文摘

树突状细胞(dc)是专业的抗原递呈细胞有助于调节淋巴细胞免疫反应。DCs分为两个亚型:CD11c-positive传统或骨髓(疾控中心)和CD123-positive血浆髓DCs。这项研究的目的是评估DCs (HLA-DR +血统)及其亚型的流式细胞术在外周血和皮下(坐)和心外膜脂肪组织(吃)在主题(2型糖尿病, )和没有(non-T2DM )2型糖尿病择期心脏手术。主题与2型糖尿病有更高的空腹血糖( 与5 , )和糖化血红蛋白( vs。 , )和倾向于更有明显炎症(hsCRP: vs。 , )没有受试者相比,2型糖尿病。2型糖尿病与减少总坐在DCs ( vs。 2型糖尿病与non-T2DM, )类似,尽管微不足道,趋势吃( vs。 2型糖尿病与non-T2DM, )。在分析直流子集时,在疾病预防控制中心是没有区别的研究团体或脂肪组织池。相比之下,pDCs两坐(增加 vs。 DC细胞, )和吃( vs。 直流, )2型糖尿病相对于non-T2DM科目以及吃的2型糖尿病组与相应的SAT ( vs。 直流, )。肥胖和冠状动脉疾病(CAD)显著影响的总数量,疾控中心,或者pDC坐或吃根据多元回归分析。总之,2型糖尿病总树突状细胞的数量减少皮下脂肪组织和血浆树突细胞在皮下和增加更多的心外膜脂肪组织。这些发现表明髓的潜在作用T2DM-associated脂肪组织慢性炎症的发展。

1。介绍

树突状细胞(dc)是专业的抗原递呈细胞能够抑制或煽动免疫反应和天然免疫与适应性免疫的桥梁1]。根据损伤或激活其信号,不成熟的DCs进行成熟过程的特点是表面抗原和细胞因子的表达重要的启动和激活的幼稚T细胞和适应性免疫反应的起始2]。此外,DCs中也扮演着重要的角色在维持免疫耐受3]。两个主要亚型的DCs承认根据形态学和细胞标记表达式:CD11c-positive传统或骨髓DCs (cdc)参与CD4 + T辅助(Th)细胞的分化和CD123-positive血浆DCs(髓)以I型干扰素的生产,激活巨噬细胞,抗病毒防御(2,4,5]。除了典型的淋巴器官,如脾和淋巴结,这两种类型是经常发现在一个广泛的nonlymphoid组织包括脂肪组织(在),在那里他们已经隐含在代谢炎症的发展2,6,7]。

慢性低度炎症的特点是增加免疫细胞的积累,特别是巨噬细胞和T淋巴细胞,在脂肪组织的一个主要机制将肥胖与胰岛素抵抗、2型糖尿病(T2DM)病人体内,和动脉粥样硬化8]。DCs与他们的能力来影响T细胞和巨噬细胞都被认为是潜在的发起者其他免疫细胞的招募;然而,他们的作用在调节炎症似乎依赖于实际的脂肪组织的代谢状态。在精益动物疾病预防控制中心被证明促进抗炎州和延缓obesity-induced慢性炎症和胰岛素抵抗的发生(9]。相比之下,长期营养过剩引起的促炎的表现型导致激活开关Th1和Th17反应(10,11]。DCs的存在也是必不可少的,巨噬细胞招聘和激活,在直流和高脂肪饮食增加本地内容在小鼠模型12,13]。同样,在人类,DCs显示正相关与BMI在皮下脂肪组织(坐)10]。

尽管新兴脂肪组织DCs数据,对DCs的存在除了皮下和腹部内脏脂肪组织仓库。心外膜脂肪组织(吃)与冠状动脉附近最近强调作为一个重要的球员在冠状动脉疾病的发展14]。到目前为止,只有一个试验研究急性冠脉综合征小鼠模型已经评估了DCs在吃饭,没有数据在人类15]。此外,充分发展糖尿病对脂肪组织的影响直流计数和表型迄今为止没有解决。为此,我们进行了流式细胞术分析DCs及其亚型的外周血和皮下和心外膜脂肪组织的主题,没有2型糖尿病择期心脏手术。

2。方法

2.1。研究对象

十七岁的受试者没有二型糖尿病2型糖尿病和12个科目,所有择期心脏手术(冠状动脉搭桥植入和/或瓣膜手术),被列入研究。冠状动脉疾病的诊断建立了那些将要动手术coronarography。2型糖尿病的治疗包括二甲双胍(9主题),dipeptidylpeptidase-4抑制剂(3科目),磺酰脲类衍生物(2科目),与多个每天注射胰岛素治疗(1)主题。签署书面知情同意是由每个主题包含之前,和研究人类伦理审查委员会批准,第一医学院和一般大学医院,布拉格,捷克共和国。这项研究是执行符合赫尔辛基宣言的原则就像2008年的修订。

2.2。血液和脂肪组织抽样

血液样本被通宵禁食后开始手术。样品在1000 x g离心10分钟后30分钟内撤离。血清或血浆整除随后被储存在-80°C。

类似地,1 - 2克坐在那里吃得到初胸骨切开术后立即手术。吃来自前室间沟或心脏的右边缘,从胸骨切开术,坐了网站。采集的新鲜标本在PBS缓冲(0.01 M PBS, pH值7.4)是用于流式细胞术,和整除RNAlater®方案(Ambion®——表达载体,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)都存储在-80°C,随后用于测定mRNA的表达。样本进行免疫组织化学立即固定在4%甲醛和进一步处理。

2.3。激素和生化分析

血清细胞因子水平进行多路测量分析MILIPLEX®映射人类细胞因子/趋化因子磁珠面板(默克公司,达姆施塔特,德国)。灵敏度干扰素-γ0.8 pg / ml, il - 6 0.9 pg / ml,引发0.4 pg / ml,和TNF -α0.7 pg / ml。为所有内部和interassay可变性分析物在15.0%和5.0之间。血清高敏c反应蛋白(hsCRP)水平衡量高灵敏度酶联免疫试剂盒(Bender MedSystems,维也纳,奥地利)3 pg / ml的敏感性。胰岛素水平是衡量RIA工具(CIS生物国际、温度、法国)。灵敏度是2.0μ国际单位/毫升。为所有内部和interassay可变性分析在10.0%和5.0之间。

生化参数测量、计算和低密度脂蛋白胆固醇的医学生物化学和实验室诊断,一般大学医院,布拉格,捷克共和国,通过标准的实验室方法。

2.4。隔离间质血管分数从脂肪组织和流式细胞术

标准0.5 -1.0克的脂肪组织与无菌剪刀绞,可见血管被移除。样本用PBS,消化0.01%胶原酶(胶原酶从histolyticum梭状芽胞杆菌,圣路易斯,密苏里州,美国)为30分钟37°C,和离心机12分钟1200 x g。可见脂肪细胞被手动收集与后续重复洗涤剂和表面通过吸管从上层清液去除剩余的脂肪细胞。最后,样本过滤猎鹰®40μm细胞过滤器(Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,美国)消除残余脂肪细胞。流式细胞仪进行使用新鲜分离和过滤基质血管分数或EDTA全血。总金额是100μl细胞悬液平均10⁶单元格内容与FITC标记的单克隆抗体共轭(异硫氰酸荧光素),PE(藻红蛋白),PerCP (peridinin-chlorophyll蛋白质复杂),和APC (allophycocyanin)。标签商业家族鸡尾酒(CD3 / CD14 / CD16 / CD19 / CD20 / CD56) FITC和single-labelled抗体CD11c PE、HLA-DR PerCP,和CD123 APC (Exbio布拉格,其子as。、Vestec捷克共和国)。样本标记为30分钟在黑暗中2 - 8°C,然后红细胞溶解使用Excellyse我(Exbio布拉格,其子as。、Vestec捷克共和国)根据制造商的指示。最后,标记细胞分析了BD Accuri™C6 (Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)。数据分析使用FlowJo X 10.0.7r2软件(LCC FlowJo,亚什兰,或者,美国)。控制策略如下:紧身衣被排除在外,树突细胞是封闭的根据HLA-DR积极性和血统鸡尾酒消极,然后CD11c-positive CD123-positive细胞(图评估1)。HLA-DR +血统DC细胞百分数表示单个细胞及其亚型的表达HLA-DR +血统- DCs的百分比来确定直流成分。收购事件的最小的数是100000。

2.5。统计分析

执行统计分析和图形绘制使用SigmaPlot 13.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。结果表示为 平均误差(SEM)。未配对的 - - - - - -测试或Mann-Whitney秩和检验和配对 - - - - - -测试或Wilcoxon符号秩检验被用于组与组之间的差异,评估是适当的。斯皮尔曼和皮尔逊相关测试是用来评估DCs之间的关系和其他测量参数。多元线性回归是用来评估的影响2型糖尿病,肥胖和冠状动脉疾病组织的DCs的存在。所有研究对象的基线数据被用于相关和回归分析。被分配到的统计意义 。

3所示。结果

3.1。人体测量和生化参数

正如所料,主题与2型糖尿病有更高的空腹血糖和糖化血红蛋白水平与BMI(身体质量指数)增长相对于non-T2DM个人。其他人体测量和生化参数包括年龄、血脂,肌酐,hsCRP两组(表之间的可比性1)。2型糖尿病受试者表明TNF -循环水平的提升α和相对于non-T2DM MCP-1集团,而没有区别存在于其他细胞因子(表测量2)。

3.2。树突细胞在外周血、坐和吃

循环DCs及其亚型的总数没有显示出两种学习小组(图之间的区别2)。2型糖尿病受试者减少总坐在DCs ( vs。 2型糖尿病与non-T2DM, ),同时显示一个类似的,虽然微不足道,但吃的趋势( vs。 2型糖尿病与non-T2DM, )。在两组,DCs总额是坐着吃(图之间的可比性2(一个))。在分析直流子集时,没有区别的比例可以看到疾病预防控制中心之间的任何研究团体或脂肪组织池(坐: vs。 2型糖尿病与non-T2DM, ;吃: vs。 2型糖尿病与non-T2DM, )(图2 (b))。相比之下,pDCs两坐(增加 vs。 DC细胞, )和吃( vs。 直流, )2型糖尿病相对于non-T2DM科目以及吃的2型糖尿病组与相应的SAT ( vs。 直流, )(图2 (c))。

3.3。树突状细胞与其他协会的测量参数

总循环DCs与血糖负相关( , )和hsCRP ( , )。多元线性回归显示血糖作为唯一的独立预测因子( ,邻接的 )。传播疾病预防控制中心与血清干扰素-呈正相关γ( , )和反向c -肽( , )和hsCRP水平( , ),只有c -肽施加一个独立的协会( ,邻接的 )。没有总DCs的相关性,疾控中心,或与任何评估参数观察髓坐或吃。

多元线性回归显示,DCs在吃与2型糖尿病的患病率( ),但不与肥胖( )或冠状动脉疾病( ),的的 。同样的,2型糖尿病是唯一积极预测pDCs坐( ,邻接的 )以及在吃( 的为2型糖尿病, )肥胖和冠状动脉疾病都没有显示任何协会在脂肪组织仓库。相比之下,cDC没有相关性与2型糖尿病、肥胖、或CAD研究隔间。

4所示。讨论

树突状细胞是负责维护专业抗原呈递细胞天然免疫与适应性免疫免疫耐受和耦合(7]。脂肪组织已经提出DCs为脂肪组织炎症通过调节巨噬细胞和T细胞积累和激活(2]。在这里,我们表明,在主题与2型糖尿病,DCs总额减少皮下脂肪组织与非糖尿病的个体相比,虽然子集的血浆DCs增加SAT和吃以及吃相对于坐。

积极联系的证据相比,肥胖和高脂肪喂养和数量的增加在DCs数据之间的关系在DCs和2型糖尿病胰岛素抵抗或少得多了。Bertola et al。10)直流呈正相关标记CD1c和HOMA胰岛素抵抗指数在坐的有或没有2型糖尿病和肥胖。在小鼠模型中,曹et al。13)表明,趋化因子受体CCR7的缺席,这是必要的脂肪食源性积累DCs在脂肪组织中,在降低空腹血糖和胰岛素水平。在另一项实验的研究中,老鼠完全缺乏DCs是防止食源性肥胖和胰岛素抵抗;然而,在这个模型中,DCs缺席不仅从脂肪组织也从所有其他器官包括肝脏,这可能也导致了结果12]。这里,而是惊讶地发现减少的数量总DCs在坐的2型糖尿病受试者观察到类似的趋势也在吃,尽管增加糖尿病的空腹血糖和较高的BMI组。另一方面,更高的总患病率DCs在两组相对坐着吃非常符合曹等人的结果。13),报告数量增加的DCs在坐在肥胖与网膜脂肪组织相比,人类接受减肥手术。部分差异与先前的结果并不容易解释;然而,这是第一次人类研究直接评估DCs在糖尿病和非糖尿病的受试者的数量,没有直接可比的数据来验证这些发现是可用的。然而,直流评估方法的差异和有限的可转让性的动物对人类可能造成这些结果的数据。显然,其他研究更大的患者群体需要澄清这个问题。

有趣的是,虽然传统的DCs两组之间没有差别,血浆DCs增加糖尿病受试者在两个坐,吃的方式完全相反的DCs。这些发现符合的数据Ghosh et al。16)显示之间存在一种正相关的表达pDC-specific成绩单(CLEC4C,正签名基因)和HOMA胰岛素抵抗指数在内脏脂肪组织的肥胖糖尿病受试者。他们也确认的结果缺乏髓样小鼠模型,动物免受食源性肥胖和胰岛素抵抗[17]。因此我们的研究结果显示,在人类脂肪组织,pDCs可能更重要的是胰岛素抵抗和2型糖尿病的发展比总或传统的DCs。

心外膜脂肪组织,本地化主要是房室和室间的凹槽和右心室的壁,自由已被证明是比SAT和促炎,由于其接近冠状动脉和缺乏分筋膜,已经建议直接导致冠状动脉疾病的发展(18- - - - - -21]。尽管人类的数据非常有限,尤其是与坐和腹部增值税相比,吃被报道的大多数类型的免疫细胞包括巨噬细胞、T淋巴细胞的不同子集,自然杀伤(NK)细胞和B淋巴细胞(15,22,23]。然而,到目前为止,只有最小的信息对DCs在动物吃,虽然没有数据存在于人类。在急性冠脉综合征的典范,Horckmans et al。15)表明,急性冠状动脉结扎是增加数量的DCs在吃因为他们迁移从心肌梗塞部位。这个过程是由B淋巴细胞耗竭或逆转中和集落刺激因子(gm - csf)。同样,在肥胖糖尿病小鼠db / db, DCs积累主要在血管周围脂肪组织与血管壁和总损耗的DCs改善肠系膜动脉血管舒张(24]。在这里,我们第一次在人类识别总以及传统和血浆DCs吃。引人注目的是,尽管总DCs往往是低相对于对应的坐不管吃的2型糖尿病以及糖尿病与非糖尿病患者相比,吃的主题和中心没有任何有意义的两组之间的差异和脂肪组织池,pDCs在吃的2型糖尿病显著增加个人相对于相应的刻意坐着吃。这证实了正吃pDCs和2型糖尿病之间的联系在多元回归分析。有趣的是,没有独立吃pDCs和肥胖或冠状动脉疾病之间的关系可以建立在两组。如前所述,pDCs可能导致脂肪组织炎症的机制包括巨噬细胞招聘和M1极化,成熟的传统DCs, B和T细胞的激活,或改变immune-metabolic相互作用产生的I型干扰素产量的增加(9,12,16,25- - - - - -28]。总的来说,这些数据显示特定的吃介导炎性表型由血浆DCs,进一步增强2型糖尿病的存在。这个假说是由最近的转录组分析显示增加大量的促炎基因的表达在肿瘤坏死因子-αNF -κB,和其他炎症通路在糖尿病与非糖尿病患者吃人(29日]。横断面研究的性质并不使我们能够分析原因的结果;然而,我们的数据值得进一步研究函数的髓样吃,这些细胞可能构成潜在的有趣的治疗干预的目标。

主要研究的局限性包括相对较低的样本大小和既存的差异,尽管大多是微不足道的,在几个两组间基线特征包括体重指数和冠状动脉疾病和高血压的患病率,尽管多重回归分析占大多数的差异。两种不同吃抽样sites-anterior室间沟和右心优势也影响结果的室和pericoronary位置吃最近被证明有不同的转录组签名(30.];然而,采样位置的可用性在我们的研究中主要是引导吃,因此不可能在所有的参与者中保持绝对一致的。

5。结论

综上所述,我们的研究首次证明了在人体树突状细胞的存在和他们的两个亚型在心外膜脂肪组织(常规和血浆)。进一步表明,2型糖尿病与DCs总额的减少皮下脂肪组织,而髓相反增加皮下在心外膜脂肪组织,甚至更多。这些发现表明pDCs发展的2型糖尿病的潜在角色和未来的治疗目标。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由卫生部捷克共和国(批准号码15 - 26854 - a)和卫生部捷克概念发展的研究机构(“临床和实验医学研究所”(IKEM) IN00023001和RVO-VFN 64165)。