文摘

众所周知,上皮细胞屏障功能在多个器官和规范先天免疫反应。气道上皮细胞应对IL-17通过改变转录概况和生产抗菌蛋白质和中性粒细胞化学引诱物。尽管IL-17已经证实通过稳定mRNA CXCR2的配体,促进炎症IL-17如何发挥其对其下游影响靶细胞通过表观遗传机制在很大程度上是未知的。使用的主要人类支气管上皮细胞和不灭的上皮细胞系来自人类和老鼠,我们证明了IL-17-induced CXCR2配体生产通过压抑HDAC5特别依赖于组蛋白乙酰化作用。此外,趋化因子引起的生产IL-17是严格依赖于bromodomain和extraterminal域(打赌)家人打赌废除了IL-17A-induced抑制促炎趋化因子生产,表明乙酰化组蛋白识别的一个关键的角色。结合单细胞RNA-seq分析,我们发现我们采用的细胞系代表特定的血统和IL-17反应调节不同的DNA甲基化机制。综上所述,我们的数据强烈支持,IL-17维持上皮CXCR2配体通过表观遗传调控和生产中断组蛋白修饰的治疗潜力的识别以及修改后的组蛋白可以在中性评价肺部疾病。

1。介绍

IL-17细胞因子家族包括6个成员,它是由多种细胞类型(1)和信号通过IL-17受体家族(2]。IL-17RA许多IL-17家庭成员之间共享,而IL-17RC IL-17和IL-17F独特的受体。IL-17和IL-17F已经演示了关键球员在宿主防御和炎性疾病3- - - - - -5]。气道上皮细胞应对IL-17通过产生抗菌蛋白和中性粒细胞化学引诱物,促进消除细胞外病原体等k .肺炎在宿主防御的设置(6)而导致组织损伤和肺病理学在慢性炎症性疾病7]。

趋化因子总科迅速扩大,因为识别CXCL8(引发)和CCL2 (MCP-1)在1980年代末8]。CXCR2主要表达在中性粒细胞炎症和介导中性粒细胞迁移到网站(9]。一些研究,包括我们之前的工作,已经表明,IL-17是生产的关键驱动因素这些CXCR2配体在体外和体内10- - - - - -12]。IL-17能促进趋化因子趋化因子的生产通过信使rna的稳定性和延长半衰期(12- - - - - -15]。然而,这种机制不能解释为何主要细胞来源于慢性炎性疾病患者自发产生CXCR2配体没有任何进一步的体外刺激(16- - - - - -18]。这让我们假设这些位点的染色质状态调制成为既定的活动,这个活动染色质状态会导致增强的趋化因子生产这些患病的设置。事实上,这种宽容的染色质结构的变化在CXCR2配体已经观察到在两个皮肤感染(19)和肺癌(20.]。

确定是否有表观遗传调控在肺上皮IL-17-mediated趋化因子的生产中,我们利用一些独特的抑制剂针对各种表观遗传途径包括DNA甲基化和乙酰化组蛋白识别。我们的研究提供了新的发现表观遗传调节IL-17在肺上皮细胞和信号显示另一种表观遗传途径针对慢性炎症性疾病的治疗和诊断。

2。结果

IL-17的协同效应和TNF -α在IL-17-induced反应是良好的表达2]。单独确定IL-17可以诱导促炎趋化因子生产,我们主要处理正常人类支气管上皮细胞(NHBE)和检查CXCR2配体的感应。数据通过rt - pcr和ELISA都表明,4种不同的捐赠者之间的感应是健壮的和一致的(数据1(一)和1 (b))。因为我们特别感兴趣的表观遗传调控感应,我们开采RNA-seq IL-17-stimulated主NHBE上早些时候公布的数据与关注这些趋化因子和细胞基因参与DNA甲基化和组蛋白修饰。我们发现组蛋白乙酰转移酶(HAT)表情不变的,而组蛋白去乙酰酶抑制剂之一,例如,HDAC5显著下调(图1 (c),图S1),这表明IL-17可以通过组蛋白脱乙酰作用增强这些CXCR2配体。hdac动态调节基因的表达有能力通过移除赖氨酸残基的乙酰基。随后这个过程改变染色质的可访问性,并主要对转录的影响。

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图1
IL-17A诱发炎性趋化因子在主要生产人工气道上皮细胞。(一)NHBE细胞4捐助者(来自核心捐助者)建立了气液界面的文化和处理人类IL-17A重组蛋白100 ng / ml或控制媒介48 h。执行rt - pcr检测趋化因子mRNA水平。(b)上层清液在48小时收集测量CXCL8 ELISA的蛋白质水平。(c)热图的多个CXCR2配体和的表达HDAC5表现在正常HBE细胞培养在气液界面存在与否100 ng / ml IL-17基底媒体48 h。 ; ; ;通过配对 - - - - - -测试,单侧。

人口主要NHBE细胞包含一个异构(如纤毛,分泌和基底)和可能变化的反应。因此,检查IL-17的潜在机制,我们选择一个上皮细胞系来源于正常供者(21]。RNA-seq分析IL-17-treated HBE1细胞表明初级NHBE细胞之间的基因表达谱相似,HBE1细胞系(图2),特别是CXCR2配体诱导包括处于受控,CXCL2,CXCL8。CXCL5在这些细胞表达非常低,我们无法检测其表达PCR(数据未显示)。根据我们的单细胞RNA-seq分析在正常的人类肺单核细胞,这些细胞也有类似的基因表达谱的支气管上皮细胞高度表达SCGB1A1(图3)。相比之下,更多的II型状的人口(以更多SFTPC)似乎CXCL5生产商,而人口似乎生产其它CXCR2配体同样的学位(图3)。创新路径分析(IPA)确定几个顶级规范途径都IL-17信号有关的各种细胞类型包括IL-17A在牛皮癣的作用,在成纤维细胞IL-17A信号,微分调节细胞因子在肠道上皮细胞的生产IL-17A和IL-17F(图S2A),这表明HBE1细胞IL-17响应,可以用来研究信号通路介导IL-17。与相同的数据集和上游监管机构分析从音标的软件设置,几个信号通路与先天免疫(脂多糖,TLR4)和炎症(TNF、IL1A IL17C)(图开通),类似于一个分析支气管上皮细胞进行早期使用体内模型(6),进一步证明了HBE1细胞系可以作为调查工具IL-17在肺上皮细胞的作用。


图2
热图的基因受IL-17A HBE1细胞。细胞从左边两列(在蓝色酒吧)服用100 ng / ml h-IL-17A蛋白质24 h时正确的两列(在绿色栏)接受24小时的控制中。

图3
人类肺scRNA-seq。细胞被分成几个集群。特定细胞类型的分类是推断提供集群范围内的注释的基因和基于表达式的一些著名的某些细胞类型的标记。处于受控,CXCL2,CXCL5,CXCL8,SCGB1A1,SFTPC表达细胞被显示在单独的细胞群。较暗的颜色细胞标记,更高的目标基因的mRNA水平的细胞(浅绿色细胞没有目标基因表达的是一样的)。

组蛋白乙酰化作用通常增加染色质可访问性和基于RNA-seq数据从主NHBE细胞(图1 (c)),我们决定测试组蛋白脱乙酰作用是否会影响IL-17信号由overexpressing HDAC5使用adenoviral转导。HDAC5超表达是成功实现评估PCR(图4(一))和免疫印迹(图4 (b))。更重要的是,CXCR2配体基因表达等处于受控,CXCL2,CXCL8是大大压抑(图4 (c)),这也证实了CXCL8蛋白质水平(图4 (d))。

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图4
诱导炎症趋化因子可以抑制由IL-17A overexpressing HDAC5。镀HBE1细胞每在12-well板0.08 -015万个细胞。当汇合的70 - 80%,细胞转染0.1莫伊人类HDAC5腺病毒和300年不属预定目标的腺病毒μl培养基,分别为一个小时,然后我们说100 ng / ml h-IL-17A蛋白质或700μl两adenovirus-infected控制介质直接对应到每个组。转染后24 h (a)HDAC5,(c)处于受控,CXCL2,CXCL8rt - pcr测定mRNA水平。(d)转染后48 h上层清液收集。通过ELISA CXCL8蛋白质水平。 ; ;通过配对 - - - - - -测试,双尾。(b) HDAC5蛋白质含量与腺病毒转染的细胞24小时被免疫印迹检测(β肌动蛋白作为参考)。这个实验被重复。

染色质重塑是众所周知的主要通过两种机制:组蛋白修饰和DNA甲基化。探索潜在的监管机制IL-17-induced在肺上皮细胞趋化因子生产,我们对待IL-17-stimulated HBE1细胞5-azacytidine (5 az), DNA甲基转移酶抑制剂。然而,抑制DNA甲基转移酶活性没有显著CXCR2配体诱导或减少这些细胞,相比单一IL-17-stimulated HBE1细胞(图5),这表明组蛋白乙酰化作用而不是DNA甲基化是一个主要的监管机构在这些细胞。相反,当这些细胞治疗与小分子抑制剂(CPI)块赌bromodomain绑定,IL-17-induced CXCR2配体产量大幅减少(图6),这表明乙酰化组蛋白的识别的一个重要的角色在这个途径。进一步调查这个表观遗传调控是否特定于人类细胞,我们治疗小鼠肺上皮细胞系,MLE12, IL-17 5 az的存在与否或CPI(图7)。有趣的是,处于进一步提高了感应抑制DNA甲基化,表明这些小鼠细胞或类型II-like细胞(22)可以调节DNA甲基化水平。然而,打赌抑制再次大幅减少了处于表达式,表明选择绑定至关重要的感应IL-17下游趋化因子和本条例在哺乳动物是守恒的。我们还进行了RNA-seq分析IL-17-treated MLE12细胞和证实处于受控作为一个顶尖的诱导基因(图8)和异丙醇的分析还表明浓缩IL-17A和NF -κB信号通路(图S3)。

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图5
在HBE1细胞DNA甲基转移酶抑制。镀HBE1细胞每在12-well板0.08 -015万个细胞。孵化后BronchiaLife™气道上皮中过夜,细胞治疗与控制中,100 ng / ml h-IL-17A蛋白质,1μM 5-azacytidine, 100 ng / ml h-IL-17A + 1μM 5-azacytidine,分别。刺激后6 h,趋化因子生产(a)处于受控,(b)CXCL2,(c)CXCL8由rt - pcr决定。(d) 24小时收集上层清液,CXCL8蛋白质水平是通过ELISA。 ; ; ;通过配对 - - - - - -测试,双尾。这个实验被重复。
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图6
诱导炎症趋化因子依赖于打赌。人类支气管上皮细胞系HBE1镀细胞每在12-well板0.08 -015万个细胞。孵化后BronchiaLife™气道上皮中过夜,细胞治疗与控制中,100 ng / ml h-IL-17A蛋白质,200 nM CPI,和100 ng / ml h-IL-17A + 200海里CPI,分别。刺激,后6 h (a)处于受控,(b)CXCL2,(c)CXCL8rt - pcr测定mRNA水平。(d)刺激后24 h,上层的收集和CXCL8蛋白质含量由ELISA测定。 ; ; ;通过单向方差分析测试。这是代表人物从4实验。
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图7
表观遗传调节IL-17途径在小鼠气道上皮细胞。小鼠肺上皮(MLE12)细胞培养与冲击(氢化可的松、胰岛素、转铁蛋白、雌二醇和硒)中含10%胎牛血清(的边后卫)和抗生素在37°C在含有5%孵化器有限公司2。细胞治疗与控制中,50 ng / ml m-IL-17A蛋白质,1μ50 M 5-azacytidine, 200 nM CPI, ng / ml h-IL-17A + 1μ50米5-azacytidine和ng / ml h-IL-17A + 200海里CPI,分别。6 h qPCR执行处于受控信使rna生产(a) IL-17A / 5-azacytidine和(c) IL-17A / CPI-treated细胞。24小时收集上层清液达到处于蛋白质水平通过ELISA (b) IL-17A / 5-azacytidine和(d) IL-17A / CPI-treated细胞。 ; ; ; ;通过单向方差分析测试。这是代表人物从4实验。

图8
热图的基因受IL-17A 6 h) (50 ng / ml的MLE12细胞。左边两列显示在地图上的两个样品m-IL-17A-treated集团和右两列是对照组的样本。

3所示。讨论

IL-17一直牵连发挥重要作用在许多促炎肺部疾病包括哮喘和囊性纤维化(CF)。在CF患者中,慢性铜绿假单胞菌(PA)感染导致死亡率增加了促进恼怒的CF患者的气道炎症和累积肺损伤(23]。IL-17水平升高在痰CF加重(24),而CD4+Th17细胞被认为是一个关键的IL-17来源CF肺(25]。事实上,pa Th17反应已观察到患者的淋巴结CF (25]。尽管IL-17-mediated炎症是至关重要的细胞外间隙的病原体等k .肺炎和白念珠菌(3]在几个急性感染模型,最近的研究也提出了一个可能的有害作用IL-17下游信号在慢性肺部感染模型通过招募中性粒细胞(26,27]。此外,HCO3-是必不可少的抗菌功能的CF气道(28],HCO3-运输可以调节正常人类支气管上皮细胞,然而,在囊性纤维化跨膜电导调节——(雌性生殖道)相关的时尚29日]。因此,在缺乏CFTR功能检测IL-17可能有助于病理炎症(3],IL-17本身或其下游信号可能代表一种新颖的目标管理在CF肺中性粒细胞炎症。在这项研究中,正常的人类和老鼠细胞系趋化因子生产的用于识别关键的表观遗传机制诱导IL-17,暗示这些途径并不是唯一的CF和这些影响可以适应其他肺部疾病,如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。

表观遗传标记在组蛋白相关转录过程。例如,trimethylated组蛋白H3K4浓缩在启动子(30.),而monomethylated H3K4和乙酰化H3Lys27 (H3K27ac)浓缩在活性增强剂31日,32]。bromodomain和extraterminal域(打赌)家族蛋白质,包括BRD2、BRD3, BRD4, BRDT,包含两个bromodomains,识别并与乙酰化组蛋白乙酰化蛋白质和其他与不同程度的关联。小分子抑制剂打赌模仿乙酰基,插入bromodomain acetyl-lysine-binding口袋,这是独特的打赌家族蛋白。它已经表明,BRD4在IL-1b-induced炎症中起着至关重要的作用在人类呼吸道上皮细胞(33),我们已经证实高水平的表达BRD2、BRD3, BRD4主要HBE细胞以及支气管刷通过临床支气管镜检查34),押注抑制剂理想候选人挡住了既定的积极活跃的组蛋白标记的位点。选择抑制药被证明能减少幼稚T细胞分化成Th17细胞(35),符合生产的数据显示,抑制IL-17 CF肺后分离出的T细胞抑制打赌。我们认为的最佳抑制气道炎症将通过针对IL-17生产和下游趋化因子表达。这可能是非常适用于慢性疾病的基因组景观CXCR2配体在肺上皮细胞改变。事实上,我们发现CXCR2配体生产打赌抑制剂可以抑制上皮细胞。然而,组蛋白修饰的确切机制产生了抑制染色质免疫沉淀反应分析需要进一步定义。

主要HBE细胞异构和很难击倒和超表达实验操作。因此,我们使用了细胞系,HBE1 MLE12。组蛋白乙酰化作用是由组蛋白乙酰转移酶(帽子),HDAC酶。我们不假设监管机制,帽子作为我们RNA-seq数据显示,帽子表达不受IL-17刺激。然而,在HDAC超表达的实验,帽子可以扮演妥协改变HDAC5表达的影响,这可以解释为什么我们观察到一个温和的效果使用腺病毒overexpressing HDAC5(图4)。因此,帽子的表达由RNA-seq将进一步检查。HDAC5磷酸化和亚细胞分布与调节基因表达(36,37),可以通过免疫印迹仔细确定在未来。

在这项研究中,我们观察到主要在人类细胞中DNA甲基化的差异调节(图5)与老鼠的细胞(图7)。特定基因的表达,不同的生物/组织使用不同的表观遗传机制,不同的物种也是如此。我们发现微分表达式Hu-antigen R(虚),编码ELAVL1HBE1和MLE12细胞(图S4)。户珥广泛表达蛋白最近显示调节DNA甲基转移酶的表达转录后的(38]。因此,较低的表达ELAVL1或许可以解释为什么HBE1细胞对DNA甲基转移酶抑制不太敏感,表明一个组织目标的表观遗传调控应考虑未来的药物开发。观察到的差异也可能由于老鼠和人类基因组的序列差异,例如,启动子区域CpG岛附近分布的差异可能导致更抗DNA甲基化的位点。

综上所述,我们的数据支持IL-17增强肺上皮细胞趋化因子生产通过组蛋白修饰和识别和治疗潜在的中断这个途径可以评估IL-17-mediated疾病。

4所示。材料和方法

4.1。主细胞培养和刺激

人类肺实质组织处理分离单核细胞,正如我们先前描述(34]。细胞RNA用于单细胞测序(scRNA-seq)分析。

正常的人类支气管上皮细胞(NHBE细胞)从匹兹堡大学获得组织和细胞核心实验室准备根据前面描述的方法通过匹兹堡大学的IRB [39]。细胞在气液界面文化受到100 ng / ml人类重组IL-17A蛋白质(BioLegend,猫# 570506)或控制媒介48 h。细胞被收割的试剂盒RLT缓冲进一步基因表达的检测。

4.2。细胞系文化和刺激

人类支气管上皮细胞系HBE1细胞(21)在完成一个支气管气道上皮培养介质(BronchiaLife™气道上皮中完整的工具包,生命线,ll - 0023)。细胞被镀0.08 -015万细胞1毫升介质在12-well板。大约80%的融合,细胞治疗控制媒介,100 ng / ml h-IL-17A蛋白质,1μM 5-azacytidine(σ,猫# A2385), 200 nM CPI(开曼群岛,猫# 15479),100 ng / ml h-IL-17A + 1μM 5-azacytidine, 100 ng / ml h-IL-17A + 200海里CPI,分别为6小时或24小时。在6小时时间点,细胞细胞溶解与2-mercaptoethanol RLT缓冲RNA提取和后基因表达;在24小时时间点,上层清液收集ELISA。细胞刺激有或没有24小时100 ng / ml h-IL-17A媒介是mRNA-seq收获。

小鼠肺上皮细胞系MLE12细胞(22)培养了打击(DMEM / F12氢化可的松,胰岛素,转铁蛋白,雌二醇,和硒)中含10%胎牛血清(的边后卫)和抗生素在37°C在含有5%孵化器有限公司2。类似HBE1细胞,MLE12细胞被刺激控制介质,50 ng / ml m-IL-17A蛋白质(BioLegend,猫# 576004),1μ50 M 5-azacytidine, 200 nM CPI, ng / ml h-IL-17A + 1μ50 M 5-azacytidine, ng / ml h-IL-17A + 200海里CPI,分别为6小时或24小时。后6 h刺激,细胞获得进一步RNA提取和mRNA-seq;24小时刺激后,上层清液收集蛋白质测量。

4.3。HDAC5过度

镀HBE1细胞每在12-well板0.08 -015万个细胞。当汇合的70 - 80%,细胞转染人类HDAC5腺病毒(a.b.m 0.1莫伊。、猫# 096660)和不属预定目标的腺病毒(a.b.m。在300年,猫# 000541)μl培养基,分别为一个小时,然后我们说100 ng / ml h-IL-17A蛋白质或700μl两adenovirus-infected控制介质直接对应到每个组。转染24 h后,细胞蛋白质和基因表达测定收获;转染后48 h,得到上层的蛋白质检测。

4.4。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

从细胞中提取RNA样本与RNeasy Miniprep工具包(试剂盒,猫# 74136;Zymo研究猫# R1055),根据制造商的指示。进一步cDNA是以qScript™互补脱氧核糖核酸合成工具(Quantabio猫# 95047 - 100)。

4.5。实时聚合酶链反应

实时PCR进行与Bio-Rad CFX96系统采用TaqMan PCR反应混合液(Bio-Rad,猫# 1725284)和预拌引物/探针集(鼠标:处于受控(Mm04207460_m1)和产生Hprt (Mm03024075_m1);人类:处于受控(Hs00236937_m1) CXCL2 (Hs00601975_m1), CXCL5 (Hs01099660_g1) CXCL8 (Hs00174103_m1) HDAC5 (Hs00608351_m1)和产生HPRT (Hs02800695_m1))从热费希尔科学。

4.6。ELISA

ELISA试剂盒用于检测人类CXCL8 (BioLegend,猫# 431505)和鼠标处于受控(研发系统,猫# DY453)。执行的程序都严格按照制造商的协议。

4.7。西方墨点法

等量的蛋白质(30μg)是由螺栓™4 - 12% Bis-Tris +凝胶(热费希尔,猫# NW04122BOX)然后electrophoretically转移到硝化纤维膜。1小时的膜被封锁了5%的脱脂牛奶Tris-buffered盐水(TBS)渐变20和探测特定主要抗体(HDAC5: Abcam,猫# ab55403;β肌动蛋白:Abcam,猫# ab8226)一夜之间在4°C。洗后的主要抗体TBS渐变20,这些墨迹与适当的辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体在室温下2小时。捕捉到的图像ChemiDoc™议员成像系统(Bio-Rad,猫# 12003154)。

4.8。ScRNA-seq和mRNA-seq

ScRNA-seq库建立了根据“单细胞3试剂盒v2用户指南”(10倍基因组学)。一般,单细胞的人口是条形码,条形码cDNA被反转录每个细胞里的准备。细胞溶菌作用后,然后cDNA图书馆是通过释放编码cDNA放大。分裂后,维修结束,和添加一个基地,双面大小选择用于隔离cDNA约200个基点。进一步适配器结扎,样本指数PCR扩增,和另一个双面大小选择,最后300∼600 bp DNA测序库构建和测序的Illumina公司HiSeq Novogene(名CA)。RNA-seq分析方法论发表之前(40]。所产生的热量地图CLC基因组学工作台(试剂盒Inc .)。

4.9。统计数据

所有的数据分析与棱镜7.0 (GraphPad)。单向方差分析测试中被用于基因表达的比较三组。对于其他配对两组之间的比较,学生的配对 - - - - - -测试执行。

数据可用性

RNA-seq数据用于支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

匹兹堡大学的人类样本收集通过IRB。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

杰和KC设计实验和写论文。JL执行大部分的PCR实验和分析数据。XA和YY进行免疫印迹和构造RNA-seq库。CE和房颤单细胞RNA-seq分析。JKK、科幻和KC撰写并修改了手稿。

确认

这项研究是由美国国立卫生研究院(R01HL137709)和CFF (KOLLS16I0)。

补充材料

补充1。图S1:热图的表达多个HDAC表达在正常HBE细胞培养在气液界面存在与否100 ng / ml IL-17基底媒体48 h。

补充2。图S2:异丙醇分析基因表达在人类支气管上皮细胞(HBE1)培养BronchiaLife™气道上皮中,刺激有或没有100 ng / ml IL-17A 24 h。

补充3。图S3:异丙醇分析基因表达的小鼠肺上皮细胞(MLE12)处理50 ng / ml IL-17A或控制媒介6 h。

补充4。图S4:基线户珥表达水平在人类HBE1和小鼠气道上皮细胞系MLE12细胞。从信使rna序列数据总记录数户珥HBE1和MLE12细胞没有任何刺激。

补充5。图S5:原始免疫印迹膜扫描图片。膜切成两部分。两种不同的蛋白质标记被加载显示大小(梯子左侧标签:ExcelBand™三色Pre-Stained蛋白质梯子,PM5200, SMOBIO;梯标签:右边MagicMark™XP西方蛋白质标准,LC5602表达载体)。样品也上市条件。