文摘

在这项研究中,我们调查了MAP激酶的作用phosphatase-1 (MKP-1)和罗格列酮(显示)糖皮质激素抵抗和糖皮质激素敏感性,分别使用豚鼠模型的脂多糖(LPS)诱导突然感音神经性听力损失(SSHL)。猪被分成控制,有限合伙人,有限合伙人+地塞米松(敏捷),有限合伙人+显示,有限合伙人+敏捷+显示组。他们的听力被听觉脑干反应测量检查。免疫荧光染色法是用于识别MKP-1在内耳的位置。MKP-1及相关蛋白的表达水平在内耳使用免疫印迹检测。的形态变化通过hematoxylin-eosin染色观察耳蜗。严重的听力损失在LPS组,而不是保护听力损失有限合伙人+敏捷+显示组中观察到。之间的正相关是观察MKP-1表达水平和保护听力损失。显示和敏捷协同影响内耳炎症。总之,阻力LPS-induced SSHL豚鼠模型糖皮质激素可能导致内耳组织MKP-1功能受损的糖皮质激素引起的损害,抑制炎症。 Our findings present novel targets to develop potential therapeutics to treat inflammatory diseases of the inner ear.

1。介绍

越来越多的研究报道,炎症和氧化应激可能导致突然的感音神经性听力损失(SSHL)和影响预后1- - - - - -3]。SSHL糖皮质激素是主要的治疗选择。他们在维持体内平衡发挥着重要作用,包括免疫功能调节。合成糖皮质激素地塞米松(DEX),已被广泛用于治疗内耳疾病如SSHL、美尼尔综合症的疾病,急性耳鸣。尽管最近的临床研究表明,糖皮质激素治疗可有效预防内耳疾病,相当数量的病人都不敏感,因此抗糖皮质激素。因此,迫切需要有效的药物,防止疾病进展。促炎细胞因子和其他介质假定为糖皮质激素不敏感或发展的阻力。例如,减少糖皮质激素受体(GR)的表达和组蛋白deacetylase-2 (HDAC2)导致糖皮质激素不敏感或电阻(4,5]。最近的一项研究表明,增殖的活性蛋白激酶(MAPK)磷酸酶1 (MKP-1: NCBI官方全名,dual-specificity磷酸酶1 (DUSP1))与皮质类固醇不敏感或耐6]。

DUSPs MKPs属于家庭,扮演一个角色在脱去磷酸基板(7- - - - - -9]。MAPK家族包括三个压力激发了蛋白激酶通路:p38, c-Jun n端激酶(物)和细胞外调节激酶(ERK) [10]。ERK通路主要是由促有丝分裂的激活和增生的刺激,而p38 MAPK和物途径应对环境压力(11]。MKP-1是一种蛋白质,有效地发挥抗炎作用脱去磷酸物和p38 MAPK通路核因素——才会安静下来κB (NF -κ在免疫细胞(B)途径12- - - - - -14]。此外,MKP-1起着至关重要的作用在控制促炎MAPK信号的程度和持续时间在活的有机体内。然而,从严重哮喘患者肺泡巨噬细胞(glucocorticoid-resistant)显示减少诱导MKP-1表达式,由于p38 MAPK的激活15]。在慢性阻塞性肺疾病患者和患者吸烟,MKP-1可能活动由于其氧化,可能导致糖皮质激素抵抗(6]。然而,MKP-1的角色在cochleae尚未报道。

罗格列酮(显示),一个过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR -γγ)受体激动剂,据报道,诱导MKP-1表达式(16]。另一项研究表明,显示可以用作治疗代理急性炎症条件和急性肝损伤(17]。

在这一过程中,就像在其他的研究中,SSHL被诱导的豚鼠模型intracochlear注入脂多糖(LPS) [5,18,19]。首次使用这个模型,我们将演示如何MKP-1保护内耳组织反对inflammation-induced形态学损伤和功能障碍。我们还阐明了协同效应的显示和敏捷MKP-1表达和糖皮质激素抵抗。因此,这项研究可能为潜在的治疗提供新靶点治疗内耳的炎性疾病。

2。材料和方法

2.1。药物

有限合伙人和显示从Sigma-Aldrich购买化工有限公司(圣路易斯,美国)。敏捷是购自上海交通大学附属第六人民医院(上海,中国)。

2.2。道德和动物

所有动物实验伦理委员会批准的上海交通大学附属第六人民医院。和处理豚鼠的机构批准的动物保健和使用委员会和之前按照动物(科学程序)法案1986(2013年修订)(20.]。豚鼠都安置在单独通风笼(每笼两个或三个)在特定无菌(SPF)条件。

2.3。动物模型和药物治疗

三十岁男性白化豚鼠平均体重随机分为5组(250克 )包括美联社(人工外淋巴),有限合伙人,有限合伙人+敏捷,有限合伙人+显示,有限合伙人+敏捷+显示组。美联社耳蜗灌注进行猪AP组。有限合伙人耳蜗灌注进行猪LPS组。有限合伙人耳蜗灌注表现,敏捷在LPS腹腔内注入猪+敏捷团队。有限合伙人执行耳蜗灌注并显示在LPS腹腔内注入猪+显示组。有限合伙人耳蜗灌注进行敏捷和显示在LPS腹腔内注入猪+敏捷+显示组。敏捷(1毫克/公斤)或显示(3毫克/公斤,稀释在二甲亚砜)或两人都是腹腔内注射30分钟手术前和手术后24小时。实验对象被放置在一个加热垫与恒温控制维持体温在38°C。Cochleostomy进行吸入剂isoflurane-anesthetized猪(维护、归纳为4%,2%和0.3 L / min O₂流量)注射LPS(5毫克/毫升)或AP(氯化钠145毫米,氯化钾2.7毫米,MgSO₄2.0毫米,CaCl₂1.2毫米,玫瑰,C₈H₁₈N₂O₄5.0毫米)。利多卡因(1%)是他们postauricular皮下注射区域。后他们的听觉大疱是直言不讳地切割的一部分。洞,直径0.3毫米,被扎进他们的乳突大疱公开基底的耳蜗。孔是通过骨壁基底转鼓阶的耳蜗。耳蜗注射注射用玻璃制成的小费34 G缩微胶片,连接到一个微型注射器泵(Micro4;美国基WPI)通过聚乙烯管。然后,5μL(有限合伙人/美联社50问/ s的速度注入鼓阶。与肌肉组织cochleostomy洞被关闭,而洞在他们的大疱封闭了肌肉缝合和皮肤切口。

2.4。听觉脑干反应(ABR)测试

ABR阈值测定手术前和手术后48 h。均值阈值变化从两只耳朵平均在所有科目。首先,豚鼠与氯胺酮麻醉(40毫克/公斤)混合甲苯噻嗪(4毫克/公斤,ip)。体温保持在38°C。对于闭域ABR测试,声音信号通过一根塑料管测试耳。三个皮下电极反应被用来记录。记录电极被插入到顶点,而背后的参考和接地电极插入外耳道。三个电极的两端连接到一个RA16PA前置放大器。负系统III(美国佛罗里达州Tucker-Davis技术、Alachua)被用于刺激的一代。刺激是通过宽带扬声器(MF1; TDT). The sound level was decreased by 5 dB steps from 90 dB SPL until the response disappeared. The ABR thresholds were tested at 1, 2, 4, 8, 16, and 32 kHz, which are the lowest levels at which repeatable wave III responses can be recorded.

2.5。免疫荧光

调查的表达在豚鼠的耳蜗,MKP-1耳蜗ABR测试后被删除。耳蜗是固定在4%多聚甲醛在磷酸盐(PBS)在4°C 2 h。然后,耳蜗转入PBS和它的骨壳是移除。移除盖膜后,基膜和螺旋神经节(胡志明市)小心翼翼地剥落,紧随其后的是沉浸在PBS含有1% Triton x - 100 1 h和孵化5%山羊血清1 h。接下来,基膜和螺旋神经节与初级孵化兔子anti-MKP-1抗体(1:100)(美国亲和力生物科学)20 h在4°C。其次是孵化的Alexa萤石®488山羊anti-rabbit免疫球蛋白(二次抗体)(1:500)(Abcam,剑桥,英国)2 h 25°C。异硫氰酸荧光素(FITC) phalloidin(1: 500)(细胞骨架Inc .)有限公司、美国)被用来染色毛细胞静纤毛束。4 ,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)(美国Sigma-Aldrich)是用于核酸染色。部分cover-slipped, LSM 710共焦显微镜检查(蔡司、从、德国),2011禅宗和分析软件(蔡司、从、德国)。

2.6。Hematoxylin-Eosin染色

病理变化观察豚鼠的耳蜗使用hematoxylin-eosin(他)染色。猪的耳蜗组织脱钙在乙二胺四乙酸(EDTA)然后在乙醇脱水。然后他们被嵌入在石蜡。此后,他们把一个3μ米厚度和沾染了他。的部分观察LSM 710元共焦激光扫描显微镜(蔡司、上海、中国)。胡志明市细胞从基地到每个部分的顶点罗森塔尔的运河被计算。最后,胡志明市细胞密度(数量/ 10000μ米²)进行了分析。

2.7。免疫印迹分析

提取蛋白质从耳蜗样本准备radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区和蛋白酶抑制剂phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF) 100: 1的比例(Beyotime生物技术研究所、上海、中国)。蛋白质浓度检测使用Bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包(Beyotime生物技术研究所)。样品溶解产物(30μg蛋白每车道)接受了10%的钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜孔径为0.22μ米(微孔,Billerica,妈,美国)。2 h的膜被封锁在室温下有5%的脱脂牛奶与Tween-20 Tris-buffered盐水(TBST),然后用适当的孵化主要抗体(1:800 - 1:1000稀释)在4°C 20 h。与TBST洗涤三次10分钟后,细胞膜是孵化HRP-conjugated二级抗体(Proteintech 1: 5000年,芝加哥,美国)1 h 25°C。抗体绑定对墨迹图可视化在600年通用电气公司Amersham成像仪成像系统使用增强化学发光检测设备(美国细胞信号技术,波士顿,MA)。结果表示为一个百分比的GAPDH表达相对蛋白质含量。p38 MAPK抗体(猫。没有8690年代),phospho-p38 MAPK(猫。不。4511年代),NF -κB p65(猫。不。8242年代),phospho-NF -κB p65(猫。不。3033年代),GAPDH(猫。不。5174年代)购买的细胞信号技术。Anti-MKP-1(猫。不。AF5286)购买的亲和力生物科学(美国辛辛那提,哦)。Anti-GR(猫。不。 ab3578) was purchased from Abcam.

2.8。统计分析

所有统计分析使用SPSS 23.0版(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。描述性统计计算每组。单向方差分析(方差分析)是用于评估群体之间的差异。显著性水平是设定在 。

3所示。结果

3.1。对每组的听觉功能的评价

每组的听阈变化是衡量使用ABR测试之前和在不同频率(图48 h后手术1)。平均在每个频率阈值变动(1、2、4、8、16和32 kHz) AP组低于10 dB,表明手术没有影响听力的功能。阈值变化LPS组明显高于AP组( )。此外,听力障碍的程度和频率增加。有限合伙人的阈值变动+敏捷组相比,在降低LPS组;然而,观察显著差异只在16和32 kHz。这表明,敏捷只有部分影响LPS-induced听力损失和糖皮质激素抵抗。有限合伙人+显示组中的阈值变动部分减少,但没有显著差异与LPS组相比,除了在32 kHz。有限合伙人+敏捷+显示组具有显著的听力保护装置。阈值显著降低而转向,LPS组2、4、8、16和32 kHz。此外,阈值变动显著降低2,4,有限合伙人+敏捷+显示16赫兹,有限合伙人+敏捷团体。这些发现表明LPS引起显著的内耳听力损失,显示的结合和敏捷大大防止听力损失。

3.2。MKP-1组织化学染色,在基膜和螺旋神经节

如图2,MKP-1免疫荧光染色AP组显示耳蜗基底膜的头发MKP-1位于细胞核和细胞质中。另外,图3显示的本地化MKP-1螺旋神经节的猪在AP组。然而,MKP-1丰富神经元比头发细胞的细胞质中。没有显著差异MKP-1的位置在不同的组。图4显示了完整的基膜组织化学染色,在美联社和LPS组。美联社组相比,LPS组显示没有明显的内或外毛细胞,静纤毛的结构是正常的。

3.3。耳蜗的组织学检查

每组的病理观察耳蜗图所示5。他染色均匀染色的螺旋韧带AP组和没有差距在耳蜗内侧壁。在形状的条痕vascularis是正常的,没有破裂或红细胞渗出物。螺旋神经节的安排,和核/等离子配给是正常的。LPS组螺旋韧带稀疏,其结构是无序的。螺旋神经节显示空泡变性,核/等离子体比率下降。这些观察表明,有限合伙人破坏内耳形态学。然而,有限合伙人的形态学损害略下降+敏捷和有限合伙人+显示组,但一些变化,如螺旋韧带放松和减少核/等离子体比还观察到。有限合伙人的形态恢复+敏捷+显示组最明显。纹的形态vascularis螺旋韧带是正常的,并没有明显的差距和耳蜗的侧壁。 The spiral ganglion/nucleoplast ration was also improved. The density of spiral ganglion cells in the LPS group was significantly lower than that in the AP group ( )。有限合伙人+敏捷和有限合伙人+显示组相比没有显著增加LPS组( ),但是,有限合伙人+敏捷+显示组相比有显著提高LPS组( )。虽然螺旋神经节细胞的密度在有限合伙人+敏捷+显示组明显低于在AP组( ),这是明显高于在有限合伙人+敏捷组或有限合伙人+显示组( )。这表明敏捷的组合,显示有一个比单独的每一个更强有力的保护作用。

3.4。免疫印迹分析MKP-1和相关的蛋白质

MKP-1的表达,GR、p38 p-p38, NF -κB p65, p-NF -κB p65决心通过免疫印迹分析(图6)。的表达MKP-1 LPS组明显低于AP组( )。MKP-1表达式中没有明显高于有限合伙人+敏捷或有限合伙人+显示组相比,LPS组( )但明显高于有限合伙人+敏捷+显示组比有限合伙人+敏捷集团( )。同时,GR表达LPS组显著高于AP组( )也明显高于有限合伙人+敏捷+显示组比有限合伙人+敏捷集团( )。此外,p-p38 / p-NF -的表达κB p65 LPS组显著高于AP组( ),虽然显著低于有限合伙人+敏捷集团( )相比,有限合伙人+敏捷+显示组。此外,没有明显降低LPS +敏捷和有限合伙人+显示组相比,LPS组( )。这些结果表明,敏捷和显示可以显著增加MKP-1和GR的表达式。此外,引起的病变可以缓解LPS抑制p38 / p-NF -的激活κB。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了MKP-1的作用,糖皮质激素抵抗使用豚鼠模型的显示LPS-induced SSHL。我们演示了第一次从inflammation-induced MKP-1保护内耳组织形态学损伤和功能障碍通过抑制p38 MAPK和NF -的激活κb。我们的研究结果也显示,显示和敏捷之间的协同作用可以增加MKP-1表达式和减少糖皮质激素抵抗。

虽然糖皮质激素在临床上广泛使用,相当数量的患者显示抗糖皮质激素治疗。这些患者通常有一个高风险的不良预后不仅由于原发性疾病本身,而且产生的不良反应长期使用糖皮质激素。他们的访问和住院率往往远高于其他患者,从而增加这些个人和社会的经济负担。当糖皮质激素进入原生质膜和GR结合,他们可以诱导的重排GR复杂促进其进入细胞核,积极或消极的调节基因转录(21]。多种因素参与糖皮质激素抵抗的分子机制(22,23]。近年来,人们已经发现,多态性的GR减少配体的亲和力,导致糖皮质激素抵抗(24]。另一项研究报道,糖皮质激素抵抗相关缺陷GR表达和促炎的转录因子的表达升高25]。Kojika等人发现,一半寿命和HSP70的变化可能与糖皮质激素敏感性下降。异常以及HSP70蛋白水平成功检测到两glucocorticoid-resistant人类白血病细胞系(26]。表达的增加NF -κB在哮喘患者的外周血单核细胞被发现糖皮质激素反应呈负相关。NF -之间的对抗可能的潜在机制κB和GR减少糖皮质激素敏感性[27]。

最近,Irusen等人发现p38 MAPK激活可以诱导GR磷酸化和功能障碍(28]。此外,p38 MAPK的磷酸化激活能增加NF -κB p65亚基(29日]。MKP-1作为先天免疫反应的重要调节器MAP激酶和NF -才会安静下来κB (9- - - - - -13]。Goleva等人发现糖皮质激素抵抗与MKP-1感应的降低有关,导致持久p38 MAPK在外周血单核细胞活化。同时,Bhavsar等人报道,敏捷不能诱导的表达MKP-1抗类固醇)反应(严重哮喘患者(15]。炎性因子的影响下,MKP-1基因敲除小鼠有经验的增加水平的细胞因子和化学因子,增加嗜中性粒细胞浸润和更严重的器官损伤,比野生型小鼠(30.]。此外,炎症和氧化应激也导致SSHL。在目前的研究中,我们发现MKP-1内外毛细胞表达,支持细胞,在耳蜗螺旋神经节细胞。这主要是在细胞质和细胞核在某种程度上。

显示主要是作为治疗糖尿病的胰岛素敏化剂。最近的研究在过氧物酶体proliferative-activated受体(PPAR)γ表明,显示有抗炎和抗氧化作用31日- - - - - -33]。同时,泰等人发现显示可以抑制非小细胞肺癌的扩散和转移在活的有机体内和在体外通过感应MKP-1 [16]。显示还可以增加MKP-1表达,从而抑制细胞入侵在人类神经胶质瘤细胞34]。

糖皮质激素的抗炎作用与GR绑定后主要通过增强抗炎或炎症基因的转录。MKP-1是一个重要的抗炎蛋白转录糖皮质激素(35]。在这一过程中,就像在以前的研究中,我们发现豚鼠的听觉功能与SSHL没有糖皮质激素治疗后显著改善,这表明糖皮质激素抵抗或不敏感5]。同时,有限合伙人的阈值变动+敏捷+显示组最低,表明MKP-1可以实现其抗炎效应通过抑制p38 MAPK在内耳的活动。进一步,MKP-1表达式在有限合伙人+敏捷+显示组高于有限合伙人+敏捷和有限合伙人+显示组。敏捷就不能有效地提高SSHL MKP-1的表达,导致无法控制炎症。此外,在LPS刺激,GR表达调节反馈效应,但其upregulation更重要在有限合伙人+敏捷+显示组比有限合伙人+敏捷组。有限合伙人+敏捷+显示组有最好的抗炎效果。进一步显示,表现出抗炎作用,导致恢复减少GR水平和功能受损引起的炎症。因此,当显示结合敏捷,可以增强MKP-1的表达。因此,显示可能发挥重要的作用在提高糖皮质激素抵抗SSHL内耳和其他障碍,由于血糖水平较低的能力,控制炎症,消除毒素和副作用。因此,此类疾病的潜在的新疗法。

对我们的研究有一定的局限性。首先,豚鼠模型LPS-induced SSHL并不完全代表SSHL的临床发病机理。进一步的研究应该执行使用动物模型更适合SSHL研究和临床试验。其次,本研究首次使用PPAR -γ受体激动剂显示治疗内耳疾病的PPAR -的结构和功能γ是非常复杂的,有很多未知的方面去探索。

我们将调查显示未来的路线和管理时间的实验。

5。结论

总之,MKP-1是激素的抗炎效果的关键因素在内耳组织。糖皮质激素抵抗机制的豚鼠模型LPS-induced SSHL MKP-1感应可能与睾酮水平有关,导致持续激活MAPK在内耳。显示和糖皮质激素的使用提供了一种新的治疗选择在SSHL糖皮质激素抵抗。

数据可用性

任何人谁需要日期,请联系相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益相关的出版竞争。

作者的贡献

梁夏,晶晶刘同样对本文亦有贡献。

确认

本研究支持由中国国家自然科学基金(81771015号和81670937号),促进临床技能上的三年行动计划/临床创新市级医院(16 cr4027a)、上海市教育委员会/临床医学高峰给予支持(排名20152526)。