文摘

BCG,唯一注册疫苗结核分枝杆菌结核病感染,几十年来一直质疑其保护效果。虽然很多是努力提高BCG抗原性,一些研究致力于理解宿主因素的可变性的角色BCG的保护。使用IL-10KO老鼠和肺结核感染模型,我们已经解决了il - 10在接种卡介苗疫苗功效的作用。数据显示IL-10-deficient树突状细胞(dc)可以促进免疫反应通过upregulation costimulatory表面分子的表达和发挥乐团通过激活CD4的角色+T细胞。IL-10-deficient小鼠更高的干扰素γ,肿瘤坏死因子α卡介苗接种后,il - 6生产,符合更高比例的干扰素γ+CD3+,干扰素γ+CD4+,干扰素γ+CD8+在脾脏T细胞。尤其是总量作为分母IL-10KO这老鼠少炎症后结核病挑战与WT老鼠相比,得到了提升Th1和Tc,以及il - 10的表达下调Treg反应不足。在结论中,我们证明了负Th1 / Tc与il - 10生产反应之间的关系。il - 10缺乏恢复了1型通过直流激活免疫反应,对结核病感染提供更好的保护。因此,我们的研究提供了第一个试验证据,相反BCG的调制,宿主免疫发挥了至关重要的作用对结核病BCG保护效果。

1。介绍

结核分枝杆菌(MTB)仍然是一个有害的传染性疾病负责约30亿人感染。据世界卫生组织(WHO)统计,其祸害声称全世界每年接近160万人死亡(世界卫生组织。可以在:http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/)由于多重耐药菌株的流行,可怜的坚持很长一段时间治疗,艾滋病毒侵染诱导免疫妥协,和公共卫生的社会和经济约束1]。

卡介苗(BCG)是唯一批准antituberculous通过串行体外通过疫苗开发牛分枝杆菌直到它变成unpathogenic [2),但其功效已经质疑了几十年。甚至儿童可提供可靠的保护,它不一致在限制成年结核感染(3]。更有趣的是,BCG减少整体其他传染病的发病率和死亡率,这表明BCG提供non-TB病原体的保护性免疫反应。此外,波士顿咨询公司拥有强有力的免疫刺激性属性治疗膀胱癌,多发性硬化症,1型糖尿病(2,4- - - - - -6]。鉴于其势,毫无疑问,BCG仍然是成功的,负担得起的,和有前途的疫苗,特别是在一个资源有限的区域。

新的抗结核疫苗发展侧重于改善BCG通过增强其免疫原性或启动—提高策略应用到放大的保护性反应7- - - - - -11]。然而,抑制宿主微环境会绕过保护性免疫反应。在我们推进的发展一个新的或改进的结核病疫苗来对抗这种病原体,它对于更好地探索主机限制BCG-induced至关重要的保护。

目前,有有限的努力定义宿主因素调节BCG的功效。主机控制结核感染的能力在很大程度上是依赖于抗原递呈细胞如巨噬细胞和树突状细胞(dc)最初的适应性免疫反应。甚至可以感染巨噬细胞和DCs结核病,巨噬细胞,而装备控制内化结核病通过没有生产,而结核病可以劫持巨噬细胞逃避免疫监视。另一方面,DCs是著名的主要参与者越来越多对结核的有效的T细胞介导免疫反应(12]。因此,DCs被认为是作为新型结核病疫苗的策略(目标8]。由于DCs是异构的人口,不同的直流亚型贡献不同TB-specific T细胞的激活和极化。的表型和功能改变在DCs已报告在个人与结核感染。1型极化DCs (dc1)诱导Th1反应和ctl结核感染(13]。此外,监管DCs (DCreg)具有抑制势分泌大量的可溶性因子,例如,PGE2, il - 10,和没有能力抑制T细胞反应(14- - - - - -16]。虽然我们和其他人以前显示的关键作用DCs在结核病感染的保护性免疫,DCs的力量在疫苗研发尚未意识到17- - - - - -19]。

细胞因子白细胞介素- 10”(il - 10)与结核病的发病机理(20.]。il - 10是一个重要的免疫调节细胞因子主要由巨噬细胞、单核细胞、T细胞,et al。(21]。特纳等人表明,增加活化的潜伏性感染的易感性密切相关的il - 10的表达在慢性感染或潜伏阶段(22]。人类通过阻断il - 10帮助结核病持久性吞噬体成熟巨噬细胞(23]。il - 10的表达下调免疫反应和il - 10可以在肺结核患者发现了我们调查是否il - 10在BCG接种过程中发挥作用功效[24,25]。

在目前的研究中,我们隐含IL-10KO老鼠探讨il - 10的潜在作用BCG疫苗接种效果。我们的数据支持,DC活化受阻BCG接种疫苗由于il - 10的生产。il - 10阻止发展的保护性Th1免疫反应可能与Treg活动增加。

2。材料和方法

2.1。老鼠和培养基

动物处理符合动物使用指南制定的伦理委员会动物保健和使用。雌性小鼠C57BL / 6(6 - 8周)和IL-10KO老鼠(南京Junke生物工程有限公司,中国)被安置了两周之前的研究。本研究甘肃省级医院的伦理委员会批准。RPMI 1640介质(生物产业、以色列)补充10% HI-FBS (heat-inactivated胎牛血清),1%的谷酰胺,25岁μL /毫升庆大霉素, 作为细胞培养的完全培养基。PBS是用作控制。

2.2。生物和BCG疫苗接种和挑战(图模型1)

图1
BCG疫苗接种和挑战的图表建立小鼠模型的卡介苗/挑战。IL-10KO和WT老鼠住2个星期后到达。疫苗接种的小鼠静脉注射注射 200年CFU卡介苗μL PBS;对照组只给予PBS。为挑战,D21疫苗接种后,小鼠鼻内感染 CFU BCG。免疫反应被发现后21天。

BCG菌株是由武汉生物制品研究所有限公司扩张的疫苗,该协议是应用基于之前的研究(12]。短暂,BCG生长在麦德的7 h9肉汤(美国BD Difco)含有0.2% ( )甘油和0.05% ( )渐变- 80和提供10% ( )麦德ADC浓缩(Difco) 21天。波士顿咨询公司的股票之前发现了细菌的数量在使用前储存在-80°C。菌落(cfu)测定镀稀释文化板块的麦德布鲁克7 h11琼脂(Difco)含有0.5% ( )甘油和提供麦德OADC浓缩(Difco)。BCG为65°C 1小时失活,导致完全杀死BCG(香港BCG)证实了可行性测试。小鼠静脉注射免疫 200年CFU卡介苗μL无菌无蛋白免疫后21天PBS和牺牲(如前所述)(26,27]。脾脏在1.5毫克/毫升无菌隔离和消化胶原酶D(美国σ)37°30分钟。单一细胞细胞悬液后准备穿过细胞过滤器(70μ米)。DC表面标记表达式是收集的咏叹调二流式细胞分析仪(美国CA BD)和分析使用FlowJo软件。接种小鼠鼻内挑战(i.n) BCG的菌落。小鼠安乐死21 d后免疫反应和分析。

2.3。肺、脾、和局部淋巴结细胞隔离

单个细胞隔离肺、脾和引流淋巴结(dLN)为批量设置文化和流式细胞术分析描述(28,29日]。简而言之,脾脏被切成小块,消化在1.5毫克/毫升胶原酶D RPMI 1640 30分钟在37°C。细胞悬液细胞过滤器过滤(70μ米),红细胞表面被ammonium-chloride-potassium (ACK)裂解缓冲(150 L NH更易4Cl, 10 L KHCO更易3和0.1 L更易与EDTA)。肺组织被收获无菌和2毫克/毫升胶原酶消化XI(美国σ)RPMI 1640 1 h在37°C。消化后,35%(体积/体积)Percoll(法玛西亚、美国)是用于收集肺单个细胞。和ACK裂解缓冲被用来去除红细胞(红血球)。dLN单核细胞隔离,dLNs均质3毫升RPMI 1640和红血球被ACK裂解缓冲。所有的细胞都是清洗和resuspended完全rpmi - 1640中。单细胞悬浮体的浓度在48-well培养板 (脾)和 (肺和dLNs)细胞/与香港BCG ( CFU /毫升)。的收集上层的细胞培养后3 d和干扰素的化验γ,il - 4、il - 6和TNFα生产的酶联免疫吸附试验(ELISA)使用抗体购自eBioscience或BD生物科学12]。

2.4。CD4的隔离+T细胞和直流Coculture

脾脏CD4+T细胞是隔绝WT小鼠接种卡介苗后我们之前描述的30.]。DCs是纯化WT的脾脏和IL-10KO总量作为分母老鼠这流仪排序。DCs ( 细胞从WT /毫升)或IL-10KO总量作为分母老鼠这与CD4 cocultured+T细胞( 细胞/毫升)在96 -孔板在HK-BCG ( 200年CFU /毫升)μL完成RPMI媒介。用于测试干扰素γ和il - 4生产,上层清液收集在72 h, ELISA检测。

2.5。肺癌病理分析

WT或IL-10KO老鼠的肺BCG后收集的挑战,缓冲福尔马林固定在10%。肺组织是嵌入式,切片,染色)描述(26,31日]。浸润炎症细胞被确定基于细胞的形态和特征。幻灯片是病变检查使用光学显微镜由2个独立的病理学家。

2.6。流仪结果

细胞内的干扰素γ——或者Foxp3-positive T细胞分析细胞内细胞因子染色如前所述[28]。简单地说,这些细胞被刺激与phorbolmyfismte乙酸酯(PMA);50 ng / mL)和ionomycin (1 g / mL) 2小时,然后brefeldin添加到文化,这些细胞被培养为另一个4 h积累细胞因子的细胞。这些细胞被收集并与anti-CD3染色Ɛ异硫氰酸荧光素(FITC) anti-CD4-phycoerythrin (PE)马伯,和anti-CD8-PerCy5.5 (BD、钙、美国)。被固定在透化作用缓冲,洗两次后,与anti-IFN细胞被染色γallophycocyanin (APC)。与FITC-anti-CD3 Treg检测,细胞被染色Ɛ,PerCy5.5 anti-CD4、APC anti-CD25 PE-Foxp3。所有的样本数据收集使用Aria二流式细胞分析仪(美国CA BD)和分析使用FlowJo软件。

2.7。统计分析

统计分析的数据是使用方差分析(方差分析)和执行 测试(GraphPad棱镜软件,版本5.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)),和价值观 被认为是显著的。数据了 (SD)。提出了数据收集从四到五每组的老鼠。所有的实验至少重复三次得到了类似的结果。

3所示。结果

3.1。减少炎症后IL-10KO结核病的挑战

进一步评估il - 10在BCG接种疫苗的作用功效,我们挑战高剂量的总量作为分母老鼠这鼻内BCG ( )和发现肺部炎症。如图2IL-10KO老鼠使用BCG显示,温和渗透到肺部炎症与挑战。相比之下,WT老鼠与BCG接种和挑战更加严重的病理性炎症反应。有趣的是,和WT IL-10KO老鼠有非常轻微的炎症细胞在肺部BCG免疫没有挑战。数据表明,IL-10KO缺乏可以显著调节病理炎症反应在当地组织(12]。


图2
接种疫苗的病变IL-10KO和WT小鼠鼻内(i.n)挑战接种卡介苗后感染。进行预处理小鼠鼻内与挑战 cfu BCG和分析在21天肺组织病理学变化postchallenge感染。肺组织部分(6μm)沾炎症)。(一)低放大率(×10),(b)高放大率(×40)。三个独立实验的代表( )与类似的结果。
3.2。il - 10缺乏提高Th1和细胞毒性T细胞后经BCG的挑战

检查免疫反应在BCG-challenged IL-10KO老鼠和WT老鼠,我们进行了T细胞的细胞内细胞因子染色后小鼠的肺和淋巴结收集BCG的挑战。如数据所示3和4IL-10-deficient老鼠显示更高的干扰素γ生产CD3Ɛ+T细胞,这是符合保护性反应观察肺部病理变化,同样的干扰素γ+CD4+和干扰素γ+CD8+T细胞在肺部和dLN IL-10KO老鼠。总的来说,结果表明,il - 10块Th1反应,以及细胞毒性T细胞分枝杆菌感染的发展。il - 10的生产可能会在一定程度上导致了无效的BCG接种疫苗。

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图3
IL-10KO老鼠显示更高的干扰素γ生产后BCG挑战在肺部。老鼠被视为中描述的传奇人物4。描述的肺部都消化在材料和方法。细胞内的干扰素γ艾滋病患者T细胞分析细胞内细胞因子染色如前所述[29日]。(一)控制策略:首先,进一步的主要细胞被封闭的大门基于CD3Ɛ表达式。然后,CD3Ɛ +细胞的CD4和CD8 CD4的表达+和CD8+T细胞。(b)干扰素- FAC的数据分析γ +表达式被显示。(c)的总结干扰素-的百分比γ +CD3Ɛ +,CD4+,CD8+T细胞在肺部和学生的 测试是用于分析。三个独立实验的代表( )与类似的结果。 , 。
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图4
IL-10KO老鼠显示更高的干扰素γ生产后在dLN BCG挑战。描述的老鼠被视为传奇。从dLN单一细胞染色,细胞内的干扰素γ艾滋病患者T细胞分析细胞内细胞因子染色如前所述[29日]。FAC (a)代表数据分析显示。(b)的总结干扰素的百分比γ +CD3Ɛ +,CD4+,CD8+在dLN T细胞。数据显示为三个独立实验的代表与相似的结果( )和学生的 测试是用于分析。 。
3.3。Th1和Tc反应限制了il - 10在BCG接种疫苗生产

众所周知,Th1和Tc结核病感染控制的关键。进一步探讨il - 10的角色在Th1和Tc发展BCG接种疫苗期间,T细胞IL-10KO子集被检查和WT小鼠接种卡介苗后。细胞分离脾被多色染色分析。如图5IL-10KO提升主导Th1(干扰素γ+CD4+T细胞)生产和Tc生产(干扰素γ+CD8+T细胞)。没有il - 10,它表明BCG接种疫苗能诱导更好的Th1和Tc免疫反应对结核病感染可能提供更好的保护。

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图5
IL-10KO小鼠更高的干扰素γ接种卡介苗疫苗在脾脏后生产。脾是消化的酶中描述的材料和方法。这些细胞被沾FITC anti-CD3Ɛ、PE anti-CD4 PerCy5.5 anti-CD8, APC anti-IFNγ。细胞内的干扰素γ阳性细胞时,细胞内细胞因子染色分析细胞CD3封闭Ɛ像前面描述的那样,CD4和CD8 (29日]。FAC (a)代表数据分析显示。(b)的总结干扰素的百分比γ +CD3Ɛ +,CD4+,CD8+在脾脏T细胞,学生的 测试是用于分析。 , 。三个独立实验的代表( )与类似的结果。
3.4。IL-10KO老鼠明显高于保护接种卡介苗疫苗在脾脏细胞因子后生产

进一步探讨系统性免疫反应WT与IL-10KO BCG免疫小鼠后,脾、肺、淋巴结收集无菌细胞和脾细胞的大部分文化隔绝排水LN和肺组织被用来检测上清液中细胞因子的生产IL-10KO和WT小鼠接种卡介苗后。如图6,干扰素γ和il - 6水平显示显著的高于IL-10KO老鼠WT老鼠相比,但可比的il - 4水平被发现在脾脏,肺,dLN在两种类型的老鼠。,而令人惊讶的是,肿瘤坏死因子αIL-10KO小鼠水平高于WT小鼠脾脏和dLN但不是在肺部。数据表明,il - 10抑制保护干扰素γ和肿瘤坏死因子α表达式,以及il - 6生产,甚至可比TNFα从这两种类型的小鼠表达在肺部。

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图6
接种卡介苗疫苗在IL-10KO老鼠后细胞因子水平相比WT老鼠。IL-10KO和WT小鼠接种BCG中描述的材料和方法。d 21疫苗接种后,单个细胞准备从脾,肺,dLN培养72 h与HK-BCG刺激( 上层清液收集之前cfu /毫升)。细胞因子是由ELISA测定。数据进行了综述和代表三个独立的实验也显示类似的结果。 , 。
3.5。il - 10可以抑制T细胞激活的DCs BCG接种疫苗

检测il - 10在导演的DC函数T细胞分化,脾脏DCs和WT IL-10KO小鼠接种卡介苗后纯化的流式细胞仪。CD4+脾脏T细胞被孤立的总量作为分母WT这老鼠。DCs是cocultured BCG-boosted CD4+T细胞。il - 4和干扰素γ生产文化上层清液中检测到。如图7,DCs IL-10KO小鼠il - 4和正发起γ生产CD4+从WT小鼠T细胞比( )。结果表明,il - 10可能导致信号直流功能障碍在BCG接种疫苗。

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图7
细胞因子的生产从DC-CD4+T细胞coculture系统。脾脏DCs ( 细胞从WT /毫升),IL-10KO总量作为分母老鼠这cocultured BCG-educated CD4+T细胞( 细胞/毫升)中描述的材料和方法。细胞上清液收集在72 h干扰素γ通过ELISA和il - 4检测。数据进行了综述 ( )和代表三个独立的实验也显示类似的结果。 , 。
3.6。il - 10防止直流BCG疫苗接种后的激活

DC在启动免疫反应的功能很大程度上取决于costimulatory表面分子的表达。在调制直流检测il - 10的作用生产函数在BCG接种疫苗,应用流式细胞仪检测表面标记表达式后脾脏DCs BCG免疫。如表所示1,没有跳WT与IL-10KO老鼠关于CD80、CD86,疫苗接种前和CD40表达。然而,BCG免疫后,脾脏DCs IL-10-deficient老鼠表达更高的CD80(89.79%比58.32%),CD86(32.66%比25.73%),和CD40分子(20.95%比15.38%)相比,DCs的WT老鼠。它表明BCG接种疫苗可以激活DCs抑制il - 10的生产。

表1
对直流的表面分子表达WT / IL-10KO老鼠( )。
3.7。卡介苗接种后IL-10KO老鼠减少亚群

调节性T细胞亚群)的角色,尤其是Foxp3+亚群,研究在感染结核病的挑战。结果表明:增加Treg有关结核病感染的发病机理(32]。Treg肺组织流式细胞仪分析显示Foxp3少+CD25+CD4+BCG后T细胞在肺部IL-10KO老鼠的挑战(图8)。总的来说,结果表明增加干扰素γ没有il - 10表达但减少Treg BCG后反应的挑战。

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图8
肺Foxp3+Treg细胞分析在BCG挑战IL-10KO和WT老鼠。老鼠被视为中描述的传奇人物7。肺单个细胞和FITC染色anti-CD3Ɛ,PerCy5.5 anti-CD4、APC anti-CD25 PE-Foxp3。Foxp3的表达时,流式细胞术分析细胞CD3封闭Ɛ +CD4+T细胞。(一)代表Foxp3的照片+CD3Ɛ +CD4+CD25+亚被显示。(b)的总结Foxp3的频率+CD25+CD4+T细胞总T细胞在肺部。数据显示为 ( )并代表三个独立的实验也得到了类似的结果。 。

4所示。讨论

BCG的保护效果是变量对结核感染。一些研究致力于BCG工程增加其抗原性开车一个理想的免疫反应对结核病(33,34]。可能调节宿主免疫疫苗的成功是至关重要的。宿主遗传异质性是部分负责BCG失败,宿主因素可能有针对性的加强这种疫苗的效力。在这项研究中,我们旨在调查的角色宿主因子il - 10在BCG疫苗接种效果。接种卡介苗疫苗在IL-10-deficient主机数据支持,可以通过upregulation促进DC活化表面分子的表达。体内IL-10KO小鼠接种BCG促进干扰素γ生产,符合BCG挑战后的保护作用。接种卡介苗后轻度肺部病理变化/挑战支持il - 10的缺乏导致了更高的保护性反应。在临床实践中,增加对人类的发展进步的结核病易感性增加il - 10水平报道(35]。我们的研究探讨了il - 10的臭名昭著的作用的分子机制BCG接种疫苗。

主机控制结核感染的能力取决于招募Th1细胞释放和激活杀死感染细胞的机制。在最近的研究中,以评估Th1-polarizing能力比较免疫调节细胞因子il - 6后,干扰素γ、il - 4和肿瘤坏死因子α生产,我们发现IL-10KO老鼠产生干扰素γ和肿瘤坏死因子α相比WT老鼠。干扰素的倾向γgene-deficient小鼠结核和干扰素的治疗作用γ支持一个至关重要的角色,这对结核的保护性免疫反应的细胞因子。此外,anti-TNF的临床应用α导致复活的结核病感染或疾病患者死于结核病。众所周知,结核感染后,激活1型T细胞,尤其是CD4细胞+T细胞是干扰素的最丰富的细胞来源γ。与大部分文化的数据一致,干扰素的频率要少得多γ生产CD3Ɛ+,CD4+,CD8+T细胞在脾脏WT老鼠比KO小鼠il - 10。

il - 10在免疫应答的作用结核病感染之前已经被研究过。数篇论文表明,il - 10主要是由造血细胞产生和发挥重要作用在抑制巨噬细胞和树突状细胞(DC)的功能。因此,il - 10负责结核病逃避免疫反应的能力(36]。另一项研究调查了il - 10在BCG功效的作用。作者表明,il - 10的信号缺乏在BCG接种疫苗增强Th1和Th17响应,提高了抵御结核病感染(37]。我们的研究重点是检测树突状细胞的功能,免疫反应的乐团,并发现il - 10阻碍了激活延迟的DCs完全激活的T细胞反应。此外,我们的研究首先表明,il - 10提升Treg发展。我们发现调节性T细胞的频率增加IL-10-competent老鼠,而降低il - 10妥协的。我们的研究表明,宿主因素,尤其是树突细胞功能,也许重要性的理解疫苗的功效。这是一个伟大的好处为有效的疫苗接种策略开发适当的佐剂。

相信BCG DCs与CD4“教育”+T细胞,它们相互影响彼此的激活。有趣的是,我们发现IL-10-deficient DCs可以诱导更高的il - 4和干扰素γ生产的CD4+T细胞体外coculture系统。众所周知,Th2反应促进结核病恶化通过抑制Th1反应。给定一个激活Th1、Th2 DC-CD4 T细胞+T细胞coculture系统(图7缺),我们审查的影响il - 10在T细胞活化利用细胞内细胞因子染色后BCG免疫(图5)。为此,总T细胞CD4细胞+,CD8+T细胞亚群与IL-10KO老鼠显示增强的干扰素γ生产在脾。它表明,体内宿主免疫力精益Th1反应没有il - 10在BCG接种疫苗。符合这一发现,IL-10-deficient老鼠没有任何接种卡介苗疫苗/ Th2反应后的挑战。我们推测,Th2和Th1细胞都没有被il - 10生产,但Th2的程度和水平远低于Th1体内il - 4生产可比IL-10KO和WT老鼠。之间的另一个原因不一致的il - 4生产体内T细胞反应和体外coculture研究T细胞在体外coculture系统能够产生il - 10由于其隔绝WT老鼠,而体内接种卡介苗和挑战进行IL-10KO小鼠T细胞反应的背景中il - 10的缺乏。

BCG挑战后免疫小鼠,IL-10KO老鼠更高Th1反应在两肺(图3)和dLN(图4)。它是一致的肺部炎症检测到专业病理学家更促炎反应IL-10KO老鼠相比,在WT老鼠。是符合谢勒等人表明,il - 10缺乏可恢复使用IL-10KO小鼠肉芽肿(Th1反应38]。

值得注意的是分枝杆菌的减毒株(BCG,牛分枝杆菌),但不是致命的快艇在我们目前的研究应用,使用相同的抗原疫苗接种和挑战。然而,研究工作的比较卡介苗和致命的毒株快艇小鼠显示整体动力学和细胞反应可比,干扰素的保护作用γ在波士顿咨询公司或者和Th1反应快艇暴露在老鼠39- - - - - -41]。尽管所有这些描述的相似之处,我们必须谨慎解释我们的研究在临床设置快艇波士顿咨询公司相比是更致命。

鉴于BCG接种疫苗功效还远未满足,努力多集中在抗原修改,我们当前的发现提供了一个新的更好的疫苗佐剂发展战略,以及一个合理的机制来解释异构接种卡介苗疫苗在不同人群后的结果。

数据可用性

科学统计数据用于支持本研究的结果包括在本文中。请求访问这些数据应该向小玲高(电子邮件保护)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有的作者都接受责任的全部内容提交手稿提交和批准。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81860372和81860372),兰州的人才创新和创业项目(批准号2017 - rc - 43),甘肃省自然科学基金(批准号18 jr3ra044),甘肃省的健康产业研究项目(批准号GSWSKY2017-16)。