研究肿瘤坏死因子-308多态性协会与2型糖尿病肾病

抽象

2型糖尿病（T2DM）是公知的包括已经被认为是糖尿病并发症相关的炎性成分。糖尿病肾病（DN）是显著的并发症之一，因为它构成了终末期肾脏疾病的最常见的原因。肿瘤坏死因子α（TNF-αα）被称为其与一些病理过程，如免疫调节，增殖，炎症和细胞凋亡相关联的多官能的促炎细胞因子。目的是探索之间的关联TNF-α启动 -1031T/C单核苷酸多态性（SNP）和血清TNF-α除了电平2型糖尿病患者中肾病。该研究包括38名T2DM受试者无肾病（DM组），40名受试者DN，和20所控制。TNF-α的鉴定α启动子基因多态性 -1031T/C通过PCR-RFLP完成，基因分型直接测序证实。血清TNF-αα水平通过ELISA评估。相关性用Pearson相关分析检验。Logistic回归被用来检测最独立的因素DN的发展。TNF-α的血清水平αDM组比对照更高显著（ ）;此外，DN组比对照和DM相当高的无肾病（ ）。此外，有TNF-α的血清水平之间存在显著正相关α与FBG（空腹血糖），肌酐，总胆固醇，LDL-C，糖化血红蛋白，和微量白蛋白/肌酸酐比率（ACR）的DN组中（ ，<0.001，<0.001，<0.001，0.027，和0.043，分别地）。突变纯合CC和杂合子基因型TC在DN均高于DM和控制。C等位基因被更代表了DN比DM和对照（ ）而T等位基因是在控制较DM和DN患者高。TNF-α的水平α在科目谁比DN中野TT基因型突变CC较高（ ）。以及DN和DM之间由2.25倍（CI：1.1-4.59）：C等位基因5.4倍（1.75-16.68 CI）是为DN和对照之间DN比T等位基因风险更大。结论。TNF-α的血清水平α均符合突变CC基因型个体高 -1031T/CTNF-αα基因和C等位基因可能与2型糖尿病患者中肾病的风险增加有关。

1.简介

2型糖尿病是最普遍的代谢性疾病之一。在2型糖尿病患者血糖持续是微血管和大血管并发症，包括糖尿病肾病的重要原因，这可能在疾病的后期发展[1]。DN被认为是糖尿病最常见的慢性微血管并发症，严重影响了生活的质量的患者。炎症和细胞肥大导致DN的进展。DN的发生与各种因素，包括氧化应激，高血糖，血流动力学变化，和炎性过程[2]。DN被称为非免疫疾病;然而，证据表明在除了肾白细胞粘附分子的过量产生的增加，巨噬细胞浸润[1]。

细胞因子是免疫系统显著介质，并且由于不恰当的平衡可能主要是调节疾病倾向性的响应。TNF-αα是相互关联的，以全身性炎症的细胞信号转导蛋白;此外，它是在急性期反应的细胞因子纠结的成员[3]。TNF-αα主要产生由单核细胞/巨噬细胞，即使固有的肾细胞也能合成这种细胞因子。TNF-αα操作由特定的细胞表面受体的协助。TNF-α的结合α与其受体导致的多种生长因子，转录因子，细胞因子，受体，炎性过程的介质，和急性期蛋白的表达;此外，它可介导凋亡和坏死。因此，TNF-α加速炎症介质的释放和合成，并可能参与DN [进度4，五]。

TNF-α的轨迹αgene is located within the Class III region of the human major histocompatibility complex (MHC) on chromosome 6 (6p21.31) traversing about 3 kb containing 4 exons. Control of TNF-α生产发生在转录和转录后水平二者，与5中的调节序列所述基因调控转录的速率的结束[6]。

许多个SNPs在人类的启动子区被确认TNF-α基因，不得不引起监管场所内的结构变化可能扰乱TNF-α的功能和调节的能力α生产。所述MHC区域内部的基因的位置已经增强的可能性，即该位点的SNP内可能有助于许多疾病，如T2DM和DN [发展7]。

位于5多态性TNF-α的监管区域α基因的位置 -1031T/C已经用不同的炎性和自身免疫疾病有关[8，9]。因此，本研究是探索之间的关联尝试的 -1031T/CTNF-α的SNPα和敏感性发展肾病患者2型糖尿病。

2.方法

2.1。主题

目前这个病例对照研究涉及98个科目谁出席内科门诊部和住院部，Menoufia大学医院，埃及，2016年9月和2018年十二月他们被分成3组：第一组：20个显然健康对照;组II（DM）：38 T2DM无肾病，它们的白蛋白/肌酸酐比 ;和组III（DN）：40 T2DM肾病，其 。

排除标准为患者进行研究前低血糖昏迷或酮症酸中毒，在过去3个月，尿路感染或其他肾脏疾病，高血压，充血性心脏衰竭，发烧，炎症性疾病，如哮喘和类风湿关节炎，怀孕，感染，自身免疫史，肿瘤或其他内分泌疾病。这项研究是经研究伦理委员会，并从所有参与者（用阿拉伯文写的），获得书面知情同意书。

2.2。方法

对于所有科目，下面分别进行：询问病史，临床检查和人体测量的评估。

2.2.1。生化调查

空腹血液样品在无菌操作下保护排出并收集到平原和EDTA真空采血管。糖化血红蛋白，400 μ对EDTA全血升贮存在4-8℃，并且估计在1周内收集的通过离子交换树脂色谱法，使用市售的试剂盒进行。

上EDTA另一个血液样品在-80℃下以等分试样储存直至进一步DNA提取。分离血清用于生化研究，例如空腹血糖（FBG），血液尿素氮（BUN），肌酸酐和脂质分布，其中均使用Beckman Coulter公司（金680）使用由Beckman，USA提供的试剂盒化学自动分析仪，while low-density lipoprotein (LDL-C) was calculated by Friedewald’s and Fredrickson’s formula. An aliquot of serum was kept at −20°C till further use for estimation of the TNF-α通过ELISA水平。Another venous sample was taken after 2 hours of eating to measure the 2 h postprandial (2 h pp) glucose level. Urine samples were collected to estimate microalbumin and creatinine in urine, and then, ACR was calculated.

2.2.2。DNA提取和基因分型

基因组DNA使用市售的DNA提取试剂盒（赛默飞世尔科技，USA）从全血提取。DNA储存于-20℃直到进一步的分析。基因型的 -1031T/CTNF-α的多态性α基因，聚合酶链式反应 - 限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）已完成。

这些引物用于：转发5 -TATGTGATGGACTCACCAGGT-3和反向5 -CCTCTACATGGCCCTGTCTT-3 。总反应体积为25 μ升，其中包括5 μl (100 ng) of genomic DNA, 4.5 μ升的无核酸酶水，1.5 μ升正向和反向引物，和12.5 μ升DreamTaq PCR主混合物（赛默飞世尔科技，美国）。Amplification was done using a Prime Thermal Cycler (Bibby Scientific Ltd., UK) with the following protocol: initial incubation at 95°C for 5 min, followed by 35 cycles of denaturation at 95°C for 30 s, annealing at 54°C for 30 sec, and extension at 72°C for 45 sec, followed by a final incubation at 72°C lasting 5 min. Amplicons with 264 bp in length were digested byBPIIfast digest restriction enzyme (Thermo Fisher Scientific, USA) incubated at 37°C for 15 min as a reaction mixture of 10 μ升的PCR产物，即2- μ升酶缓冲液中，1 μl of the enzyme (BpiI) (1 U), and 7 μ升无核酸酶的水。将消化产物通过2.5％琼脂糖凝胶电泳分离，并通过溴化乙锭染色鉴定。染色片段UV下显现（图1）;the fragments of 251 and 13 bp revealed homozygosity for the T allele and 180, 71, and 13 bp fragments indicated homozygosity for the C allele. Furthermore, genotyping results from the RFLP analysis were confirmed by direct DNA sequencing of the PCR products from each genotype in few samples, which were carried out on ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer using a kit supplied by Applied Biosystems, USA.

2.2.3。统计分析

数据的收集，汇总，并通过SPSS软件包版本20.0进行分析。对于人口统计数据和研究团体之间的生物化学研究的比较，使用以下物质：卡方检验，方差分析，然后事后Tukey检验，秩和检验测试，然后事后邓恩的测试，学生 -测试和Mann-Whitney检验。进行受试者工作特征曲线（ROC曲线），以获得TNF-α的最佳截止α。被用于相关的斯皮尔曼系数。对于基因型分布，卡方检验和蒙特卡洛测试中使用。胜算比（OR）和置信区间（CI）通过逻辑回归分析来计算。显着性水平设定在0.05以下。

3.结果

三组的人口统计数据示于表1。身体质量指数（BMI）为显着更高（ ）在DM和DN患者比对照。糖尿病病程较长的DN比DM。FBG, 2 h pp, and HbA1c were significantly higher ( ）在与对照组相比，即HbA1c也较高在DN比DM（两组患者 ）（表1）。总胆固醇，甘油三酯（TG），和LDL-C水平显著升高（ ）在DN患者比DM，而高密度脂蛋白（HDL-C）水平是显著降低（ ）在DN相比，DM。血清肌酐和尿素氮水平显著升高（ ）在DN相比，无论DM和控制。至于血清TNF-αα水平，患者组比对照更高显著;此外，DN较DM显著较高（ ）。ROC曲线（图2）透露，TNF-α的最佳临界水平αwas 155 ng/l, where sensitivity was 90.62%, specificity was 94.12%, positive predictive value was 93.5%, negative predictive value was 91.4%, and diagnostic accuracy was 92.42%. The TNF-α水平显示出与FBG，肌酸酐，糖化血红蛋白，总胆固醇，LDL-C，和ACR的DN组中（表一显著正相关2）。

TNF-α的基因型和等位基因频率α基因启动子 -1031T/C（表3）被发现遵循Hardy-Weinberg平衡。野生纯合子TT基因型提出更比DM和DN患者控制，而杂TC和突变纯合基因型CC在DN比DM高。同时，CC基因型是控制缺席，但这种差异并没有达到统计学意义。C等位基因在DN比DM和对照组（ ）而T等位基因比在DM和DN患者更代表了对照。研究结果还表明，TNF-α在DM水平显著升高（ ）在TC和CC基因型比TT基因型。此外，TNF-αDN中水平显著高于CC基因型比TC和TT基因型（ 和<0.001）。此外，TC的基因型比TT基因型显著较高（ ）。此外，这两个DM和DN中C等位基因组显著高于所述TNFα水平比T等位基因组（ ）。

在基因型水平DN风险的评估显示在表4。TC型表现为肾病显著风险大于TT的3.76倍（CI：1.03-13.69）。与此同时，C等位基因通过比DN和对照之间T等位基因风险更大5.4倍（CI：1.75-16.68）通过，DN和DM之间2.25倍（CI：1.1-4.59），以及之间的患者组和通过对照3.76倍（CI：1.27-11.18）。此外，多因素Logistic回归对DN的危险因素（表五）透露，每个C等位基因，糖尿病的持续时间，和BUN的血液水平，肌酸酐，甘油三酯，总胆固醇，LDL-C，HDL-C，糖化血红蛋白，血清TNF-α携带DN的风险;然而，没有独立的危险因素，因为这种疾病是多因素的。

4。讨论

糖尿病是在埃及迅速上升的健康问题，其中2型糖尿病的患病率翻了两番，先前的二十年将达到约15.6％的成年人20-79年[10]。糖尿病肾病是糖尿病最常见的并发症之一，影响高达T2DM患者20-40％，并可能导致终末期肾脏病，从而影响到这些问题的发病率和死亡率[11]。炎症具有高水平的炎性细胞因子如IL-1，IL-6，TNF-α和α2型糖尿病是一个显著特点。这些言论表明，TNF-α可以参与T2DM和DN的致病性。该TNF-α水平存在个体差异;此外，它是由基因决定[12]。

两组患者的BMI是显著高于对照组没有DM和DN之间显著差异。这些结果同意Doghish等。[13]谁报道，BMI没有DM和DN患者之间是不同的。同时，Gupta等人。[1]报道，有患者组之间在BMI没有观察到差异显著与对照相比。

马里奇，Bilkan [14]指出，肥胖和糖尿病有着共同发起，其触发细胞内信号发起的生产生长因子和细胞因子，从而导致肾脏疾病的事件。

结果表明，糖尿病病程较长的DN比DM。此同意福兹等。[15]。同时，Ochodnicky等。[16]和Motawi等。[17]报告说，在DM和DN之间糖尿病病程无显著差异。DN与糖尿病病程之间的关系是由Gallagher和哺乳[解释18]谁报告说长期暴露在高血糖症导致肾脏的结构，可直接或通过血流动力学变化的损害。此外，安德斯等。[19]表示，高血糖症降低钠曝光在致密斑，其抑制管球反馈，扩张输入小动脉，并且诱导肾小球滤过，引发足细胞和气压性创伤导致足细胞和肾损失。

In the present study, FBG, 2 h pp, and HbA1c were significantly higher in patients compared to controls, while there was no significant difference between the DM and DN groups. This agreed with Motawi et al. [17]。同时，Alnaggar等。[20]和Gupta等人。[1] found that FBS and 2 h pp were significantly higher in DN compared with DM. Saulnier-Blache et al. [2]报道，糖化血红蛋白没有DM和DN之间是不同的。高血糖一直被认为是由众多代谢途径的失调与DN相关的肾脏病理的始作俑者。据报道，高血糖症导致增加的氧化应激通过加剧线粒体产生引起DNA损伤有助于凋亡性细胞死亡，其活性氧的[21]。

这项研究已经发现，血脂得到的结果与福兹等人同意。[15]。同时，Alnaggar等。[20]报道，有关于脂质分布DM和DN之间没有主要的区别，血脂异常在糖尿病状况肾小球增加胞外基质的表达和巨噬细胞活化，导致DN。Doghish等。[13]报道，血脂异常已经在2型糖尿病患者早期肾损伤被发现。这是由于它位于内皮细胞，导致了提出的TG和降低的HDL-C脂蛋白脂肪酶的功能受损。

我们的研究结果表明，TNF-α的血清水平α在这两个患者组比对照组显著升高;此外，DN比DM高。该TNF-α电平显示，DN组中的FBG，肌酸酐，总胆固醇，LDL-C，糖化血红蛋白，和ACR一个显著正相关关系。这些结果与那些由纳瓦罗和莫拉 - 费尔南德斯[观察一致4]，陈等人。[3]谁也发现TNF-α升高α在DN患者水平表明在DN升高的炎症环境。此外，报告了2型糖尿病患者有3-4倍的TNF-α循环水平与对照相比，这些水平在糖尿病患者的相对于正常白蛋白尿微量白蛋白尿更升高。集中在上面，结果支持TNF-α的细胞毒性作用α在由高血糖所介导的肾小球损害，这反过来又导致渐进蛋白尿[22]。

此外，Umapathy等。[6]发现，血清TNF-α水平显示出与年龄和尿素和与HDL-C和LDL-C的负相关性的正相关性。然而，Gupta等人。[1]报道，TNF-αα在这两个病人和控制水平没有达到统计学显着性。这可能是因为在他们的研究设计和变化的遗传背景的差异，也可能是由于的T2DM患者环境暴露在这些研究中招收。

该TNF-α通过单核细胞和 - 主要产生巨噬细胞，起着DN的过程中一个重要的功能。此外，对胰岛素抵抗和胰岛素分泌的影响。此外，TNF-α一直细胞毒性上皮，肾小球和肾小球细胞，可能导致直接的肾损伤。此外，有人指出，TNF-α有在介导炎症过程中起关键作用，这是参与肾小球和肾小管间质损害[23]。

在TNF-α单核苷酸多态性α基因在调节TNF-α方面的直接功能的重要性α生产。特别是，有在的调控区域，这些多态性位点关注TNF-α与在其中转录因子结合的基序的DNA基因有关。在 -1031T/C在5多态性TNF基因的调节区已与许多炎症和自身免疫疾病相关。为了澄清在DN发病机制中的肿瘤坏死因子基因多态性的作用，在 -1031T/CSNP在DM研究和DN然后相互关联TNF-α水平。

结果表明，纯合突变体CC基因型的升高水平的血清TNF-ααDN患者比野生TT基因型个体之间;此外，TNF-α血清α电平被发现等位基因相比T等位基因是在两个DM和C的个人DN更高。

古普塔等人进行前期研究。[1]表明，C等位基因TNF-α的α基因启动子 -1031T/C多态性与升高的血浆TNF-α相关联的α水平;然而，这没有统计学显著。他们还发现有T / C和C / C即单核苷酸多态性T2DM患者有3倍提高发展的肾病的风险。这种差异的结果可能是在研究组的种族的变化。

已充分证明，TNF-α的纯合子CC基因型α是在几个炎性疾病的重要标记物是TNF-α的高生产者α和疾病易感性。的C变体刺激除了NF-的核因子的结合κB向TNF-α基因启动子，其可能导致TNF-α的上升α表达[24]。该增加的电平是由于刺激因子如炎症反应，在TNF-α其中两个α及其受体表达并通过相邻小区刺激产生其它细胞因子如IL-8，急性期蛋白，趋化因子和生长因子的。此外，TNF-α有报道通过几种机制参与DN的发展，包括肾小球滤过率下降和肾小球滤过屏障的肾小球的血流量和干扰。增加生产的肿瘤坏死因子α可以刺激氧化应激和对肾小球细胞的直接细胞毒性和凋亡作用[6]。

综上所述，本研究暴露了的C等位基因 -1031T/CTNF-α的SNPα是伴随糖尿病肾病的发展显著风险。此外，TNF-α的循环水平α是与突变基因型的个体更高。本研究的优势是所有患者和对照都是一样的人种。我们的结论 -1031T/CTNF-α的SNPα成为一个DN遗传脆弱的因素，这将归因于预测和DN的早期诊断。然而，不同种族人群之间以及与大样本量进一步研究是必要的，以获得更多的证据。

数据可用性

用来支持这项研究的结果的数据是可用的，请相应的作者。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

参考

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