缓解喉咙痛公式产生治疗效应通过免疫调节和NF -咽炎κB通路

文摘

缓解喉咙痛公式(RSTF)是中国食品和药物管理局批准的一个公式,用于治疗咽炎的临床多年。然而,潜在的药理机制仍然未知。我们结合多种方法包括生物信息学数据挖掘、网络药理学分析和路径分析来预测RSTF的潜在目标。我们验证计算机预测结果与体内/体外抗菌效果测试,老鼠吞噬指数测试,小鼠脾淋巴细胞的增殖,转换和迁移。变更NF -κB通路是由免疫印迹、免疫荧光和PCR。体内实验证明了RSTF可以显著减轻咽炎的症状。一只老鼠唾液分泌试验表明,RSTF能有效缓解口腔干燥症状。酚红排泄测试表明RSTF有化痰的效果。热板法和肉芽肿实验证明RSTF也有镇痛和抗炎作用。70年计算机预测表明,活性化合物的RSTF过滤掉到84年ADME筛查和假定的目标与不同的疾病。通路富集分析表明,候选目标主要是细菌和免疫反应相关信号通路,咽炎的贡献者。实验结果证实,RSTF对咽炎施加疗效的差别主要是由抗菌效果和对这些NF -κB的活动。它演示了在硅和体内/体外RSTF施加治疗咽炎的影响主要是通过一种抗生素的差别效应和对这些NF -κB信号通路。

1。介绍

咽炎是各种感染性和非感染性炎症引起的咽粘膜,粘膜或淋巴组织,是上呼吸道炎症的一部分1]。咽炎分为急性和慢性类型。大多数急性咽炎是由感染引起,慢性咽炎往往是继发于急性咽炎除了其他外部因素,它可以通过一些复杂的向下的炎症,如急性或慢性喉炎、支气管炎和肺炎1,2]。感染的恶化也可能导致系统性并发症,如急性肾炎、脓毒症、风湿热、和其他疾病3- - - - - -5]。咽炎的发生率已达20% - -50%根据流行病学统计(6,7]。咽炎是一种常见的上呼吸道疾病的成人患者病程长,症状顽固,难以治愈。大多数病人患有各种各样的咽部不适,如异物感、烧灼感,干燥,瘙痒,轻微的疼痛,早上和频繁的刺激性咳嗽,有些甚至有恶心和呕吐症状(8]。现在认为咽炎不仅是一种身体疾病,还在许多患者心理障碍(9]。复发性咽炎是耐火材料,往往造成了很大的影响患者的生活和工作。因此,迫在眉睫的是缓解咽炎的进展。

咽炎的发病机制至今仍不清楚。据报道,相邻的上呼吸道病变,气候和地理环境的变化,职业因素、系统性因素和过敏因素可以引起咽炎(1]。咽炎的发生和发展是互动的结果的多个信号通路障碍多基因的分子组成的网络。大多数药物用于临床治疗咽炎药物抗生素或单个组件有限目标,和治疗效果往往不能令人满意10]。经过一段长时间的治疗,病人会对药物产生耐药性,这甚至会引起严重的毒性和副作用11- - - - - -13]。因此,调查人员在中国和其他亚洲国家试图寻求替代从中医治疗咽炎或天然的草本植物,其中一些在临床研究取得了可喜的效果。

RSTF已被用于治疗咽炎的临床多年,这是由七个草药,包括Hedysarum Multijugum格言(嗯),等•女贞子(算法)、白术macrocephala Koidz (AMK) Curcumae基数(CR)、茯苓等)。狼(PCW) Oroxyli精液(OS), Euphorbiae Helioscopiae草(EHH)。这七个包含许多中药有效成分,这可能会产生一个“添加”效应通过作用于相同的单一目标或个人目标之间的协同效应产生的同时;所有这些构成了重要的药效机制的内涵。中药实现治疗效果主要通过针对多个生理途径在同一时间。然而,当前的研究中药而言,积极代理在中国草药很多,也很难确定(14]。虽然在诊所RSTF有效治疗咽炎,潜在的药理机制仍然未知。因此,有一种紧迫感,寻求一种有效和准确的方法来阐明背后的机制。

随着网络药理学的发展技术,研究中医的想法转换从单一component-single系统性监管目标。2007年,Yildirim等人首次应用网络生物学的概念。通过药物和药物交互数据的综合分析,发现大多数药物通过间接调控,而不是直接在疾病相关蛋白(15]。同年,霍普金斯提出了一个网络药理学研究方法。相信药物作用于多个目标和生产合作通过多个目标之间的相互作用和衰减的影响。当前的组学技术和生物信息学提供了计算和实验策略对网络药理学(16- - - - - -18]。使用系统的药理学方法,我们研究了RSTF的药理机制,目的是了解它的影响在系统,器官,和分子水平。一个体内实验表明,RSTF施加显著的促进液体,滋润干燥、解决痰,镇痛效果。与此同时,体内和体外药效学实验表明RSTF咽炎的症状可以减轻通过抗菌和免疫调节功能,这是与在硅片的预测一致。网络药理学研究问题从相互联系的角度完全配合中医的核心理念。因此,网络药理学中医的应用具有独特的优势和巨大的发展潜力。

2。材料和方法

2.1。试剂和动物

RSTF由七个植物材料,包括嗯,算法,AMK、CR、物理化学加工,操作系统,和EHH。Yu-ping-feng粒子(YPFP)是购自国药控股集团广东全球制药有限公司有限公司(中国);Lanqin口服液是来自长江制药集团有限公司有限公司(中国);醋酸地塞米松(DXM)和脂多糖是从Sigma-Aldrich购买(美国);阿司匹林是拜耳(德国);盐酸ambroxol从阿拉丁(中国)和阿托品,伴刀豆球蛋白(ConA)从Biosharp(中国);肿瘤坏死因子(TNF -α)从bios(中国)。GAPDH的抗体,NF -κB, p65-NF -κB从Abcam购买(英国)。

所有的动物都是从上海买SIPPR / BK实验动物有限公司他们提出控制湿度(55 - 65%),温度( ),和日常光强度(12 h / 12 h光/暗周期)和美联储与水和标准饮食随意。实验性的协议已经被委员会批准南京中医药大学实验动物保健,和所有的动物人道关怀的指导方针美国国立卫生研究院(美国)。

2.2。药效学

2.2.1。老鼠唾液分泌试验

雄性老鼠重180 g - 220 g被随机分为六组,与胃内的政府(100 mL / g)每天一次,连续用药6天,和前禁食12小时测试;水是不允许的。阿托品(0.16毫克/公斤)是由上届政府强饲法三十分钟后,老鼠麻醉,是测定唾液分泌。老鼠是固定的,和干棉花球( 毫克)被放置在老鼠的舌头来测量老鼠的唾液分泌。棉花球改变了每两个小时三十分钟;最大值的唾液分泌计算重量的差异之间的棉花球。

2.2.2。酚红排泄试验

ICR小鼠随机分为5组,每组十:空白对照组、阳性药物组(盐酸ambroxol),和三个剂量的RSTF组(5.625克/公斤,11.25克/公斤,和22.5克/公斤)。老鼠intragastrically连续八天每天服用一次,和2.5%的酚红盐溶液(0.1毫升/ 10 g)在30分钟后腹腔内接种管理。小鼠安乐死和固定注入,三十分钟后,气管插管和连接到注射器。结合三个清洗液体和把它们一段时间沉淀杂质;清晰的红色浮在表面的拍摄,其吸光度与分光光度计测量在545海里。计算酚红的数量根据标准曲线。

2.2.3。唾液酸分泌试验

每组大鼠在intragastrically管理100 mL / g(对照组给予同等体积的生理盐水)每天一次连续七天。老鼠安乐死,气管插管后一个小时的上届政府。1毫升prewarmed盐水(37°C)在慢慢吸入气管,然后轻轻吸出;这是重复这两次。离心后取上层清液,检测用唾液酸(SA)测试箱两小时内。每个样本分为两个稀释,每个稀释测定两次,取平均值。

2.2.4。热板法

恒温器的温度热板调整 ,和固定板放置在一个大烧杯。鼠标放到热板之间的时间,后面舔脚痛反应时间。筛选合格的小鼠舔后足反应10 ~ 30秒内受到后续实验(幸免型和跳投被抛弃)。一旦小鼠舔后足反应,他们立即取出,防止伤害。五十个合格的老鼠被选,随机分为五组十成功实验。每组小鼠的痛阈之前管理测量和记录。经过七天的持续管理,疼痛反应测定15岁,30岁,45岁和60分钟后的第七天。在测试,如果老鼠没有痛苦的60秒内反应,他们应该立即取出,结果应记录根据60秒。增加的百分比计算如下: 。

2.2.5。模型大鼠棉球肉芽肿

雄性老鼠重180 g - 220 g是麻醉和随机分为五组;腹部的头发被小心。两个消毒棉花球(每个重达50±5毫克,热压处理过的,含有1毫克/ 0.1毫升的氨苄西林,和烘干的50°C),分别植入老鼠的两侧腹股沟皮下环;与手术缝合伤口。在连续管理七天,第八天老鼠被实施安乐死。棉花球被干12小时后取出,体重60°C;减去的重量原始棉球肉芽肿的重量。

2.2.6款。Agar-Induced大鼠肉芽肿模型

老鼠和异氟烷麻醉,在无菌条件下操作,和2毫升2%的琼脂溶液在中线皮下注射的老鼠回来了(注意保温,避免琼脂凝固,和不泄漏液体影响拔针时琼脂)的重量。政府开始造型后第二天,每天一次,连续15天。十五日,肉芽肿琼脂块切割,用滤纸吸收。肉芽肿重量的差异管理组和模型组相比,计算肉芽肿瘤抑制率:肉芽肿抑制 。

2.3。收集RSTF的化合物

2.3.1。数据准备和筛选活性化合物

合成化合物的草在RSTF获得TCMSP (http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)。TCMSP是一个独特的系统药理学平台捕获的中国草药药物之间的关系,目标,和疾病。数据库包括化学品、目标和药物靶网络和相关drug-target-disease网络,以及天然化合物的药代动力学属性包括口服生物利用度,drug-likeness,肠道上皮通透性,血脑屏障和溶解度。选择活性化合物通过设置口服生物利用度 ,drug-likeness ,Caco-2渗透率 ,和药物半衰期 作为阈值。

2.3.2。预测RSTF的药物靶点

药物靶点的预测表现如前所述。在硅片的预测模型中,海搜索工具(搜索,http://sea.bkslab.org/4.0),针(搜索工具进行交互的化学物质,http://stitch.embl.de/)组合预测的目标概要文件活跃草药化合物。

2.3.3。目标与咽炎的集合

Pharyngitis-related目标是获得两个主要来源:差异表达基因(度)从公开的微阵列数据和疾病相关数据库。确定之间的主要度正常,pharyngitis-related标本,微阵列数据GEO34205 GEO17732, GEO20262获得基因表达的综合数据库(地理,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),每个芯片和2000个差异基因进行了分析。

2.3.4。CPPI网络建设

假定的RSTF-related目标网络和pharyngitis-related目标网络构造基于他们的交互数据。PPI数据从现有6个进口PPI数据库,包括生物通用存储库交互数据集(BioGRID),生物分子相互作用网络数据库(绑定),分子间相互作用的数据库(薄荷),人类蛋白质参考数据库(HPRD)和数据库交互的蛋白质(下降),BisoGenet搜索的Cytoscape插件。这两个被合并获得核心PPI网络(CPPI)蛋白质间交互作用网络采用Cytoscape软件(版本3.2.1)。

2.3.5。浓缩和路径分析

RSTF-related目标的基因本体论(去)分析是基于ClueGO这是一个插件的可视化nonredundant生物方面对大型基因集群功能分组网络。ClueGO网络是由使用kappa统计,反映条件之间的关系的基础上,相关的基因之间的相似性。术语的意义和组自动计算。和浓缩和通路分析基于大卫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)被用来执行基因本体论(去)或KEGG通路富集分析假定Pharyngitis-related CPPI网络的目标和十字路口。

2.4。RSTF的抗菌效果

2.4.1。在体外

管方法:取应变营养肉汤培养的细菌培养18小时,包括标准的金黄色葡萄球菌、肺炎球菌临床孤立金黄色葡萄球菌,假单胞菌不过epidermidis葡萄球菌、乙型链球菌。稀释浓度的10⁶用无菌生理盐水实验。十个无菌试管;1毫升的营养肉汤被添加到每个管,和1毫升的药品被添加到第一个管。第一个混合管,1毫升液体第二管,在序列稀释。丢弃1毫升液体的第九管,并设置十管控制;没有添加到制药(Lanqin口服液是作为积极的控制)。每个管增加了0.1毫升的细菌和培养18个小时的37°C。然后接种环被放置在营养琼脂板与两个相邻的一个循环中细菌和无菌试管。观察细菌生长eighteen-hour孵化后37°C。没有细菌生长的最高药物稀释设置为最低抑制浓度(MIC)。

板方法:把肉汤琼脂培养基和溶解,倒约20毫升nine-centimeter板,直到凝固。0.1毫升的细菌的解决方案是用1毫升无菌注射器吸均匀凝固肉汤平皿上传播。干燥几分钟后,用无菌钢圈钻四个洞。每个板块注入0.1毫升的药品,并应用一个测试细菌每板。两种不同的液体注入:RSTF Lanqin口服液。带抑制的直径测量尺孵化后37°C二十小时。

2.4.2。在活的有机体内

进行预测的杀伤力细菌(金黄色葡萄球菌和β链球菌)感染小鼠:不同浓度的细菌溶液注射到小鼠的腹腔。立即观察活动和注射后小鼠的死亡时间;细菌溶液的浓度导致死亡率在80 - 90%在72小时内被选为正式的实验。

正式实验:老鼠重达18 g-22 g被随机分成七个组每组二十。每组是intragastrically管理每天一次连续七天。第五天,每组的老鼠(除正常对照组)腹腔注射0.5毫升细菌解决方案的一个小时后管理。政府持续了两天。七天内死亡的观察计算生存时间和存活率。

2.5。老鼠吞噬指数

重达18 g g-22小鼠随机分为5组每组10个。在每组动物不断填喂法直到7天,和墨汁稀释1:5与生理盐水注入尾静脉(0.1毫升/ 10 g)。然后将20μL从静脉丛血液,然后立即将其添加到2毫升0.1% Na2CO3解决方案2分钟(t1), 10分钟后(t2)的注入。光密度(OD)在600 nm用分光光度计测量。小鼠安乐死和解剖;肝脏和脾脏被称量后血涂抹干燥滤纸: ; ,在哪里间隙指数;t2是第二次采取血液后油墨(10分钟);t1是第一次采取血液后油墨(2分钟);OD1 t1的光学密度;和OD2 t2的光密度。

2.6。小鼠脾脏淋巴细胞增殖和转换

脾细胞悬液( )接种于96孔细胞培养板。后增加200μL细胞悬液,嗯,组根据实验设计处理。每个样本有六个复制井。培养后24、48和72小时,离心1000 r / min,执行和上层清液小心丢弃(不含药物本身的色彩干扰)。增加90μL 1640年中每口井和10μL MTT方法,酝酿了四个小时。离心机在1000 r / min去除上层清液,添加DMSO溶液溶解震动,并测量OD在490海里。刺激指数(SI)等于一群被诈骗的OD / OD的控制。

2.7。血清溶血素测定

三个小时后第一个管理,管理组的小鼠的腹腔内注射免疫抗体0.2毫升(包含 素抗体)。两个小时后最后剂量免疫的第七天,从老鼠的眼睛收集血液样本。室温保存血液就一小时,随后在3000转离心10分钟在4°C。一毫升稀释血清抗体和0.5毫升的10%添加到反应管。1毫升的补充后添加到管(或1毫升1:10豚鼠血清稀释),管放置在37°C到孵化十分钟,然后搬到冰浴反应。离心机在2000 rpm管十分钟,取1毫升的上层清液,加3毫升的杜尔贝科试剂(或蒸馏水)混合。十分钟后,200年每个样本和吸管μL到96孔板,并测量OD在540海里。测定血清溶血素的半值表示为溶血(溶血素)。

2.8。白细胞游走

每组大鼠是采取预防性管理。第七天的管理后,每组大鼠麻醉乙醚和后面是使脱毛。在无菌条件下,注入5毫升空气皮下intrascapular地区形成一个环形气囊。第二天,5毫升的2%羧甲基纤维素(CMC)生理盐水注射到老鼠的圆形气囊在0.5到1小时后过去的管理。然后,0.1毫升的液体从圆形气囊在3和7.5小时,分别。收集液体的时候,轻轻摇鼠或媒体在圆形气囊,使液体充分混合。白细胞的数量计算了圆形气囊血细胞计数器。

2.9。西方墨点法

样品的蛋白浓度测定用BCA蛋白质化验设备。总蛋白提取解决10% sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物膜。与BSA阻塞后,膜与Tris-buffered盐水洗五次五分钟,含0.1% Tween-20 (TBST),然后与抗体NF -孵化κB, p-NF -κB,或在4°C GAPDH过夜。洗后,膜在室温下孵化与二级peroxidase-linked山羊anti-rabbit免疫球蛋白一小时。洗后,乐队被增强化学发光检测的蛋白质,蛋白质表达被ChemiScope量化分析。

2.10。细胞培养

提供的NP69细胞系是伯克生物,细胞被维护在1640年包含10%的边后卫,链霉素(100μ(100 g / mL)和青霉素μg / mL)和培养在37°C下5%的股份有限公司₂。

2.11。实时聚合酶链反应

从NP69细胞总RNA提取使用一种核糖核酸酶迷你包(Transgen,北京)和反向转录。引物的il - 6,引发,il - 1β设计并合成,ICAM1基于发表的序列:il - 6 (5 - - - - - -棉酚GAG公司治理文化公司治理文化TGA GAAT-3 ;5 - - - - - -GTG CAG gg GTT TAA TGT CAA CT-3 );引发(5 - - - - - -TTT TGC CAA GGA GTG CTA AAGA-3 ;5 - - - - - -AAC有条件现金援助CTG CAC CCA GTT TTC-3 );il - 1β(5 - - - - - -ATG ATG GCT答TAC AGT GGC AA-3 ;5 - - - - - -GTC GGA手枪CTG GA-3 TCG标签 );和ICAM-1 (5 - - - - - -TTG GGC ATA GAG ACC 20 TT-3 ;5 - - - - - -GCA猫TGC柠檬酸GTT猫ACA CC-3 )。实时PCR进行使用SYBR绿色PCR反应混合液(Transgen,北京)和7500实时PCR系统(美国纽约热费希尔科学)根据制造商的协议。

2.12。免疫荧光法测定体外

细胞和4%多聚甲醛固定15分钟,洗和PBS三次,每次10分钟。与0.5% triton x - 100细胞permeabilized与PBS 10分钟,洗了三次,每次10分钟。4毫克/毫升的细胞对兔单克隆抗体针对NF -κ在4°C B p65过夜。与PBS反复洗涤后,这些细胞被探测1毫克/毫升Rho-conjugated山羊anti-rabbit IgG抗体1 h和5毫克/毫升4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 10分钟。标签部分被认为与荧光显微镜(蔡司)。

2.13。动物麻醉和安乐死

所有的动物都保持在特定的无菌条件下,依照实验动物保健委员会南京中医药大学;所有的动物被给予人道关怀根据美国国立卫生研究院的指导方针。在体内实验中,大鼠与异氟烷麻醉手术过程中,体温一直使用一个暖和的毯子里。老鼠被吸入异氟烷和二次安乐死颈椎脱位根据美国兽医协会指南安乐死。

2.14。统计分析

所有数据都表示为百分数与标准差和手段( )。使用学生的进行了统计分析和策划 - - - - - -测试和单向方差分析GraphPad棱镜5为Windows。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。RSTF显著改善咽炎的症状

咽炎患者咽腔的主要特点是干燥,异物感,瘙痒感觉,刺激性咳嗽,疼痛的感觉和肿胀的喉咙19]。中医通常取决于“Shengjin Runzao Huatan“咽炎患者缓解症状。在我们的实验中,口干的大鼠模型建立了评价的影响“Shengjin Runzao Huatan”RSTF。结果表明,RSTF增加唾液分泌在老鼠的浓度7.5克/公斤,15克/公斤,及其推广略低于积极药物阿托品(图1(一))。这表明RSTF能有效缓解咽炎患者口腔干燥症状。它能有效清除痰的症状,从而提高异物感,瘙痒的感觉,和刺激性咳嗽吗?小鼠酚红排泄实验被用来确定RSTF的化痰作用。痰液中的唾液酸可以增加痰液的粘度,和RSTF可以进一步的化痰的效果评估通过检测大鼠气管分泌物中的唾液酸含量。酚红排泄结果表明RSTF可以极大地刺激唾液的分泌在老鼠的浓度11.25克/公斤和22.5克/公斤(图1 (b))。唾液酸分泌的结果表明,积极的药物盐酸ambroxol可以显著降低唾液酸的含量在气管和痰液粘度。RSTF低剂量(3.75克/公斤)没有效果;当它达到15克/公斤,唾液酸在大鼠气管的内容与空白组相比显著降低(图1 (c)),这表明RSTF减少痰的粘度有一定的影响。

咽炎患者还伴有咽喉灼痛;因此,我们调查了RSTF通过热板法镇痛的影响。RSTF和阿司匹林没有明显提高小鼠的痛阈,15分钟后与对照组相比。30分钟后的痛阈剂量的政府22.5克/公斤是明显高于对照组;其镇痛效果与阿司匹林。RSTF 11.25克/公斤直到45分钟后才产生镇痛效果管理,和高剂量的影响RSTF (22.5 g / kg)减少,但阿司匹林仍保持显著的镇痛效应。只有高剂量RSTF仍然有明显的镇痛效果持续到60分钟邮政管理局(数字1 (d)- - - - - -1 (h))。咽炎伴有喉咙发炎和肿胀;因此,两个模型被用来确定RSTF的抗炎、消肿作用。大鼠棉球肉芽肿模型植入,肉芽肿的重量在治疗组RSTF浓度的7.5克/公斤15克/公斤低于模型组,和醋酸地塞米松(DXM)的抗炎效果最显著(图1(我))。RSTF也对agar-induced增殖有显著的抑制作用在大鼠炎性肉芽肿,和效果与DXM(图1 (j))。上述结果表明,RSTF可以显著缓解咽炎患者的症状,这是相当重要的改善病人的生活质量和精神状态。

3.2。RSTF活性化合物筛选

在治疗咽炎临床RSTF是有效的。实验结果还表明,RSTF能有效缓解咽炎的症状,但药理机制是什么?中医的治疗机制很难澄清在分子生物学水平在很长一段时间,因为复杂的化学成分。仍然没有有效的策略来识别草药的活性化合物和遗留方法检测成分以极低的浓度。

合成化合物的草在RSTF获得TCMSP [20.]。有174、238、110、444、68、176年和158年复合信息,分别从嗯,算法,AMK、CR、物理化学加工,操作系统,和在RSTF EHH。ADME模型和文献确认被用来屏幕RSTF的活性化合物。我们测试了ADME性质这些成分包括drug-likeness (DL),口服生物利用度(OB) Caco-2渗透率(Caco-2)和药物半衰期(HL)基于发表的发现21]。推荐的筛选标准如下: , , ,和 (22]。最后,七十潜在的化合物,包括六个复制组件,通过ADME筛选(图2(一个))。此外,在收集到的化合物从TCMSP ~ 50.9%(696/1368)的分子口服生物利用率,但只有27.3%(374/1368)有长半衰期。有趣的是,超过70.2%的化合物(960/1368)很容易被Caco-2细胞层和吸收约45.2%(618/1368)有药物如(图特征2 (b))。共有70个活性化合物通过ADME筛查:14嗯,9为算法,对AMK 5, 10对CR, 14对物理化学加工,EHH 15为操作系统,和15(补充表S1)。

3.3。Compound-Target网络建设和分析

中药配方对其有效性通过作用于多个目标和病理过程在正常情况下。我们使用了一个系统性的方法来预测的潜在目标收集RSTF的活性成分。我们使用一个系统的目标预测方法来预测RSTF基于其活性成分的潜在目标。共有355个潜在的目标是预测70年候选化合物:嗯,73 57算法,对AMK 14, 48 CR, 35物理化学加工,71操作系统,和57 EHH;其中,84年的目标仍然是后删除重复的。详细的目标信息提出了补充表S2。

通过作用于多个目标,中医公式展示多才多艺的生物和药理作用。研究中药化合物之间复杂的交互和系统级别的目标可以帮助我们理解中医的影响机制。我们建造了一个compound-target网络基于候选人RSTF化合物及其潜在目标明确它们之间的复杂的相互作用。共有118个节点和573年compound-target交互提出了网络(图2 (c)和补充表S3)。虽然目标在每一草的数量是不同的,他们在六种(表大幅重叠1)。分析还表明,槲皮素、山柰酚hederagenin, beta-sitosterol,毛地黄黄酮,和柚苷配基是存在于多种草药,这可能协同对病人有益的影响(表1)。大多数这些成分有抗炎、抗菌作用。此外,beta-sitosterol和柚苷配基是已知能止咳的效果。槲皮素和毛地黄黄酮的主要成分是嗯,算法,和EHH,即。草本植物,在中国被广泛用于治疗咽炎。山柰酚从嗯、算法和EHH具有抗炎、抗菌和抗氧化的作用。ClueGO, Cytoscape插件集基因本体论(去)条款以及KEGG / BioCarta通路,可以创建一个功能性组织/通路术语网络,是下一个用于进一步研究的潜在途径参与候选目标RSTF [23]。ClueGO富集分析表明,候选人的目标RSTF主要可以分配给相关的几种和NF -κB-related信号通路(数字2 (d)和2 (e))。它通常是知道NF -κB信号通路密切相关炎症、免疫、细菌感染,和氧化反应24- - - - - -27]。

3.4。收集Pharyngitis-Related目标基因本体和初步分析

疾病的相应目标确定其治疗诊所;因此,我们收集pharyngitis-related目标两个主要来源:差异表达基因(度)获得公开的微阵列数据和疾病相关的数据库。如图3(一个)和图S1,三个地理微阵列数据(GEO34205、GEO17732 GEO20262)选择和2000个差异基因微阵列进行了分析。其中,1542年、1548年和1643年有效的基因选择。共有43个共同从三个地理库筛选差异基因微阵列(图3 (b)),而其他130目标是获得三个数据库:药物基因组学基础知识(网页)28),在线孟德尔遗传在人(人类®)(29日),和疾病基因搜索引擎与证据的句子(DigSee) [30.]。从地理库总基因微阵列数据,另一个三个数据库和173 pharyngitis-related目标筛选(图3 (c)补充表S4)。

我们使用了QuickGO数据库基于大卫[31日,32]执行基因本体论(去)分析假定pharyngitis-related目标合成生物过程(BP)的结果,细胞组件(CC)和分子功能(MF)条款33]。总共334个基点,33 CCs和57 MFs丰富的这个数据集,其中256个基点,25 CCs, 39 MFs值< 0.05。十大非常丰富在BP, CC和MF类别如图3 (d)。同一类别的术语是下令值设置了截止到0.05,顶部是更重要的。在图的底部3 (d),基因的比例。如图3 (d),22.70%的目标相关的免疫反应,而19.02%的炎症反应,揭示了英国石油公司相关分析。其余条款包括细菌、防御反应积极的调节基因表达,对脂多糖的回应。CC分析表明,最确定的蛋白质分布在细胞外区域,等离子体膜,血液微粒,或膜筏,和曼氏金融分析显示,70.55%的是结合蛋白所确定的目标,而其余条款是细胞因子活性,蛋白质homodimerization活动,等等。

3.5。候选人RSTF咽炎治疗目标的识别

越来越多来自网络生物学的证据表明,基因和蛋白质不独立工作,而是工作在多个层面通过互联网络和通路分子。因此,我们利用蛋白质作为节点建立网络澄清机制下RSTF在咽炎的疗效。蛋白质相互作用(PPI)网络建立了反映生物分子的性质。假定的目标PPI网络RSTF(2116个节点和46543个边缘)首先由系统药理学平台,和pharyngitis-related PPI网络的目标是构建(4486个节点和116886年边缘;补充数据S2-3)由多个数据库检索结果。这两个网络被合并获得核心(CPPI)蛋白质间交互作用网络,包括1510个节点和39166个边缘(图S4、表S5)。

咽炎,候选人的目标RSTF筛选利用CPPI的拓扑特征。CPPI网络中一个节点被确认为中心通过过滤值大于网络中所有节点的中值的两倍。通过一个插件Cytoscape (CytoNCA)的主要枢纽网络筛选通过计算每个中心拓扑特性。中位数的值“公元前”、“特区”,“电子商务”,“CC”、“数控”和“漆”369.2803,57岁的0.011916,0.457134,10.08762,和9.062261,分别。因此,355中心 , , , , ,和 设置为主要中心。一个流程图的核心目标筛选提出了数字4(一)-4(c)。详细CPPI和72个候选目标的拓扑特征补充表所示S5。

3.6。通路富集分析候选人RSTF目标

我们执行KEGG通路富集分析的交集CPPI网络和使用先进的气泡图OmicShare工具可视化浓缩的结果(34]。高级气泡图的结果是一个图表显示丰富通路的基因状态通过视觉等指标价值,色彩,图形大小。先进的泡沫图显示在四个维度:丰富内容(通路参与),丰富的基因数量、浓缩比率(浓缩因子),丰富突出。泡沫的原理图很简单;即根据浓缩的重要性从高到低的顺序,最高的前几个途径意义选择(一般15 - 20),和多维显示的基因数量丰富。如图4(d),候选人的目标主要是可以分配给细菌的防御反应,免疫反应,NF -κB途径、药物反应和DNA损伤反应信号通路。其中前两个途径的角色在炎症相关的疾病(如肺炎和败血症)(35,36]。m .肺炎感染的有效管理通常可以实现与大环内酯类、四环素或氟喹诺酮类原料药,增强身体的免疫力(37,38]。咽炎的局部血管充血,淋巴组织的炎症和纤维结缔组织增生,导致免疫反应的反应,最终导致复发难治性咽部炎症。细菌的DNA复制异常也是在慢性咽炎起到至关重要的作用,这也是候选人RSTF的目标。NF -κB是一个核转录因子调节的大量基因表达的关键细胞凋亡的规定,病毒复制,肿瘤发生、炎症,以及各种自身免疫性疾病(39]。

3.7。RSTF具有显著的抗菌活性在体外和体内

所表示的系统药理学预测,大量的候选目标的RSTF相关细菌的过程,咽炎是密切相关的。确认RSTF的抗菌效果,我们观察到RSTF抗菌活性的体内和体外。管试验表明,RSTF具有良好抗菌活性对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌不过epidermidis葡萄球菌、乙型链球菌。抑菌麦克风从0.122 g / mL到0.366克/毫升(表2)。板方法的结果表明,RSTF有很强的抗菌活性对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、假单胞菌不过epidermidis葡萄球菌、乙型链球菌。抑菌圈的直径范围从13.5毫米到15毫米(表3)。

为了进一步证实RSTF体内的抗菌效果,我们观察到的保护作用RSTF对小鼠感染金黄色葡萄球菌和β链球菌。低(4.88克/公斤),中期(9.75克/公斤),高(19.5 g / kg)剂量干预RSTF对小鼠感染金黄色葡萄球菌可以显著延长小鼠的生存时间,与模型组相比有显著性差异。的高收入和中等剂量干预RSTF可以显著降低小鼠的死亡率,增加保护率与对照组相比(图5(一个))。小鼠乙型链球菌感染干预高收入和中等剂量RSTF组可以显著延长小鼠的生存与对照组相比。它还可以减少动物的死亡和改善保护率(图5 (b))。上述结果表明,RSTF具有良好的体外和体内抗菌作用,表明RSTF可以直接杀死细菌治疗咽炎。

3.8。RSTF在免疫调节的影响

从上面的结果,很明显,RSTF具有良好的体外和体内抗菌效果。结合浓缩的结果分析,我们发现,许多的目标RSTF和咽炎的交集与免疫调节有关。因此,可以RSTF增强人体的免疫系统产生抗菌和咽炎及其并发症?我们进行了一项碳间隙测试检测的影响RSTF先天免疫的小鼠和监控T和B淋巴细胞的增殖和转换,以及溶血素的形成来验证RSTF适应性免疫的小鼠的影响。碳间隙测试的结果表明,RSTF治疗后小鼠巨噬细胞吞噬指数显著高于对照组,表明RSTF可以增强小鼠巨噬细胞的吞噬作用(图6(一))。淋巴细胞的增殖的一个重要指标,以反映身体的免疫功能(40]。脾脏是一个重要的免疫器官在体内,富含T和B淋巴细胞和少量的巨噬细胞(41]。在脾脏淋巴细胞很容易分离,淋巴细胞体内的重要来源。有非特异性促分裂原T淋巴细胞表面的受体,如植物凝集素(PHA)和伴刀豆球蛋白(ConA) [42,43]。被有丝分裂原刺激后在体外或体内,它们可以转化为淋巴细胞的细胞。T细胞可以测量响应函数根据细胞转化的程度(44]。小鼠脾脏淋巴细胞治疗RSTF体外的增殖率显著提高剂量依赖性的方式(图6 (b))。与RSTF直接治疗小鼠脾淋巴细胞在体外可显著增强脾脏淋巴细胞诱导的转换ConA剂量依赖性的方式(图6 (c))。如图6 (d)治疗后48小时,与ConA RSTF表示浓度(0,8μg / mL, 16岁μg / ml, 32μg / mL,或64年μg / mL),淋巴细胞显著增加的大小,形状不规则,核的大小增加,骨质疏松症和原子核是增加。明显的核仁,核每个细胞的比例下降;核的同时,一些显示和细胞质分裂阶段空间变得更广泛,和小泡沫和pseudopodoids出现后方的细胞质(图6 (d))。小鼠的半数溶血值RSTF管理显著增加后与对照组相比,有显著差异。它表明RSTF可以显著增强小鼠溶血素抗体的形成,增强特异性免疫(图的影响6 (e))。在数据6 (f)和6 (g),它体现RSTF显著抑制白细胞游走在老鼠糖类纤维素胶囊3 h。RSTF发挥最好的抑制作用的浓度7.5克/公斤。但抑制作用消失在7.5 h。这个结果证明了RSTF在白细胞迁移的抑制作用发生早期炎症。

3.9。监管RSTF对NF -的影响κB信号通路

从RSTF活性成分的途径分析,可以看出RSTF主要作用于NF -κB信号通路。coanalysis后compound-target网络和disease-target网络,NF - RSTF的监管效果κB信号通路仍然走在前列。大量的研究表明,NF -κ与炎症和免疫[B是密不可分的39,45,46]。NF -κB是一个核转录因子,可以快速瞬变引起病毒性和细菌性感染、坏死细胞产品、DNA损伤、氧化应激、促炎细胞因子(47- - - - - -49]。如果激活NF -κB信号通路不能及时得到解决,它将会导致一系列的炎症性疾病,如风湿性关节炎、脓毒性休克和癌症(50- - - - - -52]。以前的研究已经表明RSTF可以增强人体的特异性免疫和非特异性免疫。RSTF能增强免疫系统通过调节NF -κB信号通路,从而抑制炎症的发展吗?因此,正常鼻咽上皮细胞NP69被用来检测RSTF NF -的影响κB信号通路。发现RSTF可以显著抑制NF -的激活κB和显示剂量依赖性的方式(数字7(一)和7 (b))。它还可以抑制NF -κB p65核易位TNF -α诱导NP69(图7 (c))。

许多分子参与免疫反应和炎症反应的早期阶段受NF -κB,包括TNF -α,il - 1β、il - 6、引发和ICAM153,54]。蛋白质所诱导的NF -κB可以反过来激活NF -κB,它创建了一个恶性循环,扩展了最初的炎症反应。结果表明,il - 1的水平βil - 6,引发,ICAM1信使rna被TNF -刺激后增加α(20 ng / mL) NP69(数字7 (d)- - - - - -7 (g))。但RSTF可以显著降低il - 1的mRNA的表达βil - 6,引发,ICAM1在剂量依赖性的方式(数字7 (d)- - - - - -7 (g))。

4所示。讨论

RSTF通常用于咽炎在诊所由7个中国草药。临床治疗结果表明,RSTF具有良好的治疗效果几乎没有副作用。我们的体内结果进一步验证了对于缓解咽炎的症状,治疗效果明显的退热剂,镇痛,抗炎,Shengjin Runzao Huatan效果。然而,并没有相关的机理研究RSTF直到现在。中药配方含有各种复杂的成分,可能会产生添加剂对个人目标的影响。每个目标同时也可以产生协同效应;所有这些共同构成其药理机制。这些特性还很难探索中药的机理。在这里,我们使用网络药理学和系统生物学技术来预测咽炎RSTF的发病机制。随后,预测的结果被进一步的实验验证。

在本文中,我们分析可能的作用机理的中医配方通过系统、科学的跨学科的分析方法,通过进一步的实验验证其可能的分子机制,而不是主观地选择一个机制。首先,我们进行了筛选,活性化合物RSTF基于药代动力学参数和预测这些活性成分的目标。为了系统地分析RSTF的药效物质组件之间的交互和潜在的目标,我们构造compound-target网络基于选定的候选人组件及其相应的潜在目标。然后,我们筛选了pharyngitis-related疾病由多个目标疾病的目标网站和三个基因芯片数据,进一步建立disease-target网络。compound-target网络和disease-target网络被用来执行蛋白质-蛋白质之间的关系,和相应的蛋白质相互作用网络(质子泵抑制剂)构造获得交叉目标。基于浓缩分析相关的目标,发现RSTF可能发挥作用在治疗咽炎的参与调节免疫系统,抑制炎症的发展,和直接杀死细菌。使用计算机预测和体内/体外分析机制的探索中药配方,我们可能会发现在中医药研究方面有个突破。

5。结论

实验结果表明,RSTF具有很强的体内和体外抗菌作用。此外,RSTF也有监管对免疫系统的影响,表现在其能力促进脾淋巴细胞的增殖和转换,以及加强小鼠巨噬细胞吞噬作用的影响和抑制白细胞游走在大鼠糖纤维素胶囊。细胞实验的结果表明,RSTF可以抑制NF -κB激活TNF -介导的α并抑制其进入细胞核。il - 1的mRNA表达βil - 6,引发,ICAM1受NF -κB是被RSTF剂量依赖性的方式。总之,与分析结果一致,RSTF可以直接antimicrobically调节先天免疫和抑制炎症的发展通过NF-KB信号通路,从而达到缓解咽炎症状的影响。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突的研究。

作者的贡献

侑士丁、Suyun Yu和鸿魏贡献同样这项工作。

确认

这个项目是部分支持由中国国家自然科学基金(81573859,81573859,81573859,81673795)。

补充材料

补充1。补充图1:pharyngitis-related目标通过预先存在的微阵列数据的识别。2000个差异基因的三个地理库微阵列数据(GEO34205、GEO17732 GEO20262)进行了分析,并对咽炎高度相关。1542年、1548年和1643年从三个地理库选择有效的基因微阵列数据。火山的情节显示(红色)的差异表达基因,而淡蓝色小点是基因没有表达明显不同。补充图2:PPI网络的RSTF被公认为目标。2116个节点和46543年边缘被确定。补充图3:PPI网络CKD-related目标。4486个节点和116886年边缘被确定。补充图4:核心(CPPI)蛋白质相互作用网络。CPPI网络由1510个节点和39166个边缘。

补充2。补充表1。ADME参数RSTF的活性化合物。

补充3。补充表2。RSTF预测目标的信息。

补充4。补充表3。Compound-target交互信息。

补充5。补充表4。信息已知的pharyngitis-related目标。

补充6。补充表5。PPI数据的交互网络。补充材料和方法。(1)数据准备和筛选活性化合物。合成化合物的草在RSTF获得TCMSP (http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)。数据库包括化学品、目标和药物靶网络和相关drug-target-disease网络,以及天然化合物的药代动力学属性包括口服生物利用度,drug-likeness,肠道上皮通透性,血脑屏障和溶解度。通过设置选择活性化合物 , , ,和 作为阈值。(2)预测RSTF的药物靶点。药物靶点的预测表现如前所述。在硅片的预测模型中,海搜索工具(搜索,http://sea.bkslab.org/4.0),针(搜索工具进行交互的化学物质,http://stitch.embl.de/)组合预测的目标概要文件活跃草药化合物。(3)目标与咽炎的集合。Pharyngitis-related目标是获得两个主要来源:差异表达基因(度)从公开的微阵列数据和疾病相关数据库。确定之间的主要度正常,pharyngitis-related标本,微阵列数据GEO34205 GEO17732, GEO20262获得基因表达的综合数据库(地理,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),每个芯片和2000个差异基因进行了分析。(4)CPPI网络建设。假定的RSTF-related目标网络和pharyngitis-related目标网络构造基于他们的交互数据。PPI数据从现有6个进口PPI数据库,包括生物通用存储库交互数据集(BioGRID),生物分子相互作用网络数据库(绑定),分子间相互作用的数据库(薄荷),人类蛋白质参考数据库(HPRD)和数据库交互的蛋白质(下降),BisoGenet搜索的Cytoscape插件。这两个被合并获得核心PPI网络(CPPI)蛋白质间交互作用网络采用Cytoscape软件(版本3.2.1)。(5)浓缩和路径分析。RSTF-related目标的基因本体论(去)分析是基于ClueGO这是一个插件的可视化nonredundant生物方面对大型基因集群功能分组网络。ClueGO网络是由使用kappa统计,反映条件之间的关系的基础上,相关的基因之间的相似性。术语的意义和组自动计算。和浓缩和通路分析基于大卫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)被用来执行基因本体论(去)或KEGG通路富集分析假定pharyngitis-related CPPI网络的目标和十字路口。

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