皮细胞
白细胞介素6:	白细胞介素6.
IL6R.α:	白细胞介素6受体α
IL6ST:	白介素6信号传感器
投资促进机构：	创新途径分析
sgp130Fc:	可溶性糖蛋白130 Fc融合蛋白
siRNA：	小干扰RNA
sIL6Rα:	可溶性白细胞介素6受体α
VEGF:	血管内皮生长因子。

数据可用性

当前研究中生成和分析的数据集可在NCBI的基因表达综合库中找到[36]可通过GEO系列登录号GSE141783访问(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE141783）.

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了知识基金会、Längmanska基金会和老仆人基金会(Stiftelsen fӧr Gamla Tjänarinnor)的资助。

补充材料

补充表1:IL6敲除在人内皮细胞中诱导的前25个上调和下调基因。补充表2:IL6敲除在可溶性IL6受体存在时诱导的前25个上调和下调基因α在人内皮细胞中。补充表3:可溶性IL6受体诱导的差异调控基因α在人类内皮细胞中。补充表4：人类内皮细胞中IL6的敲除导致已知参与IL6介导信号的蛋白质的基因表达改变。补充表5：人类内皮细胞中IL6基因敲除导致的典型途径富集。补充表6：人类内皮细胞中IL6敲除导致的疾病和生物功能丰富。补充表7：人类内皮细胞中新的IL6调节基因。（补充材料）

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