文摘
目的。调查的频率和激活状态的外围血浆DCs(髓)和骨髓DCs (mdc)以及胃粘膜的直流子集分配幽门螺杆菌- (幽门螺旋杆菌-)感染和未感染孩子。材料和方法。36个孩子进行了研究;21岁了幽门螺旋杆菌。循环的频率pDCs(血统- - - - - -HLA-DR+CD123+)和mdc(血统- - - - - -HLA-DR+CD11c+)和激活状态(CD83、CD86和HLA-DR表达式)通过流式细胞术进行评估。此外,CD11c的密度+,CD123+、CD83+,CD86+,LAMP3+胃粘膜细胞免疫组织化学测定。结果。循环CD83的频率+mdc是高幽门螺旋杆菌来华的孩子比未感染控制。pDCs证明调节HLA-DR表面表达,但没有CD86表达的变化。此外,胃固有层的密度CD11c+提高了细胞和上皮细胞的髓。有一个重要的循环CD83频率之间的联系+mDC和胃固有层mDC渗透。结论。这项研究表明,虽然幽门螺旋杆菌来华的儿童人口的增加成熟mDCs轴承CD83外周血,他们缺乏成熟CD83+mdc在胃粘膜,促进宽容本地抗原而不是免疫力。此外,这可能会降低过度的炎症活动作为儿童比成人的报道。
1。介绍
幽门螺杆菌(幽门螺旋杆菌)在人类胃。感染通常开始于童年早期,可以持续几十年,有时甚至是一生的(1]。幽门螺旋杆菌儿童发展来华的胃粘膜炎症(2与低得多),但多形核和单核细胞的渗透,减少胃和十二指肠溃疡的发病率,胃腺癌和胃mucosa-associated淋巴组织(麦芽)淋巴瘤与成年人相比3,4]。
树突状细胞(dc)是专业的抗原呈递细胞(apc),诱导T细胞反应呈现抗原。迁徙的抗原摄取区域淋巴结和随后的成熟类型的配置文件决定随后的自适应抗感染免疫反应概要(防护或nonprotective反应)。DC成熟过程与表达相关的几个膜分子从事DC迁移(CCR7)抗原表达能力(MHC II级),和其costimulatory活动(CD80、CD83、CD86) (5,6]。
人类DCs是罕见的在外周血7),包括两个主要的子集,骨髓DCs (mdc)和血浆DCs(髓样)8]。CD11c等mDCs髓系抗原表达,可以分为CD1c和CD141-bearing细胞。pDCs缺乏这些标记,而是表达CD123 CD303, CD304分子。mDC和pDC子集显示APC的能力,但这个函数是减少pDCs,相对较低的表达HLA-DR [9]。能够很好的证明,pDCs促进代的调节性T细胞亚群)[10]。
循环DC数量及其激活状态可能会改变的过程中感染(11,12和可能改变整个一生13]。这些细胞起着重要的作用在塑造抗感染的反应,不断完成tissue-residing DCs的人口。
DCs之间的相互作用幽门螺杆菌体外诱发DC成熟和释放促炎细胞因子il - 6等引发,白介素,IL-23 [14- - - - - -21]。然而,DC细胞因子的生产概况和强烈依赖于T细胞反应模式幽门螺旋杆菌结构(22]。DCs表达CD11c+(18,23,24],semi-mature DCs轴承树突cell-lysosome-associated膜糖蛋白(dc灯具或LAMP3)和DCs HLA-DR高但小CD80、CD83、CD86表达(25,26)被发现在接近和淋巴滤泡,连同FoxP3 T细胞幽门螺旋杆菌来华的胃粘膜的成年人(26]。
与许多研究有关直流参与幽门螺旋杆菌全身免疫反应在成人(23,24,26- - - - - -30.),类似的儿童仍然罕见(31日]。此外,估计频率的mdc和pDCs CD83和表达水平,CD86和HLA-DR外围尚未评估在直流子集幽门螺旋杆菌来华的孩子。还有一个缺乏信息的表达谱人类DC成熟标记(LAMP3和CD83),骨髓细胞标记(CD11c)和pDC (CD123)胃粘膜的标志幽门螺旋杆菌来华的孩子。因此,本研究的目的是(a)调查周边的分布和激活状态,胃粘膜直流子集(pDCs, mdc)幽门螺旋杆菌来华的和未感染的儿童和(b)评估DC表型特征子集和活动之间的相关性分数的基础上更新的悉尼胃炎分类系统。
2。材料和方法
2.1。道德声明
研究是根据赫尔辛基宣言与伦理委员会批准,执行管理委员会Medicum Nicolaus台灯的哥白尼大学获得了波兰和知情同意从所有病人的家长和患者年龄超过16年血液和窦的活检前集合。
2.2。病人
总共36个学科有消化不良的症状,比11岁,被纳入本研究。排除标准包括以下:(1)抗生素使用的历史在4周因其他原因幽门螺旋杆菌感染;(2)其他炎症性疾病,如腹腔疾病,炎症性肠病,或过敏;和(3)胃穿孔或出血,手术史,出血情况,或其他临床条件或肠道寄生虫的证据。每一个主题或主题的父母提供了临床历史。
所有的孩子都与胃十二指肠内镜检查是由于长期腹痛。基于先前的观察幽门螺旋杆菌语料库的相关胃炎是目前只有当窦的胃炎在场(32),三个窦的活检被从每个病人。一个活检标本受到快速尿素酶试验。使用第二个标本进行组织学分析。最后标本进行免疫组织化学染色。
脲酶试验在每个病人身上进行的。此外,幽门螺旋杆菌感染被排除在每个主题使用的13C尿素呼气试验,完成一周内进行内窥镜检查。13C浓度测定的红外辐射分析仪(奥林巴斯Fanci2、东京、日本),假设4‰作为截止点。
一个病人被认为是幽门螺旋杆菌来华的时13C尿素呼气试验和快速尿素酶试验或微观评估是积极的幽门螺旋杆菌。一个病人被认为是未感染当所有三个测试都是消极的。21例患者被发现幽门螺旋杆菌积极,同时为负15病人满意的标准幽门螺旋杆菌的地位。所有的患者溃疡疾病或宏观损伤十二指肠粘膜的内镜检查。
这项研究是在进行的幽门螺旋杆菌来华的和未感染的儿童和青少年。未感染的儿童(控制)由7名男孩和8名女孩(平均年龄15年,11到18门年)。集团幽门螺旋杆菌来华的孩子由9个男生和12个女生公认的胃炎幽门螺旋杆菌感染(中位年龄15年,范围12 - 18岁)。没有一个病人有其他炎症性疾病或癌症。
2.3。组织学评估
石蜡标本是formalin-fixed和嵌入式,切片,苏木精和伊红染色组织学分析,灰色或染色改性染色幽门螺旋杆菌检测。活检标本是由两个独立的病理学家基于分级为胃炎悉尼更新系统。
组织学变量(存在和单核和多形核的细胞密度、腺粘膜萎缩,肠上皮化生,和幽门螺旋杆菌)是在四点量表得分:0,没有;1、温和;2、温和;3,明显。
2.4。流式细胞术分析
在内窥镜检查,5毫升静脉血是免疫测试。总DCs的频率(tDCs)、mdc和髓样,以及表达CD83、CD86,和HLA-DR测定全血样品中使用一个五色流式细胞术方法。我们跟着Helmin-Basa等的方法。33]。首先,两管包含200μL全血和FITC染色Lin-1血统鸡尾酒(人类CD3抗体,CD14、CD16 CD19, CD20,和CD56), PerCP-anti-human HLA-DR, APC-anti-human CD83、PE-Cy7-anti-human CD86, PE-anti-human CD11c,或PE-anti-human CD123 (BD生物科学,富兰克林湖人,新泽西,美国)抗体在室温下30分钟(RT)。BD生物科学的红细胞被使用流式细胞仪赖氨酸溶液(BD生物科学)。彩色白细胞是悬浮在磷酸盐(PBS)和分析立即与流式细胞术(FACSCanto II, BD生物科学)。仪器使用成立BD血细胞计数器设置和跟踪珠子。执行数据采集使用BD FACSDiva软件,6.1.3 (BD生物科学)和分析用7.5.5 FlowJo(树明星Inc .,亚什兰,俄勒冈州,美国)。补偿与一组设置进行补偿管使用BD CompBead antibody-capturing粒子和补偿与BD FACSDiva软件安装工具。
荧光- 1 (FMO)是用于控制(图1)。控制策略应用在两个独立的直流子集枚举管如图2。紧身衣和骨料被选择单线态细胞避免向前散射:FSC(地区)/ FSC(高度)。逻辑门是用于识别tDC, mDC和pDC人群。tDCs被定义为Lin1- - - - - -HLA-DR+、mdc被定义为Lin-1−HLA-DR+CD11c+细胞,髓则定义为Lin-1−HLA-DR+CD123+细胞。几何平均荧光强度(gMFI)决心量化细胞表面活化分子的表达。统计分析是基于至少5000事件的mdc, 2500事件的髓。
2.5。免疫组织化学
免疫组织化学研究进行存档formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)组织部分交付给临床Pathomorphology部门执行管理委员会Medicum台灯,Nicolaus哥白尼在托伦大学。
FFPE组织部分削减在手动旋转切片机(美国托兰斯AccuCut,樱花)。石蜡切片(4μ米)准备和安装额外的胶粘剂幻灯片(SuperFrost +门泽尔格拉瑟,布伦瑞克,德国)。
免疫组织化学染色法是根据执行先前描述的程序(34,35)和标准化使用一系列积极和消极控制反应。积极的控制反应进行模型选择组织根据参考来源(人类的蛋白质图谱,http://www.proteinatlas.org)[36)和抗体数表。负控制反应进行额外的组织部分,用主要的抗体溶液1%牛血清白蛋白(BSA)在PBS稀释。
Deparaffinization、补液和抗原进行了检索通过加热部分抗原决定基检索解决方案在95 - 98°C减20分钟(美国圣克拉拉Dako,安捷伦科技)在PT-Link (Dako,安捷伦科技)。随后,内源性过氧化物酶活性被使用3%的H2O215分钟在RT和非特异性结合的解决方案被使用5% BSA溶液进行15分钟在RT,孵化主要抗体,anti-LAMP3(1: 400稀释,兔多克隆),anti-CD11c(1: 1000稀释,兔单克隆)anti-CD123 (IL-3RA, 1: 200稀释,兔多克隆),anti-CD83(1: 100稀释,鼠单克隆)和anti-CD86(1: 50稀释,兔单克隆)(都来自Abcam,英国剑桥大学),在4°C 16小时。抗体检测到复杂的使用Flex Anti-Mouse设想/兔子HRP-Labeled聚合物(Dako,安捷伦科技)和局部使用3 - 3diaminobenzidine (DAB)作为发色体。最后,组织部分在苏木精复染色,随后脱水,澄清了在一系列的二甲苯洗,盖玻片应用使用安装介质(Dako,安捷伦科技)。
2.5.1。评估基于免疫组织化学染色的蛋白表达
蛋白表达的评价获得的腔面积FFPE组织部分进行20和40 x原始目标的放大,使用ECLIPSE竞走(尼康仪器欧洲,荷兰阿姆斯特丹)光学显微镜。
评估的表达,免疫组织化学反应是根据得分的形态学原理基于Remmele-Stegner规模(IRS-Index Remmele-Stegner;免疫反应性的分数)37),用于我们的以前的出版物(34,38]。
免疫反应性总得分是根据定义的规模从年级获得强度乘以积极染色细胞给的分数总分从0到12。染色的强度是得分如下:0,阴性;1,低染色;2、适度染色;3、很强的染色。阳性细胞的数量分类如下:(1)在胃固有层:0-negative, 1 - 1到5阳性细胞,2 - 6到10阳性细胞,3-11 50阳性细胞和4-51 100阳性细胞,和(2)在上皮粘膜:0-negative, 1 - 1到20阳性细胞,2-21 50阳性细胞,3-51 80阳性细胞,4 - 81 - 100阳性的细胞。
2.6。统计分析
所有的数据都表示为中位数与第一和第三个四分位数。使用Mann-Whitney结果进行了比较测试STATISTICA 12计算软件(StatSoft)。为正态分布的变量进行了分析使用Kolmogorov-Smirnov测试与Lilliefors修正。年龄和胃炎症分数与直流的频率及其使用斯皮尔曼等级相关的子集。被认为是在统计意义 。
3所示。结果
3.1。胃粘膜组织学
窦的胃炎的强度和活动中更大幽门螺旋杆菌来华的孩子( 和 ,分别)相比幽门螺旋杆菌未感染的(表1)。有趣的是,三个孩子幽门螺旋杆菌腔感染了轻微的胃粘膜萎缩。但是,没有肠上皮化生的儿童胃粘膜。
3.2。循环tDCs的分布、mdc和髓样和他们的激活状态幽门螺旋杆菌来华的和未感染的孩子
tDCs的百分比、mdc和髓两组(数据之间的相似3(一个)- - - - - -3 (c))。虽然CD83表达tDCs和mdc的百分比明显走高幽门螺旋杆菌来华的儿童(0.74%和0.40%, 和分别为0.92%和0.62%, ),没有显著差异的百分比CD83-positive pDCs这两组之间。CD86表达tDCs的百分比,mdc和髓相似幽门螺旋杆菌来华的和未感染的孩子(数字3(一个)- - - - - -3 (c))( )。
(一)
(b)
(c)
表面密度增加HLA-DR tDCs pDCs被发现幽门螺旋杆菌来华的孩子与未感染控制(296.10和247.51, 和278.28和204.89, )(图4(一)和4 (c))。没有统计上显著的差异在CD83、CD86表达两组( )(数据4(一)- - - - - -4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.3。CD11c的密度+,CD123+、CD83+,CD86+,LAMP3+胃粘膜的细胞幽门螺旋杆菌来华的和未感染的孩子
以确定的影响幽门螺旋杆菌感染免疫系统在本地,胃粘膜部分是用以下标记抗体:anti-CD11c (mDCs高表达,但粒细胞、巨噬细胞、B细胞的一个子集),CD123(髓的标志),CD83和LAMP3 (DCs)成熟的标志,和CD86 (costimulatory分子调节激活DCs和其他装甲运兵车)。
CD11c-positive细胞的积累显著增加胃粘膜固有层中指出幽门螺旋杆菌来华的孩子( )(数据5(一个)和5 (b))。CD83没有显著区别+,CD86+,CD123+细胞幽门螺旋杆菌来华的和未感染的孩子( )。然而,数据显示CD123密度增加的倾向+DCs的胃粘膜上皮幽门螺旋杆菌来华的儿童(数据5(一个)- - - - - -5 (c))( )。此外,我们使用免疫组织化学检测LAMP3+细胞腔。我们观察这些细胞只有在粘膜上皮的六个孩子幽门螺旋杆菌感染和未感染儿童(图25(一个)和5 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.4。相关分析
评估是否幽门螺旋杆菌相关胃炎影响直流频率是否这些值更多取决于年龄,我们相关的年龄,胃炎症幽门螺旋杆菌密度与循环和胃直流频率分数。
有一个年龄和tDC之间弱逆频率( , ),争取民主变革运动但没有年龄对频率的影响( , )和pDC ( , )观察子集(图6(一))。然而,我们没有观察到任何年龄和密度之间的相关性的胃DCs ( )。
(一)
(b)
循环tDCs之间没有明显联系的频率,他们的子集(mdc和髓样),胃炎强度(单核细胞浸润),它的活动(多形核细胞浸润),幽门螺旋杆菌密度( )。此外,胃之间没有相关性指出DCs频率,胃炎症评分幽门螺旋杆菌密度( )。
只有一个温和的循环CD83频率之间存在正向关系+mdc和密度的胃固有层CD11c+细胞( 和 ,)(图6 (b))。
4所示。讨论
我们这里描述的外围的直流子集分配(mdc和髓样)和他们的成熟状态(表达CD83、CD86和HLA-DR)幽门螺旋杆菌来华的和未感染孩子。此外,CD11c的密度+(mdc), CD123+(髓)、CD83+或LAMP3+(成熟dc)和CD86+(激活)胃粘膜细胞免疫组织化学测定。类似于其他的研究幽门螺旋杆菌感染,未感染患者(对照组由消化不良的,39,40),因为gastroduoendoscopy不是视为一种道德程序noncomplaining科目。
幽门螺旋杆菌来华的儿童表现出(1)循环CD83比例增加+mdc但与正常CD86的表达和HLA-DR, (2) upregulation HLA-DR表达但不变CD83、CD86的表达pDCs子集,(3)CD11c密度的增加+细胞在固有层和CD123+上皮细胞,(4)一个重要的循环CD83频率之间的联系+mdc和固有层浸润CD11c+DCs。
胃粘膜,最初并没有组织和弥漫性淋巴组织,获得MALT-like结构与毛囊和生发中心联系幽门螺旋杆菌(41]。幽门螺旋杆菌儿童感染与更高的积累包含CD4淋巴滤泡+T细胞、B细胞和DCs (42)在胃粘膜固有层,由宏观上明显的结节状态。
幽门螺旋杆菌细菌附着在胃上皮和接触胃上皮细胞和牙龈固有层DCs(直接或间接),而迅速增加幽门螺旋杆菌-感染的粘膜而未受感染的粘膜(18,23,24]。DCs装满幽门螺旋杆菌可能会迁移到胃淋巴滤泡或排水拟消化淋巴结幽门螺旋杆菌抗原,天真的CD4+T细胞(43,44),从而启动和调节宿主幽门螺旋杆菌-特定的免疫反应。
三个循环DCs存在的子集:CD123+髓和CD11c的两种类型+mDCs: CD1c+与CD11c mDCs低和CD141+与CD11c mDCs高(8]。由于DCs是罕见的在人类外周血(7),我们专注于(a)的枚举两个主要的直流子集(CD11c+mdc和CD123+髓样)和(b)这些DC表型之间的相关性的估计,幽门螺旋杆菌全身的炎症和幽门螺旋杆菌密度分数,根据更新后的悉尼的胃炎的分类体系。此外,我们使用免疫组织化学评估的直流子集分配窦的活检标本。
循环直流子集的分布幽门螺旋杆菌来华的病人以前尚未评估,据我们所知,这是第一次研究证明增加CD83百分比+mDCs,但没有显著差异的表面表达激活标记(CD86和HLA-DR)。终末分化DCs应该诱导CD83-specific成熟标记和增加CD86的表达和HLA-DR costimulatory分子。因此,增加的频率CD83-expressing mdc的缺乏upregulation CD86和mDCs HLA-DR分子可能表明循环mdc的成熟状态幽门螺旋杆菌来华的孩子改变了但只在mDCs的一小部分。然而,其余的循环mDCs仍表示不成熟/耐受性表型(HLA-DR低CD86低)。
外周血不是最好的学习来源DC成熟状态的过程中幽门螺旋杆菌感染;因此,我们也研究了胃上皮和固有层分布及其成熟的直流子集标记。
我们观察到高水平的CD11c-positive细胞和倾向增加密度CD83-positive胃固有层的细胞幽门螺旋杆菌来华的孩子。CD11c是DCs的骨髓来源的标记(mdc)强大的装甲运兵车,可以激活T细胞。CD83更选择性标记,目前成熟的dc。因此,我们使用CD11c CD83抗原检测mdc和成熟的DCs在胃粘膜。
CD11c+mDCs可以招募从血液作为回应幽门螺旋杆菌感染,但我们不能观察循环频率之间的任何协会mDC和胃粘膜mDC密度。然而,我们注意到联系的频率循环成熟CD83-bearing mDC和胃mDC密度。mdc的胃固有层的积累幽门螺旋杆菌来华的患者对于安装是必要的适应性免疫反应需要高效的细菌清除率。增加mDCs但不是CD83-positive DCs的数量幽门螺旋杆菌来华的胃粘膜固有层可以表明幽门螺旋杆菌儿童感染可能与当地相关积累成熟mdc(缺乏CD83-expressing DCs)。这些细胞的存在可能会发起低保护性免疫反应幽门螺旋杆菌。
我们有过小活检部分评估其他激活标记表达式(HLA-DR和CD80)。相反,我们的研究更具体的表达像LAMP3 DC成熟标志。我们不能检测LAMP3+细胞免疫组织化学的胃固有层。然而,在六幽门螺旋杆菌来华的孩子,我们观察这些细胞在粘膜上皮。没有这个标记在未成熟dc但迅速提高DCs激活(45),所以我们的结果可能表明,一些幽门螺旋杆菌来华的孩子有少量激活DCs在胃上皮细胞。在幽门螺旋杆菌来华的成年人,dc灯具+细胞也观察到但他们只位于胃固有层(26]。
不成熟的人类DCs结构上表达中间CD86和缺乏CD80、CD83和dc灯具45]。CD80只诱导成熟dc而CD86已经出现在未成熟的细胞,进一步调节在刺激(46]。终末分化DCs诱导特定的成熟标志包括CD83和dc灯具。最近的研究在成人还显示HLA-DR-positive[人口增加23],DC-SIGN-positive [26),或与semimature表型(CD83 DC-LAMP-positive DCs+,CD80- - - - - -CD86低)[23,26在胃固有层淋巴滤泡的幽门螺旋杆菌来华的人胃黏膜,这些细胞被滤泡FoxP3在同一位置+亚[26]。CD11c-bearing mdc的存在但不成熟dc表达CD83或LAMP3分子在小儿胃固有层可能促进本地抗原宽容而不是免疫力。未成熟dc和其他不成熟的装甲运兵车的存在可能会增加幽门螺旋杆菌胃粘膜的密度。另一方面,它也可以是有益的,因为它可以减少过度炎症活动负责胃溃疡癌变前的一些人的胃损伤。缺乏成熟的DCs在小儿胃粘膜也可以解释较低的局部炎性反应幽门螺旋杆菌儿童比成人感染(47]。
我们的研究也证明倾向于增加的密度CD123——(髓的标志)阳性细胞在胃上皮细胞与正常对照组相比。这个pDC子集可能山保护和耐受性免疫反应(48和能引起Treg分化49]。在成人之前的研究表明,胃CD303-expressing直流(其他的标志pDCs)细胞在同时出现在一个非常低的数字幽门螺旋杆菌来华的和未受感染的个人和组之间没有显著差异。因此,pDCs的网站的存在幽门螺旋杆菌感染(胃上皮细胞)可能发起低保护性免疫反应幽门螺旋杆菌经常观察到。
5。结论
这项研究表明,虽然幽门螺旋杆菌来华的儿童人口的增加成熟mDCs轴承CD83外周血,他们缺乏成熟CD83+mdc在胃粘膜,促进宽容本地抗原而不是免疫力。此外,这可能会降低过度的炎症活动作为儿童比成人的报道。
数据可用性
使用的所有数据来支持本研究的结果包括在本文中。
信息披露
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的利益冲突
没有对任何作者的利益冲突。