抑制效果的GSS Lipopolysaccharide-Induced通过TNF -内皮细胞损伤和阿里α和il - 6

文摘

背景。在腐败的情况下,LPS诱导的肺血管内皮细胞(EC)损伤,和炎性介质的释放发射和加剧急性肺损伤(ALI)。没有有效的治疗选择阿里。Genistein-3 - - - - - -磺酸钠(GSS)是一个本地大豆异黄酮的导数,它通过antiapoptosis展品神经保护效应。然而,是否GSS防止sepsis-induced EC损伤和炎症介质释放尚未确定。在这项研究中,我们发现,GSS不仅表达下调肿瘤坏死因子的水平α并在小鼠的肺和血清il - 6在活的有机体内但也抑制肿瘤坏死因子的表达和分泌α和il - 6在ECs。重要的是,我们还发现,GSS阻塞LPS-induced TNF -α和il - 6表达通过Myd88 / NF - ECsκB信号通路。综上所述,我们的研究结果表明,GSS可能是一种很有前途的候选人sepsis-induced阿里通过其在肺ECs调节对炎症反应的影响。

1。背景

染料木黄酮是主要的大豆异黄酮和自然酪氨酸激酶抑制剂(1]。最近,科学兴趣染料木黄酮已经极大地由于染料木黄酮假定的多种药理特性,如抗肿瘤、抗炎和抗氧化效果(2,3]。虽然染料木黄酮有许多有利影响,其水溶性差和脂肪溶解性限制了其广泛的应用[4]。改善染料木素的生物利用度和活动,李等人合成genistein-3 - - - - - -磺酸钠(GSS),一种新的化合物来源于染料木黄酮,皮质神经元免受ischemia-induced神经元细胞凋亡(5]。然而,没有报告关于GSS的影响细菌侵染诱导急性肺损伤(ALI)在脓毒症状态下直到现在。

脓毒症的特点是促炎反应的不平衡引起多个器官的功能障碍,如阿里和急性呼吸窘迫综合征(ARDS) [6]。阿里是一种严重的临床综合症,其特征是分散肺水肿。阿里的发病机理是由于肺血管内皮细胞损伤,导致肺血管通透性增加,大量炎性肺浸润[7]。内皮细胞创伤性破坏肺内皮屏障的完整性和过度的炎症反应是中央sepsis-induced阿里的发病机制(8- - - - - -10]。一些研究表明,肺血管的炎症反应在WT老鼠ECs调节在LPS-induced阿里(11),和阻塞肺部炎症有效减毒病理肺损伤(12,13]。

脓毒症可以由广泛的血管内皮细胞(EC)功能障碍对革兰氏阴性细菌感染(14]。脂多糖(LPS)的主要成分是革兰氏阴性细菌的外表面和被认为是至关重要的因素参与EC损伤的发病机理(14]。LPS结合并激活toll样受体4 (ECs TLR4),导致大规模的各种炎性介质的释放,如白介素6 (il - 6)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α)。超表达的肿瘤坏死因子-α和il - 6与阿里有关,多器官功能障碍综合征(插件),和死亡率(15,16]。

核转录因子κB (NF -κB)是一个无处不在的核转录因子,起着重要的作用在感染和炎症反应参与的调控多种基因的激活炎症包括启动子区域的肿瘤坏死因子-α和il - 6基因(17]。我们以前的研究表明,在有限合伙人之间的相互作用和膜的TLR4 ECs, LPS诱导激活下游NF -κB在ECs通过Myd88-dependent方式(Myd88通路)和Myd88-independent方式(GEF-H1通路)18]。最近,宋等人表明,染料木素具有抗炎作用在LPS-stimulated通过抑制小胶质细胞TLR4信号(19]。然而,GSS的潜在影响LPS-induced TLR4通路的激活和随后的TNF -α和il - 6过度肺微血管ECs在很大程度上是未知的。这些实验是为了调查GSS是否授予保护作用对LPS-induced超表达的肿瘤坏死因子-α和il - 6在肺微血管ECs并确定相关的信号通路。

在目前的研究中,我们不仅发现GSS防止sepsis-induced阿里还透露,GSS的上述保护作用是通过抑制LPS-induced Myd88 / NF -κB /肿瘤坏死因子-α/ il - 6代替GEF-H1 / NF -信号激活κB通路肺微血管ECs。我们的发现提供了新的观点GSS的保护作用LPS-induced肺微血管EC受伤,和本研究的发现可能有助于预防和治疗sepsis-induced阿里。

2。方法(我们彝族的方法等。20.])

2.1。动物实验(ALI模型,肺组织病理学,干/湿的比率,PaO的比率₂/ FiO₂和伊文思蓝外渗)

雄性C57BL / 6小鼠(6 - 8周大,18 - 20 g)获得的实验动物中心瑞金医院,上海,中国。所有的老鼠提供食物、水和安置标准实验室按照制度动物保健政策。所有程序和动物保健进行符合国家卫生研究院指导实验室动物保健和使用的批准(syxk - 2011 - 0113)的科学调查委员会上海交通大学医学院,上海,中国。动物都适应于实验室条件下(25°C, 12 h / 12 h光明/黑暗,湿度50%,和随意获得食物和水)实验前一周。老鼠首先使用或没有bay11 - 7082通过腹腔内注射2小时,然后,sepsis-associated阿里是一个盲肠的结扎和穿刺(CLP)模型;1%戊巴比妥钠的小鼠麻醉(40毫克/公斤)。肺损伤的组织学评估,鼠标肺收获后24 h CLP应用,很快被删除和固定在10%多聚甲醛。paraformaldehyde-fixed叶的肺是嵌入在石蜡,切成5μ米的部分。使用标准协议执行)染色。每组的幻灯片是评估在大功率领域(部分进行评估×100放大)。评估sepsis-induced肺部水肿,肺都被立即重获取湿重,然后放在烤箱在80°C 48小时获取干重。干的湿肺肺的比率计算评估肺部水肿。分析sepsis-induced肺血管泄漏,伊文思蓝染料(30毫升/公斤)是尾静脉注入2小时前终止实验。伊文思蓝积累的测量肺组织是由spectrofluorimetric分析肺组织溶解产物和以前一样(21]。测量氧合指数变化,颈动脉插管,动脉血液样本收集进行分析(22]。

2.2。细胞培养和化学物质

细胞培养和试剂,主要小鼠肺微血管内皮细胞取自Angio-Proteomie(美国波士顿,MA)和维护在Angio-Proteomie内皮细胞培养基在湿润37°C, 5%的公司₂孵化器。以48小时的间隔中被改变。Genistein-3 - - - - - -磺酸钠(GSS)从泰兴化工有限公司上海名获得有限公司(上海,中国),和bay11 - 7082是中国从Beyotime购买。有限合伙人(从大肠杆菌055:B5)是获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州)。anti-GEF-H1兔单克隆抗体(mAb) anti-Myd88兔子马伯,anti-NF -κB p65兔子马伯,anti-rabbit phospho-NF -κB-p65兔抗体得到从细胞信号技术(丹弗斯,MA)。Alexa萤石594 -共轭山羊anti-rabbit二级抗体和延长黄金不变色Mountant与DAPI英杰公司生命科学。

2.3。细胞生存能力分析

细胞计数Kit-8 (CCK-8;CK04 DOJINDO)是用来评估细胞生存能力根据制造商的协议。ECs被播种在96孔板和培养24 - 48 h。单层细胞汇合的90%时,ECs暴露在各种浓度的GSS不同时期。接下来,10μl CCK-8的解决方案是添加到每个好,和一个额外的细胞被孵化3 h。450纳米的吸光度测量使用标。细胞存活率计算使用的平均6井汇集数据从三个独立的实验。

2.4。ELISA

肿瘤坏死因子-上层清液的化验α和il - 6蛋白含量对TNF -使用ELISA试剂盒α圣地亚哥和il - 6 (BD生物科学CA)根据制造商的指示。短暂,每一个96孔板的涂层在一夜之间与捕获抗体在洗之前PBS包含0.05%渐变;然后,上层清液添加到适当的井。被孵化后1小时在室温下,检测抗体增加,孵化1小时。然后洗井和PBS /渐变,和辣根peroxidase-conjugated链霉亲和素为进一步增加了1小时在室温下。最后,颜色是由过氧化物酶底物添加到每个之前阅读使用Dynatec板的吸光度在450 nm读者(Denkendorf,德国)。

2.5。rt - pcr

总RNA制备使用试剂盒从ECs试剂(英杰公司)根据制造商的指示。使用低聚糖合成第一链cDNA (dT) 15个引物和M-MLV逆转录技术(Promega) 4μ40 g的总RNAμl反应体积。Taq DNA聚合酶被用来放大结果cDNA 25μl反应体积。设计的引物序列如下:TNF -的引物序列α是5 - - - - - -ATG GCG TGG AGC TGA GAG ATA-3和5 - - - - - -GGG GAG GCG TTT GGG亚美大陆煤层气有限公司GT-3 ,il - 6的引物序列是5 - - - - - -猫TGC猫TGG TCT GAG GTT颈- 3和5 - - - - - -AGT AGT CTG答TGC TGA TGT颈- 3 ,的引物序列GAPDH是5 - - - - - -GGT CTA猫GGC AAC TGT GA-3和5 - - - - - -ACC gg TGG TCT有条件现金援助CTG a - 3 ;PCR生产被认为在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后,在紫外光照射下拍摄。

2.6。提取的核和胞质分数

核和胞质蛋白的提取和分离根据制造商的说明进行使用核和胞质蛋白提取工具包(Beyotime、江苏、中国)。短暂治疗后,ECs被离心洗PBS和收集。EC颗粒在200毫升resuspended提取缓冲冰和孵化15分钟,然后,提取缓冲B是补充道。离心后,上清液被储存在-80°C,直到通过凝胶电泳分析。颗粒包含细胞核,在50毫升resuspended核提取缓冲区,震动和核蛋白质提取的样本。之后,样本离心机和上层清液被移除,使用凝胶电泳分析。孤立使用的验证方法的胞质及核分数(histone-H3被用作加载控制核蛋白质,GAPDH是用作细胞质蛋白质)加载控制是利用免疫印迹分析检查。

2.7。免疫印迹分析

总蛋白提取EC层或肺组织中提取,然后,目标蛋白表达是探测与特定的抗体。等量的细胞或肺组织提取分离6 - 12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)根据目标蛋白质的分子量和electrotransferred PVDF膜。细胞膜被封锁在Tris-buffered盐水(TBS)和Tween-20含有5%脱脂牛奶在室温1小时在室温下然后孵化与目标蛋白(抗体GEF-H1 Myd88, NF -κB p65, P-NF -κB p65稀释1:1000)在一夜之间在4°C。适当的膜被孵化HRP-linked二级抗体(1:2000)在室温1小时。信号强度补偿了3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内部控制。最后,用免疫印迹腔的乐队是试剂(微孔、Billerica MA)。蛋白质的乐队是量化使用ImageQuantR软件(分子动力学,桑尼维尔CA)。

2.8。转染与Myd88核

隐形RNA干扰工器对设计并合成Myd88基因制药技术(上海,中国)。小干扰rna分子分别转染到Myd88 ECs使用Lipofectamine RNAiMAX (CA)卡尔斯巴德根据制造商的指示。双siRNA对序列编码构造Myd88 (5 - - - - - -在20高斯GGU GGU GGU UGU中联科利佐治亚大学u - 3 )。一个炒,小干扰rna(5负控制 - - - - - -UUC UCC棉酚问GUC ACG UTT-3 )也包括在内。RNA干扰的能力分子击倒目标通过免疫印迹分析蛋白表达进行了分析。

2.9。共焦Immunofluorescent分析

活跃的NF -κB染色,汇合的EC单层膜与prewarmed洗两次PBS (pH值7.4),在4%多聚甲醛固定15分钟,然后用PBS permeabilized含有0.1% Triton x - 100和1%牛血清白蛋白10分钟。在PBS洗涤后,单层膜anti-NF -孵化κB p65兔子马伯一夜之间(1:100)在4°C。ECs沾活跃NF -κB是进一步孵化Alexa萤石594 -共轭山羊anti-rabbit二级抗体(1:500)为1.5小时。最后,ECs被延长密封黄金不变色与DAPI Mountant,然后,单层膜应用共焦显微成像。

2.10。统计分析

结果表示为 至少三个独立的实验。数据表示为均值和标准误差。学生的 - - - - - -测试和使用方差分析。意义是接受 。

3所示。结果

3.1。GSS抑制Sepsis-Induced阿里和肺血管研究进展

为了找出是否GSS块sepsis-induced肺血管屏障破坏和阿里,GSS sepsis-induced肺组织学变化的影响在本研究首先检查。我们发现预处理与GSS明显改善sepsis-induced肺部病理变化,主要包括丰富的炎性细胞浸润,间质水肿(图1(一))。此外,GSS sepsis-induced肺血管屏障破坏的影响被检测到的湿/干重比(图的变化1 (b))。在这项研究中,我们还发现,GSS逆转sepsis-induced PaO₂/ FiO₂减少(图1 (c))和伊文思蓝染料(数据积累1 (d)和1 (e)在老鼠的肺。

3.2。GSS变弱Sepsis-Induced老鼠体内的炎症反应

肿瘤坏死因子-α和il - 6是重要的促炎介质与全身炎症反应综合征,急性肺损伤,和死亡率15]。进一步确定GSS抑制sepsis-induced肺部炎症体内,我们使用TNF - ELISA分析检查更改α分别和肺组织中il - 6和血清。与对照组相比,中电集团TNF的表达明显增加α和肺组织中il - 6。然而,这些变化是显著改善与GSS(数据预处理2(一个)和2 (c))。与此同时,我们还发现,GSS有效抑制CLP-induced增强TNF -α和在小鼠的血清il - 6(数据2 (b)和2 (d))。

3.3。GSS在ECs细胞细胞毒性的影响

基于CCK-8细胞生存能力分析,我们检查了细胞毒性的GSS ECs。染料木素的化学结构(图3(一个)),GSS(图3 (b))。如数据所示3 (c)和3 (d),GSS对ECs的浓度没有明显的毒性低于0.1毫米。此外,尽管EC细胞生存能力降低1和10毫米的浓度,结果与对照组相比没有统计学意义。在这项研究中,我们进一步使用GSS浓度在0.1毫米探索LPS-induced EC损伤的保护作用。

3.4。GSS抑制LPS-Induced TNF -α和ECs il - 6表达和分泌

确定GSS抑制sepsis-induced通过肺血管炎症反应和阿里ECs,我们进一步检查肿瘤坏死因子的表达和分泌的变化α和il - 6在ECs有无LPS刺激。LPS刺激后8 h,内皮细胞收集,mRNA和蛋白表达il - 6和TNF -α通过rt - pcr和ELISA检测。与对照组相比,il - 6和TNF - LPS组明显增加αECs的表达式。然而,这些变化被显著地抑制与GSS(数据预处理4(一)- - - - - -4 (f))。同样的,我们还发现,GSS LPS-induced分泌il - 6和TNF -有效地逆转α在肺血管ECs(数字4 (g)和4 (h))。

3.5。LPS-Induced NF -κB激活是减毒的GSS ECs

NF -κB是一种重要的转录因子,参与许多炎性因子解放的规定,如肿瘤坏死因子-α和il - 6 (23]。为了检查是否GSS抑制LPS-induced TNF -α并通过NF - il - 6 ECs的增加κB信号,我们检查的表达和激活NF -κB在ECs。在这项研究中,ECs使用GSS 2小时,然后用LPS刺激。免疫印迹分析进行检查的影响在LPS-induced GSS upregulation NF -κB在ECs。结果表明,GSS方面表现出显著的抑制作用在NF - LPS-induced增加κB表达(数据5(一个)和5 (b))。NF -κB是一个重要的转录因子,激活NF -κB将调解易位从细胞质到细胞核。为了检查GSS LPS-induced NF -的影响κ激活,核和胞质提取物是从ECs孤立的。NF -的表达κB在胞质及核分数ECs治疗后的有限合伙人有/没有GSS检查使用免疫印迹分析。我们发现,有限合伙人增加核易位NF -κ之前在ECs B,但预处理的GSS LPS刺激NF -水平显著降低κB在ECs的原子核(数字5 (c)- - - - - -5 (f))。我们进一步用荧光共焦显微镜检查的亚细胞定位和荧光强度NF -κ我们发现,NF -κB是主要定位在细胞核的ECs LPS-stimulated组。然而,预培养GSS有效减少LPS-induced NF -κ(图B易位到细胞核5 (g))。

3.6。GSS调节LPS-Induced Myd88 ECs的表达式

NF -κB激活是由各种各样的信号。我们先前的研究发现,GEF-H1和Myd88都参与NF -的规定κB在LPS-induced EC损伤(18]。为了研究GSS LPS-induced NF -的底层机制κ激活,我们使用ECs GSS然后添加有限合伙人。我们进行了免疫印迹试验来验证是否GEF-H1和Myd88 GSS的块效应。我们发现GSS有效抑制LPS-induced Myd88表达式(数字6(一)和6 (b))。然而,GSS不能有效地阻止LPS-induced GEF-H1蛋白(数据的超表达6 (c)和6 (d))。上述数据表明,GSS可能防止LPS-induced通过Myd88 / NF - EC细胞凋亡κB信号。

3.7。GSS抑制LPS-Induced TNF -α并通过Myd88 / NF - il - 6表达ECsκB信号通路

进一步阐明GSS的保护作用在LPS-induced EC炎症反应,我们使用ECs GSS, Myd88 siRNA, bay11 - 7082 (NF -的特定抑制剂κB) (10μmol / l)在LPS刺激之前。如数据所示7(一)和7 (b)和数字8(一个)和8 (b),不仅GSS还抑制Myd88或NF -κ肿瘤坏死因子- B显著逆转LPS-induced增加α和il - 6。以上数据表明,GSS保护ECs与LPS-induced TNF -α并通过失活Myd88 / NF - il - 6的分泌增加κB信号通路。

4所示。讨论

阿里的脓毒症是一种常见的并发症肺内皮细胞功能障碍被认为是主要的引发剂(24]。大量的研究报道,肺血管内皮细胞是阿里的关键调节器和协调器(25),和LPS引起肺内皮细胞功能障碍和阿里26]。肺血管内皮细胞损伤和内皮屏障失败是水肿形成的关键事件和炎症在阿里27]。

ECs脓毒症的进展中发挥了重要作用作为一线人员对入侵病原体(28]。当传染性细菌有限合伙人释放到血液中,有限合伙人ECs的快速识别和结合受体,导致一系列细胞因子的释放,导致内皮功能障碍(29日]。增加细胞因子,如肿瘤坏死因子-α和il - 6,许多人类炎症状态的标志,包括败血症(30.,31日]。以往的数据显示,染料木素的保护作用,如抗肿瘤、抗氧化、抗凋亡功能(32- - - - - -34];然而,GSS的抗炎效果,一种新的化合物来源于染料木素,还不完全理解。在目前的研究中,我们证明了GSS能够抑制LPS-induced肺微血管EC受伤和sepsis-induced阿里。底层机制参与上述过程与减少有关LPS-induced超表达的肿瘤坏死因子-α和肺微血管ECs GSS, il - 6的差别是由对这些Myd88 / NF -κB信号通路。

在腐败的情况下,肺是一个经常受影响的器官。侵染诱导肺癌病理变化和随后的阿里是发生在败血症患者死亡的主要原因7,35,36]。多个先前的研究已经揭示了机制参与LPS-induced阿里(20.,37,38];然而,合成化学抑制剂的发病机制有了更多的副作用,限制其广泛的临床使用。发生在高浓度的天然黄酮水果逐渐吸引了人们的注意力。一些先前的研究集中在染料木黄酮对脑损伤的影响和暗示,染料木黄酮保护大脑炎症。例如,Mirahmadi等人报道,染料木黄酮减轻神经炎症和认知障碍(39]。宋等人表明,染料木黄酮抑制小胶质细胞的激活和释放炎性细胞因子(19]。其他学者最近透露,GSS可以从焦脑ischemia-induced保护皮层神经元凋亡神经细胞(5]。因此,它感兴趣的理解GSS LPS-induced阿里上的影响。LPS-induced阿里的病变主要包括肺水肿和渗透多种炎症细胞(37]。在目前的研究中,首先,我们评估的角色GSS在肺组织病理学变化,氧指数和干/湿的比率。我们的结果表明,GSS能有效逆转LPS-induced氧指数的降低,干/湿比率增加,肺部病变。这些结果表明,GSS在LPS-induced肺损伤中起着实质性的保护作用和老鼠死亡率。进一步描述LPS-induced肺overinflammation GSS的效果,我们分析了TNF的表达α在肺组织中il - 6和血清ELISA的老鼠。我们发现GSS显著抑制LPS-induced超表达的肿瘤坏死因子-α和il - 6。与先前的报道(5),这些结果表明,GSS不仅具有保护作用的脑损伤,也有效地抑制LPS-induced通过抑制肺损伤的炎症。

阐明GSS产生保护作用的机制在肺微血管ECs提供细胞治疗效果的证据GSS LPS-induced阿里,我们进一步测试的角色GSS TNF的表达和释放α和il - 6在体外的ECs。符合我们上面发现体内外,我们还观察到,GSS显著抑制TNF的表达α和il - 6在ECs。类似于先前的报道(23),这些数据提供了进一步的证据,LPS-induced EC损伤和释放肿瘤坏死因子-α和il - 6 LPS-induced ALI的主要原因。

NF -κB是一个多效性的转录因子,激活炎症基因中起着重要的作用,被认为是一种很有前途的治疗炎症的目标(40]。一般来说,NF -的活动形式κ存在于细胞质中。当它被磷酸化激活,NF -κB把进入细胞核,活跃NF -κB绑定到特定的DNA序列,从而增加许多下游基因的表达,包括TNF -α和il - 6 (41]。在这项研究中,GSS表现出显著的抑制NF -的激活κB和减毒LPS-induced NF -κB从细胞质细胞核的ECs易位。我们的数据表明NF -κB信号可能涉及GSS-induced抑制TNF -α和il - 6在LPS-stimulated ECs。

众所周知,有许多上游蛋白质调节NF -的活性κB (42]。在这些信号通路,Myd88-dependent GEF-H1-dependent manner-mediated监管NF -κB是主要途径与LPS-induced内皮损伤(18]。获得进一步了解保护作用的GSS LPS-induced超表达的肿瘤坏死因子-αil - 6和理解内在的分子机制,我们评估了表达和活性的变化Myd88和预处理后GEF-H1 GSS LPS-incubated ECs。在目前的研究中,我们发现,GSS防止LPS-induced超表达内皮细胞的促炎介质通过Myd88信号通路。此外,联合应用GSS GSS Myd88 siRNA同时联合应用和NF -κB抑制剂产生增加对LPS-induced TNF的表达,抑制的影响α和il - 6与GSS孤单。这些结果表明,GSS部分块proinflammation cytokine-associated通过Myd88 / NF - EC受伤κB /肿瘤坏死因子-α/ il - 6在体外信号通路。

如图9首次,我们探索的角色GSS肺微血管内皮细胞的抗炎作用。我们也提供了新的证据,保护作用的分子机制的GSS生产LPS-induced TNF -α和il - 6在Myd88 / NF -介导的κB-dependent方式。然而,伴随着肺上皮细胞和血管内皮细胞的损伤,sepsis-induced急性肺损伤开始发展(43]。除了LPS-induced内皮细胞炎症介质的过度表达,LPS-induced上皮细胞炎症激活也扮演着重要的角色的过程中sepsis-induced肺损伤(44]。因此,GSS也可能阻止LPS-induced释放炎症介质在肺上皮细胞,这需要进一步研究。

5。结论

总之,目前的研究表明,GSS的抑制性影响LPS-induced急性肺损伤和肺血管EC炎症反应。GSS显著减弱肺组织病理学变化通过减少肺微血管通透性和炎症因子释放。我们进一步发现Myd88 / NF -κB /肿瘤坏死因子-α/ il - 6信号通路是GSS的重要目标。以上结果表明,GSS小说可能是一个治疗代理期间EC炎症反应肺损伤的预防腐败的条件。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果都包含在这篇文章在最后这个手稿的一部分。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Lei, Zengding周,Yijuan郑贡献同样这项工作,因此都是第一作者。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81772078号,81772077,和81971832)和来自上海交通大学的资助(没有。YG2015MS58)和上海自然科学基金(19 zr1432100)。

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