瘦素调节ILC2细胞在过敏性鼻炎PI3K / AKT通路

文摘

背景。最近的研究表明,瘦素参与Th2反应过敏性鼻炎(AR)。然而,瘦素的影响在II型先天淋巴细胞(ILC2s)的基于“增大化现实”技术不是很透彻了。方法。26 AR患者与健康对照组20人被录取。血清中瘦素水平测定,并与ILC2和II型细胞因子的相关性进行了分析使用酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术。ILC2分化和细胞因子生产刺激由人类重组瘦素分析实时聚合酶链反应(PCR)和ELISA。AR小鼠模型也被建立来验证ILC2细胞监管瘦素的影响。结果。我们的研究结果表明,升高血清中瘦素在AR患者的比例与ILC2和II型细胞因子的表达。重组瘦素增强ILC2细胞转录因子的表达和II型细胞因子通过PI3K / AKT通路。AR与瘦素显示小鼠强ILC2炎症和症状与控制老鼠。结论。我们的数据提供了证据表明upregulation瘦素促进ILC2反应AR和这一过程是通过PI3K / AKT通路。

1。背景

流行病学调查显示,大约有5亿个过敏性鼻炎(AR)患者在世界范围内,影响生活质量的10% - -20%的人口(1]。近年来,基于“增大化现实”技术在中国的发病率逐年增加。值得注意的是,肥胖的发生率也增加同步(2]。肥胖已被证明是一个重要的风险因素呼吸道变应性炎症的发生和发展(尤其是哮喘)(3]。

白色脂肪组织可以调解会通过分泌大量的脂肪代谢影响因素在肥胖病人,包括瘦素和脂联素、瘦素被认为是核心的媒介连接营养、代谢和免疫内稳态4]。瘦素已被证明促进人类和老鼠的Th1反应,但其作用Th2反应尚不清楚(5- - - - - -7]。之前的研究表明,AR患者的血浆瘦素水平,显著提高,与临床症状的严重程度呈正相关8,9]。瘦素及其受体的结合,激活JAK2-STAT3, MAPK和PI3K-AKT通路(10,11]。

ILC2广泛分布在adipose-associated淋巴组织、肠、肺、皮肤和是一个重要的早期阶段的免疫反应。直接激活ILC2过敏原诱导epithelial-derived细胞因子的分泌,如IL-25 IL-33,和TSLP IL-13, IL-5, il - 4, IL-9 [12]。研究发现,肺ILC2的肥胖老鼠的数量没有减少,尽管ILC2肥胖病人的内脏脂肪细胞和小鼠显著降低(13,14]。这些结果表明ILC2是显著影响下肥胖状态。研究还表明,ILC2s的频率明显减少雌性喂养和瘦素deficiency-induced肥胖(15]。

在这项研究中,我们旨在探索人类重组瘦素的影响在ILC2的分化和功能在活的有机体内和在体外研究。

2。方法

2.1。病人

26 AR患者没有肥胖和20个健康对照组没有肥胖在这项研究招募了。如过敏性鼻炎所述及其对哮喘的影响指南(2010),基于“增大化现实”技术的诊断根据症状和持续时间,过敏原测试常见吸入性过敏原(尘螨、宠物、模具、蟑螂等)通过皮肤针刺试验或特定的IgE测量(1]。排除标准包括以下:特应性皮炎、哮喘、鼻解剖异常,和使用系统性糖皮质激素在前2个月。这项协议被当地伦理委员会董事会批准,和书面知情同意。

2.2。流式细胞术对ILC2

外周血单核细胞(PBMCs)准备使用Lymphoprep(费森尤斯公司Kabi挪威,奥斯陆,挪威)密度梯度离心法从肝素化leucocyte-enriched淡黄色的外套。孤立的PBMCs被培养与rpmi - 1640 /毫升24-well盘子补充人类AB血清,5% 5更易/ L谷氨酰胺,青霉素和链霉素溶液(从Sigma-Aldrich所有从表达载体,除了血清)。然后,PBMCs被PMA刺激(50 ng / mL)和ionomycin (500 ng / mL;Sigma-Aldrich) 4小时和通过brefeldin (BD、牛津、英国)文化的最后3小时。

PBMCs从捐赠者被抗体染色混合物(FITC血统鸡尾酒:张(RPA-2 10), CD3 (OKT3), CD14 (61 d3), CD16 (CB16), CD19 (HIB19)、CD56 (TULY56) CD235a (HIR2) eBioscience,圣地亚哥,CA)和FceRI (9 e1, eBioscience) B的排斥,T,自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞以及肥大细胞和嗜碱粒细胞。这个过程大约50%纯林^{- - - - - -}细胞。的林^{- - - - - -}细胞被染色与APC / Cy7-conjugated CD45抗体(2 d1), PE-conjugated CRTH2抗体(BM16 BD生物科学,新泽西),和PE-Cy7-conjugated CD127抗体(HIL-7R-M21 BD生物科学,新泽西)人体ILC2s鉴定。人类ILC2s被确定为林^{- - - - - -}CD45⁺CRTH2⁺CD127⁺淋巴细胞。老鼠在PBMCs ILC2s确认为林^{- - - - - -}(识别β(H57,597)细胞γδ(eBioGL3), CD3ε(145年,2 c11), Gr-1 (RB6 8 c5) CD11b (M1/70), TER - 119 (TER, 119), B220 (RA3中6 b2), NK1.1 (PK136), CD5(53岁,7.3),和CD11c ST2 (N418))⁺(2)RMST2 CD45⁺(104)CD127⁺(A7R34)淋巴细胞。IL-5 (JES1-39D10), il - 4(3010.211),和IL-13 JES10-5A2 ILC2阳性细胞PBMCs测定细胞内细胞因子染色使用Cytofix (BD生物科学,NJ)根据制造商的指示。贝克曼流式细胞分析仪机测试中使用(美国贝克曼库尔特,大力神,CA)。

2.3。ILC2排序

使用EasySep FITC选择装备,外周血血统积极(林⁺)细胞PBMCs被移除,然后血统负(林^{- - - - - -})细胞丰富。然后,林^{- - - - - -}CRTH2⁺CD127⁺细胞( 细胞/毫升)丰富通过染色PE-labeled CRTH2和PE-Cy7-labeled CD127使用MoFlo XDP细胞分选仪(美国贝克曼库尔特,CA)和培养rpmi - 1640年有10%的边后卫和1%青霉素和链霉素为3天。生存能力大于98%(台盼蓝染色)。同时,IL-25 (10 ng / mL), IL-33 (10 ng / mL), TSLP (10 ng / mL)和2 (50 ng / mL)补充道。瘦素对刺激实验,100 ng / mL, 100 ng / mL LY294002 (PI3K特定抑制剂),100 ng / mL AG490(木菠萝抑制剂),和100 ng / mL SB203580 (MAPK抑制剂)补充道。PBS是用作负控制。细胞因子和抑制剂都购自研发系统。剂量反应实验来确定执行刺激器的浓度。刺激浓度不同的刺激器被证实在预备考试。增殖率是评估通过的氚化胸苷。

2.4。实时定量PCR(存在)

从ILC2s总RNA分离试剂盒试剂(生活技术,卡尔斯巴德,加州)。RNA (1μg)被DNase我消化,提取苯酚:氯仿(3:1),用乙醇沉淀,用乙醇洗净,溶解在RNAse-free水,和reverse-transcribed cDNA工具包(试剂盒)。PCR扩增检测使用ABI棱镜7300检测系统。计算的数据是2^{- - - - - -ΔΔCt}方法。目标基因的相对表达是GAPDH规范化。列出的测试中使用的引物如下:GATA3意义上,5 - - - - - -GCGGGCTCTATCACAAAATGA-3 ,反义,5 - - - - - -GCTCTCCTGGCTGCAGACAGC-3 ;RORα意义上说,5 - - - - - -AAGGAGCCAGAAGGGATGAAC-3 ,反义,5 - - - - - -GGAACA ACAGACGCCAGTAAG-3 ;GAPDH意义上,5 - - - - - -AGCCACATCGCTCAGACAC-3 ,反义,5 - - - - - -GCCCAATACGACCAAATCC-3 。

2.5。免疫印迹

ILC2细胞细胞溶解的寒冷里帕缓冲区,和样本分开使用10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳(页面)。被5% TBST-milk 60分钟后,PVDF膜与鼠标anti-pAKT(5孵化。Ser 473)和β肌动蛋白(克隆:C4)(圣克鲁斯,1:1000)在一夜之间在4°C。与辣根孵化后peroxidase-labeled anti-rabbit免疫球蛋白抗体,增强化学发光信号测量的工具(皮尔斯,罗克福德,IL)。

2.6。酶联免疫吸附试验(ELISA)

II型细胞因子的浓度(il - 4、IL-5 IL-13) ILC2孤立的文化上层清液从病人血液和血清中瘦素水平是由ELISA试剂盒检测(美国研发系统)的协议由制造商提供。的敏感性分析如下:il - 4, 0.22 pg / mL;IL-5 3.9 pg / mL;IL-13 125 pg / mL;瘦素,15.6 pg / mL。

2.7。动物模型

BALB / c小鼠被安置在特定的无菌屏障设施和免费的食物和水。0天,第七天,老鼠有100μ包含100 L (PBSμ卵子的g (1μ克/μ左)和1.6毫克Al (OH)₃腹腔内。10μ100年g的卵子μ10 L (PBS有或没有μ10 g / mL瘦素,μg / mL antileptin(中和抗体),或10μg / mL LY294002给予鼻地天15日16日和19日如前所述[16]。细胞因子和抑制剂都购自研发系统。老鼠被杀后的第二天最后一个鼻刺激。的频率ILC2细胞PBMCs决心通过流式细胞术。

2.8。统计分析

所有的数据都显示 。测试或非参数Mann-Whitney克鲁斯卡尔-沃利斯H执行测试除了额外的注意。瘦素和其他参数之间的相关性被斯皮尔曼等级相关分析评估。一个小于0.05的价值被定义为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。血清中瘦素水平及其与ILC2相关频率和II型细胞因子的生产

表中列出的信息的参与者1。血清中瘦素的水平AR组明显高于与控制( 纳克/毫升vs。 ng / mL, )。的频率ILC2, il - 4⁺ILC2, IL-5⁺ILC2, IL-13⁺ILC2 AR患者明显升高与控件(数字1和2)。瘦素水平的升高血清ILC2的频率有显著相关性(图2)和il - 4的频率⁺ILC2 ( , ),IL-5⁺ILC2 ( , ),和IL-13⁺ILC2 ( , )。

3.2。ILC2细胞转录因子的表达和II型细胞因子由瘦素刺激

由瘦素刺激后,GATA3和ROR的表达α由ILC2孤立的从血的患者明显增加。II型细胞因子的生产ILC2孤立的文化上层清液从血液中瘦素刺激后的病人也是调节。然而,上述效应抑制PI3K-AKT抑制剂或antileptin时添加的系统(图3)。

3.3。瘦素促进ILC2在老鼠的反应

血清中瘦素浓度,OVA-specific IgE水平,鼻摩擦和打喷嚏,并在PBMCs ILC2的频率明显高于在基于“增大化现实”技术的老鼠比控制老鼠,尤其是在老鼠瘦素处理。我们的研究结果也显示,antileptin变弱过敏炎症和ILC2的频率(图4)。

4所示。讨论

在这项研究中,我们研究了瘦素的影响在ILC2细胞和动物模型。我们的研究结果证实,瘦素可以调节由针对PI3K-AKT ILC2通路的功能。

瘦素是由脂肪组织分泌的,也存在于淋巴器官(10,11]。由于肥胖的患者被排除在外,我们相信淋巴器官可能是瘦素的重要来源。此外,瘦素的影响公差也避免了除肥胖的科目。因此,与肥胖AR患者需要进一步的研究来阐明瘦素在先天免疫耐受的作用。

在适应性免疫,发现瘦素在人类和小鼠引起Th1反应,但其效果在proallergic Th2反应仍存在争议。最近的研究证明,瘦素促进Th2细胞增殖、存活和细胞因子的生产。此外,我们之前的研究表明瘦素还涉及由诱导ROR Th17免疫反应γt转录在基于“增大化现实”技术6,7,17]。我们的研究结果也显示,当地治疗系统性IgE瘦素促进生产,这可能是由于局部il - 4的表达升高对骨髓的影响通过血液循环。此外,Th2细胞的增殖和细胞因子的生产由瘦素可以诱导il - 4的表达,有助于IgE生产人类和老鼠。然而,瘦素的作用在先天免疫特征并不好。

在目前的研究中,我们发现血浆瘦素水平均明显高于AR患者相比,控制和与II型细胞因子的水平。我们还表明,瘦素,肥胖者的adipokine升高,促进了ILC2的函数,证明了调节GATA3和ROR的表情α和II型细胞因子的生产。一致,郑等。研究还表明,瘦素促进Th2细胞增殖和存活和ILC2和生产2型细胞因子,它在一起导致过敏性哮喘(18]。

瘦素的行为由多个信号通路调节免疫细胞的功能,如JAK2-STAT3、MAPK和PI3K-AKT [10,11]。例如,leptin-STAT3途径证明调解细胞生存在海马神经元19]。此外,瘦素对凋亡的影响通过激活ERK1/2和AKT-mTOR通路Th1 / Th17细胞(20.]。有趣的是,瘦素的抗凋亡作用依赖于MAPK激活,而不是PI3K通路在人类Jurkat T细胞(21]。我们目前的研究表明瘦素介导的影响通过PI3K-AKT ILC2 AR。我们的途径在活的有机体内研究还表明,瘦素促进ILC2炎症通过PI3K-AKT通路,这证实了在体外结果。

在我们的研究也有一些局限性。首先,样本量小和大样本量进一步的研究是必要的。其次,肥胖的问题在我们的研究中被排除,消除肥胖状态的影响瘦素的表达。因此,研究瘦素在肥胖ILC2监管AR患者需要。第三,进一步的研究与Rag-deficient老鼠缺乏淋巴细胞应该在ILC2s用来证实瘦素的影响。第四,系统性的治疗应该研究探讨瘦素在小鼠模型的系统性影响瘦素ILC2的规定。

5。结论

总之,我们的研究结果建议leptin-mediated ILC2细胞的分化和功能调节通过瘦素和PI3K-AKT信号通路,提供一个新的潜在的治疗目标。

缩写

基于“增大化现实”技术:	过敏性鼻炎
ILC2:	II型先天淋巴细胞
ELISA:	酶联免疫吸附试验
存在:	定量实时PCR。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

这项协议被当地伦理委员会董事会批准。

同意

书面知情同意。

的利益冲突

作者宣称他们没有相关的利益冲突。

作者的贡献

Wenlong刘博士和罗Renzhong概念化和设计研究,起草了最初的手稿,手稿和批准最终的提交。罗博士清香曾,Xi,听泉唐收集样本;进行实验、数据收集和统计;审查和修订后的手稿;提交和批准最后的手稿。罗清香曾,Xi,听泉唐本研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

本研究支持由中国国家自然科学资助(81600785号、81700892号和81970861号),广州的珠江科技新星计划(201710010085号),和关键的临床专业广州市妇女儿童医疗中心的儿科研究所的格兰特的广州市妇女儿童医疗中心(yip - 2016 - 022, pre -国家自然科学基金委- 2018 - 005)。

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