文摘

树突状细胞(dc)是一种抗原递呈细胞,在免疫反应中发挥重要作用鲁兹锥体恰加斯病的病原体。在体外和在活的有机体内研究表明,这些细胞的调制这种寄生虫可以直接影响主机的先天性和获得性免疫反应以促进其生物循环和物种的蔓延。许多研究显示机制t . cruzi调节DCs,但这些细胞之间的相互作用与墨西哥株t . cruzi如Ninoa和INC5尚未正确地调查。这里,我们评估是否Ninoa和INC5菌株逃避宿主的免疫调节小鼠dc的生物学和功能。CL-Brener应变是用作参考应变。在此,它是证明Ninoa感染性骨骨髓来源树突状细胞(BMDCs)比INC5和CL-Brener菌株BMDCs BALB / c和C57BL / 6小鼠。墨西哥的t . cruzi不同细胞因子诱导模式。在BMDCs从BALB / c小鼠,获得Ninoa应变导致减少il - 6和il - 10产量的增加,而在C57BL / 6小鼠Ninoa应变大大增加了作品的TNF -α和il - 10。Ninoa和INC5不同调制BMDC表达mhc ii, TLR2和TLR4在BALB / c和C57BL / 6小鼠相比,巴西的应变CL-Brener。这些结果表明,t . cruzi墨西哥株不同感染和调节mhc ii, toll样受体,在DCs和细胞因子的生产从C57BL / 6和BALB / c小鼠,这表明这些菌株已经开发出特定的调节策略破坏DCs和,因此,宿主的免疫反应。

1。介绍

恰加斯病,一种疾病医生和研究人员发现110年前的卡洛斯•恰加斯病是一种严重的公共卫生问题,影响全世界约800万人(1,2]。鲁兹锥体疾病的病因代理人,种内遗传和表型异质性。基于系统发育、分子、生化和生物标记,疾病的病原体是分成六个离散输入单元(系统)从TcI TcVI (3- - - - - -5]。的遗传多样性t . cruzi施加影响生物、临床、免疫和疾病的流行病学变化,这也直接关系到建立感染(6,7]。例如,TcVI基因型与人类恰加斯病在南美国家,尤其是赤道以北的几例人类感染病例报告(4]。具体来说,CL-Brener应变(8)属于TcVI基因型,metacyclic形式来源于这一毒株高度侵袭性在体外和在活的有机体内(9- - - - - -11]。TcI被认为是均匀但包含最大分布在描述基因型,分为五组(TcIa-TcIe) [5,12- - - - - -15]。TcI的基因型在墨西哥和负责主导导致大多数恰加斯病的临床表现。墨西哥株的基因型有不同的生物学特性,如增长,metacyclogenesis和传染性在体外会导致专利和subpatent寄生虫血症。然而,株属于同一TcI的基因型有不同的入侵细胞并导致感染的能力(16- - - - - -21]。实验研究表明,尽管墨西哥株属于同一TcI基因型,呈现不同的感应的死亡率(0 - 100%),肌细胞取向(主要是骨骼和心脏),在炎症过程中产生的感染。这表明这些菌株之间的生物学行为变化在同一里程计(16,17,19,20.]。因此,阐明底层机制产生如此多的差异即使在同一基因型菌株在同一地理区域和在墨西哥对理解疾病至关重要。

的t . cruzi寄生虫呈现三种形态类型的生物循环,和这些metacyclic trypomastigotes期间感染形式通过锥蝽消除血喂养(9,16,22- - - - - -24]。提供的表面分子metacyclic trypomastigotes基本为寄生虫与宿主的相互作用,并通过这些表面分子,原生动物可以被宿主防御细胞。在这种背景下,树突状细胞(dc)是感染的首选目标之一t . cruzi(25]。因为他们的有效抗原表达能力,DCs可以检测病原体和发起的有效响应通过级联触发事件的高潮在表示抗原的淋巴细胞和特定和保护性免疫反应的激活26]。在这个过程中,这些细胞被激活和直接宿主免疫反应取决于细胞因子的产生和存在的表面标记和强度描述他们的成熟27- - - - - -29日]。在抗原表示,这些细胞有高表达的分子标记如CD80、CD86和MHC (27,30.- - - - - -32]。此外,细胞迁移CCR7等标记,基本在这些细胞的迁移过程演示站点,表达(27,33]。此外,各种促炎细胞因子如il - 1β、il - 12、引发、TNF -α,il - 6合成和协助的形成一种特殊的免疫反应(27,34,35]。

的相互作用t . cruzi引发重要的表达细胞激活和抑制细胞成熟标志如CD80、CD86, MHC, CD40 [36]。此外,t . cruzi引起直流死亡标记称为PDL-1抑制促炎细胞因子的生产如白介素、肿瘤坏死因子-α,il - 6和il - 10等刺激抗炎细胞因子的合成和TGF -β针对耐受性配置文件哪里有不激活t . cruzi特殊T淋巴细胞(6,25,28,37,38]。这些寄生虫可以随免疫调节t . cruzi应变以及他们如何与这些细胞相互作用,强调DCs发展的关键作用的临床疾病的形式(6,7,37,39- - - - - -43]。尽管许多研究已经阐明的机制t . cruzi调节DCs,这些细胞之间的相互作用与墨西哥株尚未正确地调查。本研究旨在调查传染性,标准识别受体的表达和costimulatory分子和细胞因子的产生与墨西哥株DCs培养了解他们逃避宿主的免疫反应调节这些细胞。

2。材料和方法

2.1。寄生虫

两个菌株的t . cruzi来自墨西哥。他们在实验室维护联邦大学的寄生虫学Triangulo米内罗,UFTM。Ninoa应变(MHOM / MX / 1994)44)是来自动物接种诊断的患者急性恰加斯病,而INC5应变(MHOM / MX / 1994)45从Chagasic心肌病患者)是孤立的19,20.]。CL-Brener是巴西应变研究作为参考。这一毒株是孤立的Triatoma 5,属于联邦圣保罗大学的寄生虫学UNIFESP,请由半径标注。菅伸子吉田。寄生虫在28°C肝灌注培养胰蛋白示(点燃)与10%胎牛血清中补充。Metacyclic形式的文化在平稳增长阶段被列通过纯化deae纤维素(如前所述)(46]。

2.2。动物和分化骨骨髓来源的DCs (BMDCs)

雄性BALB / c和C57BL / 6(6 - 8周大)野生型小鼠培育和维护实验动物设施的联邦大学Triangulo米内罗,UFTM, Uberaba, MG,巴西,根据动物伦理委员会的指导方针(CEUA)使用。根据伦理委员会的所有实验动物的使用Triangulo米内罗的联邦大学。从股骨和胫骨骨髓细胞从老鼠离心机在400×10分钟8°C RPMI 1640介质(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。随后,2毫升的裂解缓冲了红细胞溶解,细胞被洗了三次计数。细胞在纽鲍尔室和resuspended数 细胞/毫升RPMI 1640中等的50 mM玫瑰(美国纽约Gibco,大岛),10%的灭活胎牛血清(美国Gibco), 2毫米谷酰胺(美国Gibco) 40毫克/毫升庆大霉素,12.5 ng / mL小鼠gm - csf (BD) 37°C在湿润的气氛中有5%的公司₂。3天,10毫升的RPMI介质包含12.5 ng / mL gm - csf是补充道。细胞进一步分化与gm - csf包含额外的4天完整的媒介。经过7天的文化,这些细胞被收集和分析通过流式细胞仪来确定的百分比CD11b CD11c,和进一步的实验之后才进行评估这个比例。所有文化提出了至少80%的CD11b⁺CD11c⁺DCs和骨骨髓来源树突状细胞(BMDCs)收获和培养96 -孔板。

2.3。在体外DCs的感染

经过7天的分化,BMDCs浓度 每口井的细胞培养板(96 -)250年μL 10%的RPMI 1640中孵化与三个不同的18 ht . cruzi菌株(CL-Brener Ninoa或INC5莫伊2:1)有或没有有限合伙人(5μg / mL)。寄生虫感染的细胞被评估使用4 ,6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐(DAPI;分子探针,尤金,俄勒冈州,美国)。表达mhc ii, CD80、CD86 TLR2和TLR4表面标记评估通过流式细胞术,和TNF -的生产αil - 10, IL-12p70 CCL-2, il - 6是通过测量仪珠数组。莫伊2:1被选中,是因为这个比例的细胞和寄生虫足以影响DC生物学的不同步骤或评估寄生传染性。

2.4。的决心t . cruziDCs来华的

BMDCs 96 -孔板进行了分析,用DAPI荧光显微镜。BMDCs分化从鼠标菌株和不同菌株的培养t . cruzi在4°C、收获和孵化与10 30分钟μM DAPI。细胞被洗两次与PBS和离心机400×在4°C 10分钟,立即分析evo细胞成像系统(美国热科学)×400放大。细胞内寄生虫的数量计入共计100个细胞,和感染细胞的比例,每100个细胞寄生虫,寄生虫感染细胞中负载。

2.5。流式细胞术分析

BMDCs分化从鼠标菌株进行了分析通过流式细胞术使用以下单克隆抗体:anti-CD11c, anti-MHC-II, anti-CD80, anti-CD86, anti-TLR2,或anti-TLR4,贴上APC, FITC、PE、或PECy7根据目的。此次收购获得了使用一个Accuri流式细胞分析仪(BD Immunocytometry系统),并使用FlowJo的分析软件。

2.6。仪珠阵列

仪珠阵列进行使用CBA鼠标炎症工具包(BD生物科学)根据制造商的指示,和下面的细胞因子测定:TNF -αil - 6、il - 10 IL-12p70,趋化因子CCL-2。短暂,上层清液的BMDCs C57BL / 6和BALB / c小鼠培养t . cruzi有或没有有限合伙人,孵化与珠子加上特定的单克隆抗体和PE-conjugated二级抗体4 h在室温下。珠子被清洗和收购都使用了Accuri流式细胞分析仪(BD Immunocytometry系统)。样品的浓度估计通过比较获得的PE荧光从标准曲线获得重组小鼠细胞因子的连续稀释。结果采用FCAP数组5-parameter逻辑回归分析软件和表达pg / mL。

2.7。统计分析

分析的结果GraphPad Prism 7.0 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。克鲁斯卡尔-沃利斯测试邓恩的事后测试进行数据的非高斯分布。酒吧图表显示均值和标准错误的意思。结果被认为是重要的值低于0.05 (5%)。

3所示。结果

3.1。评估不同菌株的传染性t . cruzi在DCs源自BALB / c和C57BL / 6小鼠

一般来说,不同的t . cruzi菌株能够感染DCs。然而,感染的比例取决于应变和DCs的起源6,7,37,47]。在BMDCs源自BALB / c小鼠,细胞感染了不同菌株的比例并没有表现出显著差异,尽管经历略有增加,当这些细胞被培养与有限合伙人(图1(一))。与之相反,当评估寄生虫的数量在100年总共BMDCs,我们发现细胞培养t . cruzi从Ninoa应变之前与LPS刺激表现出显著增加寄生虫的数量相比INC5应变加上有限合伙人( )(图1 (b))。相同的概要文件与Ninoa INC5菌株+ LPS被发现通过分析寄生虫的数量在每个受感染的细胞( )(图1 (c))。CL-Brener应变有限合伙人不治疗,每个被感染细胞的寄生虫数量明显高于INC5应变相比也没有LPS处理( )(图1 (c))。当BMDCs来源于C57BL / 6小鼠评估,感染细胞的百分比与CL-Brener文化后应变+ LPS呈现显著差异( )相比与INC5 BMDCs培养应变+有限合伙人(图1 (d))。每100个细胞寄生虫的数量有显著提高CL-Brener应变时相比INC5应变( )。相同的差异在发现传染性寄生虫的数量与CL-Brener BMDCs培养应变+有限合伙人与BMDCs培养Ninoa应变+有限合伙人( )(图1 (e))。同样的模式在寄生虫的数量每感染细胞比较Ninoa和CL-Brener菌株的影响( )(图1 (f))。在图1 (g),我们将展示一种代表DAPI标记的照片证明不同菌株的传染性t . cruzi在BMDCs在体外。

3.2。生产的细胞因子和趋化因子CCL-2 DCs与不同菌株的培养t . cruzi

细胞因子的浓度在BMDCs BALB / c小鼠没有显示显著差异的分析,无论他们只被感染的菌株或有限合伙人的存在。下列细胞因子水平测量:TNF -α、il - 6、IL-12p70 CCL-2和il - 10(数字2(一个)- - - - - -2 (e))。当我们分析了细胞因子在文化上层清液BMDCs来源于C57BL / 6小鼠,观察显著增加生产TNF -α与Ninoa BMDCs培养没有或+ LPS相比,文化没有压力t . cruzi感染( )(图3(一个))。此外,Ninoa应变诱导显著增加il - 10生产LPS-treated文化相比,有限合伙人单独和其他菌株加上有限合伙人( 有限合伙人, CL-Brener, INC5)(图3 (e))。我们并没有发现显著差异生产的il - 6(图3 (b)),IL-12p70(图3 (c)),和CCL-2(图3 (d))。

3.3。细胞因子和趋化因子CCL-2 DCs的变化与不同菌株的培养t . cruzi

为了演示如何不同T。cruzi菌株可以调节树突细胞产生细胞因子的能力,我们计算细胞因子的变化确定的比例增加或减少所产生的细胞因子t . cruziBMDCs来华之前处理有限合伙人和维护与有限合伙人(5只μg / mL)。在全球范围内,BMDCs之间的相互作用t . cruzi诱导肿瘤坏死因子-α,CCL-2 il - 6和il - 10增加和减少IL-12p70。细胞因子il - 6(图4 (b)显示显著的改变只在BMDCs源自BALB / c小鼠,显示细胞的减少刺激Ninoa应变相比,细胞刺激CL-Brener应变( )。另一方面,Ninoa应变诱导显著增加CCL-2相比CL-Brener BALB / c小鼠( )。il - 10也显示显著的变化对老鼠菌株,与Ninoa BMDCs培养菌株相比增加il - 10 BMDCs INC5菌株的培养BALB / c小鼠( )和比较INC5和C57BL / 6小鼠CL-Brener ( )。我们没有观察到任何重大变化的变化TNF -α(图4(一)(图)和IL-12p70之间的压力4 (c))。在数据4 (f)- - - - - -4(我),可以观察到的变化根据不同细胞因子的生产菌株有或没有的有限合伙人。

3.4。评估mhc ii, CD80、CD86在DCs TLR2和TLR4表达与不同菌株的培养t . cruzi

相关数据流式细胞术分析确定阳性细胞百分比的变化和变化表达式的每个细胞(平均荧光强度)。我们的结果指出t . cruzi墨西哥菌株显著降低细胞表达mhc ii, TLR2和TLR4与巴西应变CL-Brener相比。具体来说,交互与INC-5 Ninoa导致较低的mhc ii⁺BMDC在BALB / c ( )和C57BL / 6 ( )老鼠(图5(一个))。costimulatory分子CD80和CD86负面变化BMDCs培养与评估(数字5 (b)和5 (c))。对BALB / c和C57BL / 6, CL-Brener应变诱导TLR2的比例更高⁺相比BMDCs INC5应变( 和 ,分别)和Ninoa ( 和 ,分别,图5 (d))。以类似的方式,CL-Brener应变交互诱导TLR4的比例更高⁺BMDCs老鼠菌株相比INC5 ( BALB / c和C57BL / 6)和Ninoa菌株( 对BALB / c和C57BL / 6)(图5 (e))。

在这两种品系小鼠,INC5应变导致显著增加BMDC mhc ii表达式比CL-Brener应变( )和Ninoa ( )在BALB / c。有趣的是,在BALB / c小鼠CL-Brener菌株诱导mhc ii略有增加,在C57BL / 6小鼠,这个表达式被抑制,明显不同于INC5和Ninoa ( ,图6(一))。所有t . cruzi菌株诱导的抑制CD80鼠标株(图的表达式6 (b))。CD86,只有Ninoa诱导表达略有增加但没有统计学意义(图6 (c))。CL-Brener应变也引起相当大的增量在TLR2表达式鼠标菌株相比INC5和Ninoa菌株( BALB / c和 对C57BL / 6,图6 (d))。另一方面,CL-Brener毒株感染诱导TLR4的表达较低⁺BMDCs INC5和Ninoa菌株(相比 BALB / c和 对C57BL / 6,图6 (d))。雷达情节现在的摘要交互具有不同的影响t . cruzi菌株在LPS-stimulated BMDCs BALB / c(图6 (f))和C57BL / 6(图6 (g)老鼠)。

4所示。讨论

我们的研究旨在评估不同的传染性和免疫调节能力墨西哥株t . cruzi在DCs源自BALB / c和C57BL / 6小鼠。我们的结果指出,这些菌株的基础性作用在这些DCs的交互在体外coculture,根据鼠标血统。

的生物学行为,解剖的入侵途径,培养液,表面分子metacyclic形式的表达t . cruzi和宿主免疫反应因素密切相关的建立感染(6,9,48- - - - - -50]。我们的数据显示,这三个菌株感染DCs效率。然而,属于TcI的菌株基因型(AQ1.7 Mutum, G)给出了一个概要文件与低传染性BMDCs [6,51]。这可以用这一事实来解释t . cruzi提出了一种高种内遗传和表型多样性,特别是对于TcI基因型。因此,不同的遗传标记表明有一个intra-DTU遗传变异,TcI是呈现高的基因型遗传异质性。这可能与不同的流行病学特征和产生争议的传染性和致病性菌株属于这种基因集团(4,13,19,52]。

在瑞士小鼠接种时,寄生虫INC5和Ninoa菌株呈现专利寄生虫血症,高传染性和死亡率。强烈的组织观察寄生在几个实验动物的器官,增加这些菌株的毒力20.,52]。然而,trypomastigote形式被用于这些其他的研究17,20.,21]。值得注意的是,不同的进化形式的t . cruzi使用不同的策略在粘附或入侵细胞因为分子的特定阶段,影响传染性和致病性,即使在相同的应变(53,54]。寄生虫接种途径也会影响生物行为的应变,因为不同的生物屏障,这种寄生虫需要克服建立感染,直接影响免疫反应和主机电阻(50]。需要考虑的一个因素是细胞或组织的类型,metacyclic形成感染。Ninoa应变显示寄生虫血症和低死亡率和轻微的炎症过程时接种小鼠口服的同样的压力。在口腔感染、寄生虫进入胃上皮细胞,可以接受胃蛋白酶行动,和metacyclic trypomastigote形式表达表面分子可以促进或抑制这种入侵过程。最近的研究表明,TcI基因型有一个可怜的感染性口腔档案,为他们表达gp90表面,这个分子负调节入侵目标细胞(16,55]。

另一方面,符合我们目前的研究中,CL-Brener应变呈现出高度传染性概要文件在体外研究,其形象是研究口腔感染。解释了传染性的增加可能是糖蛋白gp82表示在其表面,促进寄生虫进入细胞通过胞内钙的动员9,11]。这些使用相同的菌株不同的结果表明,除了寄生虫遗传、感染细胞线和接触的寄生虫引起的免疫反应和细胞与感染有关。此外,细胞来源于C57B / 6和BALB / c小鼠出现不同程度的易感性和/或电阻(51]。我们的结果表明,Ninoa应变时更高的潜在传染性BMDCs与LPS激活,而CL-Brener应变更感染性BMDCs尚未激活。不同菌株显示明显的传染性势(6),这可以与这些细胞的识别能力的分子在表面的寄生虫(56]。此外,在BALB / c小鼠,我们观察到类似的所有菌株细胞相互作用,而在C57BL / 6 CL-Brener应变有更好的性能。这表明一个应变可以有不同的行为取决于所使用的小鼠,用Y所示实验应变(57]。

一旦感染细胞的能力来源于两种菌株被确认,我们分析了这些菌株的调节能力表面标记和刺激细胞因子的生产。我们观察到两株t . cruzi与血统的老鼠呈现不同的模式参数的评估。在BMDC BALB / c小鼠,Ninoa应变导致降低il - 6和il - 10的增加生产,而在C57BL / 6小鼠细胞因子的生产与一个巨大的增量在TNF -α和il - 10。细胞因子是最相关的因素在确定感染的过程中(17,51,58]。在感染的过程t . cruzi调制响应与易感性相关的疾病可以由寄生虫引起的。例如,在巨噬细胞感染t . cruzi,TLR薄弱的激活,导致减少促炎细胞因子的生产如il - 12 (59]。此外,il - 10和TGF -的生产β在被感染的巨噬细胞被刺激,这导致良好的应对寄生虫被触发(37,60,61年]。类似的结果在我们的研究中发现,Ninoa应变呈现更多的调节行为相比其他菌株在类似的情况下,特别是当细胞已经激活。根据Gil-Jaramillo et al。7),更致命的毒株可以操纵DCs生产更多耐受性细胞因子。

费雷拉et al。51)描述增加C57B1/6和BALB / c小鼠的il - 10水平在疾病的急性期。此外,BALB / c小鼠血清TGF -升高β水平,表明对疾病的易感性。促炎细胞因子TNF -α干扰素-γ,il - 1β2,IL-5, il - 6在感染期间也表现出高水平的表达,表明感染的细胞因子之间的平衡决定了课程。在DCs源自BALB / c小鼠,我们观察到,没有细胞因子表达表现出极大的峰值;然而,在C57BL / 6、il - 10和TNF -α被Ninoa强刺激的压力。其他细胞因子水平没有变化。分析BALB / c动物的血清感染Ninoa应变,,埃斯皮诺萨等人的研究表明,增加il - 10的水平在急性期,衰变和逐渐上升的过程中感染。白介素,达到顶峰的急性期和维持整个慢性阶段,也是评估(17]。

通常形成一个跨膜蛋白家族负责的分子模式的识别重要的触发免疫反应(62年- - - - - -64年]。几个表面分子t . cruzi是被这些受体。有些trypomastigotes分子被TLR2 [65年,66年),和其他分子出现在epimastigotes被TLR4 (67年]。承认的关系t . cruzi这些受体和敏感或耐药发展的免疫反应已经进行了广泛的调查。TLR2 TLR4、TLR7和TLR9识别是重要的发展机制t . cruzi感染(64年]。寄生形式测试在我们的研究中使用的所有菌株metacyclic,一样的自然感染在矢量传输中,我们观察到一个更好的表达在细胞TLR2属于TcVI CL-Brener菌株感染的关系属于TcI INC5应变和更好地表达TLR4与Ninoa TcI组。相似的研究使用其他菌株显示菌株属于TcI组能够改善TLR2表达式,而TLR4的减少⁺是证明TcII组(6]。TLR2的增加可以逃避宿主防御能力相关细胞因子通过改变生产,有利于TLR2-dependent il - 10的生产,如其他微生物感染的(6,51,59,67年,68年]。虽然这株没有与其他人相比,突出了il - 10的生产TLR2通路可能观察到的生产负责。TLR4可能引发细胞因子的生产如白介素、干扰素-γ肿瘤坏死因子-α,一氧化氮(NO)t . cruzi感染(67年,69年),导致更好的响应。我们的数据表明,更多的TLR4 CL-Brener应变礼物⁺DCs,虽然不会显示明显的表达式对这些资料的细胞因子。

成熟的能力和表达抗原的dc是受寄生虫的存在。这次的损坏是由于等重要分子MHC的调制,CD80、CD40,和CD86的水平减少在寄生虫的存在6,25,28,37,38]。只有INC5应变诱导大量的mhc ii。一般来说,这个分子负责抗原的成功表示和有效的特异性免疫反应,组装包括抗体的产生(27,30.- - - - - -32]。这是符合恩里克et al .,显示的数据表明最致命的毒株Ninoa INC5,哥伦比亚诱导高生产的抗体。costimulatory分子CD80和CD86也成熟和演讲能力相关的抗原27,30.- - - - - -32,52]。菌株的研究提出了一个负面变化CD80和CD86 BMDCs来源于两个鼠标血统,暗示这些感染细胞的成熟的困难。类似的结果是观察脾DCs感染特豪德培克开始紧张,减少在CD86表达阻止这些抗原递呈细胞器官的迁移47]。这是一个好的寄生虫逃避宿主防御战略。

metacyclic形式是感染的传播形式t . cruzi,第一次发现感染后DCs细胞。然而,许多研究这些细胞没有使用这种感染性形式执行(6]。因此,数据集的评价让我们观察的情况下,可以模仿这与宿主相互作用过程的过程中都发生了什么。通过使用的t . cruzi和不同的老鼠,我们能够进一步扩大观察,并得出结论,这两个墨西哥株研究调制DCs的反应的能力,不管他们的起源,通过不同的途径。结果加强逃避宿主免疫反应的策略和演示的重要性调查参与这个过程的机制。

数据可用性

在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

导致这些结果的研究得到了支持和资助慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府,Fundacao德帕罗尽管做Estado de米纳斯吉拉斯(FAPEMIG) Coordenacao de Aperfeicoamento de Pessoal de含量比(披肩),为传染病研究和网络。