文摘
越来越多的证据表明,巨噬细胞在不同组织pyroptosis参与慢性无菌性炎症和组织纤维化有关。我们最后的研究还揭示了滑膜成纤维细胞的重要作用pyroptosis膝骨关节炎的发病和发展(高雅)。在这项研究中,我们旨在调查滑膜巨噬细胞pyroptosis是否发生,这种形式的细胞死亡是否应该与滑膜炎和纤维化有关的高雅。高雅模型大鼠滑膜组织的,我们观察到减少caspase1, NLRP3, ASC, GSDMD引起巨噬细胞耗竭mRNA和蛋白表达。此外,老鼠接受特定caspase1抑制剂Ac-YVAD-CMK显示更少的炎症反应和纤维化,不仅在促炎因子il - 1的表达β,地震,HMGB1和纤维化标志物TGF -β,COL1A1 PLOD2和TIMP1还在他染色观察,小天狼星红染色、横向直径合适的膝盖。随后,我们建立了一个有限合伙人在巨噬细胞+ ATP-induced模型模拟的炎性环境高雅,诱导巨噬细胞pyroptosis。巨噬细胞转染caspase1 siRNA显示减少细胞死亡;与此同时,pyroptosis-related蛋白质的相对表达也被下调。此外,滑膜成纤维细胞的纤维化标志物水平显著降低与siRNA GSDMD-transfected coculture后巨噬细胞。最后,滑膜巨噬细胞pyroptosis可能发生在高雅的病理过程和抑制滑膜巨噬细胞pyroptosis减轻滑膜炎和高雅模型大鼠肝纤维化。
1。介绍
膝骨关节炎(高雅)是一种退行性关节疾病,影响到所有组织的膝盖,而慢性低度炎症持续的关节退行性变的主要因素1]。症状,高雅的特点是关节软骨的渐进破坏周围组织,特别是滑膜组织,引起疼痛、僵硬和残疾(2]。滑膜组织的软膜内层空间膝盖和包含高新陈代谢活跃的细胞即synoviocytes进一步分离滑膜巨噬细胞和滑膜成纤维细胞。这些细胞和滑膜组织作为一个整体发挥关键作用在正常关节生理学为软骨细胞提供营养和拆卸废物通过滑液(3]。到目前为止,我们缺乏一个全面的理解高雅的发病机理,和目前的研究普遍认为滑膜炎高雅的发展中起着重要的作用。
在滑膜组织中巨噬细胞的浸润和激活使滑膜炎的主要触发高雅的发病机理。其重要性已经被他们的密切相关性与高雅的症状,比如软骨破坏和滑膜纤维化(4]。巨噬细胞是参与高雅甚至使他们有效候选人中使用的定量评估炎症(5]。滑膜纤维化是另一种病变滑膜组织细胞外基质过度沉积为特征,导致关节疼痛和僵硬。基因procollagen-lysine 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 (PLOD2),胶原蛋白I型α1链(COL1A1)的金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP1)显示移植osteoarthritis-related纤维化;他们通常被认为是纤维化的标记(6]。此外,越来越多的证据表明滑膜成纤维细胞的关键作用和转化生长因子-β(TGF -β)在纤维化反应(7,8]。
最近,一种新形式的程序性细胞死亡,主要发现在单核细胞、巨噬细胞、树突细胞,被称为pyroptosis [9]。的规范化途径pyroptosis NLRP3,最佳nod样受体,形成一个inflammasome组成的凋亡speck-like蛋白(ASC)和丝氨酸蛋白酶caspase1 [10]。NLRP3 inflammasome激活控制pro-caspase1的乳沟和激活。最后,激活caspase1 pro-IL-1等导致促炎细胞因子βpro-IL-18, HMGB1成熟和诱发pyroptosis根据解理gasdermin D (GSDMD) [11,12]。在我们最后的研究中,之间的相关性NLRP inflammasomes和滑膜成纤维细胞pyroptosis研究体内和体外13]。我们也显示,增加低氧诱导因子- 1α在洋槐加剧滑膜通过滑膜成纤维细胞纤维化pyroptosis [14]。
研究巨噬细胞pyroptosis最初集中在感染由细菌和病毒引起15]。但是越来越多的证据表明,巨噬细胞在不同组织pyroptosis参与慢性无菌性炎症和组织纤维化有关。例如,小胶质细胞(即。,macrophages of the central nervous system) pyroptosis can induce neurogenic inflammation and fibrosis [16),肝脏枯氏细胞(即。,macrophages in liver tissue) pyroptosis can cause chronic hepatitis and liver fibrosis [17肾脏,巨噬细胞pyroptosis会导致肾脏炎症和纤维化(18]。
总之,高雅显示慢性炎症状态和滑膜炎和纤维化。这些病理过程非常类似于“巨噬细胞炎症pyroptosis / /纤维化”领域的其他组织。因此,我们推测,应该有巨噬细胞pyroptosis在滑膜组织和这种形式的细胞死亡应该与滑膜炎和纤维化有关。
2。材料和方法
2.1。体内动物实验设计
32只SD雄性大鼠,重量从250克到290克河(由北京提供重要的实验动物技术有限公司),是使用。动物被保存在一个特定的无菌,层流住房装置控制温度、湿度、和12 h光明/黑暗方案。所有动物协议被批准的动物保健和使用委员会南京中医药大学。所有实验按照美国国立卫生研究院实验室动物保健和使用指南。
老鼠被随机分配到下列四组(每组有八个老鼠):正常,高雅,高雅+ Clodronate脂质体(洋槐+ CL)和高雅+ Ac-YVAD-CMK(高雅+美国青年代表大会)。第一天,洋槐模型是由前交叉韧带横断(ACLT)在两膝盖手术如前所述[19]。手术后14天(14天),药物管理局开始了。滑膜衬里的高雅+ CL组耗尽巨噬细胞内注入的100μl Clodronate脂质体(Clodronate脂质体,阿姆斯特丹,荷兰)20.]。高雅+美国青年代表大会组关节内注射caspase1抑制剂Ac-YVAD-CMK (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)剂量为0.25毫克/公斤(与10% DMSO盐水,100μl)。正常组和亚组治疗100人μl无菌生理盐水在同一时间。所有药物注入每2天2周。之后,老鼠牺牲收获滑膜组织。
2.2。右膝关节直径测量
右膝盖的横向直径用游标卡尺测量在第一天,7天,14天,21天,和28天(三丰公司、神奈川、日本)来衡量左派和右派之间的水平距离最高点的膝关节弯曲为90°,分别。每个膝盖测量三次,计算平均值。
2.3。免疫荧光分析
滑膜组织被冻结的准备部分。部分在PBS洗5分钟和加工0.3% H2O2在甲醇为20分钟。山羊血清添加的块在室温下30分钟。然后,部分与初级孵化anti-CD68抗体(panmacrophage标记(21],Abcam,英国剑桥)一夜之间在4°C和二次抗体的抗体为2 h /兔子在37°C。CD68与明亮的橙色荧光染色,荧光显微镜下观察和部分(德国蔡司)。
2.4。组织学分析
滑膜组织是执行老鼠后,收集和组织被固定在10%中性福尔马林,嵌入在石蜡,切块常规染色。小天狼星红染色根据指令进行了小天狼星红染色工具包(Beyotime生物科技、上海、中国)。简单,组织部分脱蜡,浸入水,沾1 g / l苦味酸的acid-Sirius红色37°C 1 h,然后用水洗。部分安装,在徕卡DMI3000B显微镜(德国徕卡)使用一个明亮的字段。
2.5。细胞的准备
主要大鼠滑膜成纤维细胞和巨噬细胞从额外获得正常的老鼠。总之,滑膜组织与磷酸盐洗2 - 3次(PBS),然后剁碎成碎片的2 - 3毫米2和消化0.1%胶原酶II型(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)30分钟。细胞分裂后,样本通过细胞过滤器过滤。离心分离后,成纤维细胞被颗粒状的1500转4分钟和培养10%胎牛血清的DMEM补充(的边后卫;Gibco热费希尔科学,沃尔瑟姆,美国马)和抗生素(100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素;表达载体、钙、美国)。巨噬细胞与PBS经腹膜渗出液含有2%的边后卫。细胞被确定为我们的先前的研究15]。通道3 - 6的滑膜成纤维细胞用于实验。
2.6。小干扰RNA制备和转染
抑制巨噬细胞中的caspase1和GSDMD表达,商用caspase1 GSDMD和车辆/紧急小干扰RNA(表达载体、钙、美国)。巨噬细胞转染了siRNAs利用Lipofectamine 2000(表达载体、钙、美国)根据制造商的指示。核在转染试剂,培养基稀释,和细胞孵化20 pmol siRNA 6 h。
2.7。细胞治疗
有限合伙人+ ATP被用来模拟高雅和诱导细胞的炎性环境pyroptosis。巨噬细胞转染和小干扰rna (caspase1 siRNA组)或车辆/ caspase1炒核(亚组)与LPS刺激(1μ在DMEM 6 h和g / ml)然后用ATP挑战(3毫米)1 h。巨噬细胞暴露于DMEM同样体积的PBS担任控制(正常组)。
评估pyroptosis和纤维化之间的关系,巨噬细胞被镀成6-well盘子。siRNA GSDMD组、亚组和正常组与核转染与LPS刺激如上所述。感应后,巨噬细胞在DMEM培养补充10%的边后卫。然后,滑膜成纤维细胞precultured Transwell室被放置在一个6-well板和cocultured 48小时内的巨噬细胞。
2.8。赫斯特和Propidium碘(π)染色
评价孔隙形成的细胞膜,赫斯特33342年和π(Beyotime生物技术,中国上海)用于染色。简单地说,巨噬细胞被沾染了赫斯特10分钟。与磷酸盐三次洗涤后,π添加另一个10分钟。使用荧光显微镜观察细胞(德国徕卡DMI3000B)。
2.9。西方墨点法
简而言之,滑膜组织或细胞混合里帕溶解产物和地面10 - 15分钟。样本在冰上激动了30分钟,然后收集上层的。BCA蛋白质的蛋白质水平量化分析工具(Beyotime生物科技、上海、中国)。然后,蛋白质样本在SD-PAGE电泳分离蛋白质。从凝胶转移到PVDF膜蛋白和脱脂奶粉5%阻塞2 h。细胞膜是孵化主要抗体(1:1000;Abcam,英国剑桥)一夜之间在4°C,然后二次抗体(热费希尔科学、中国上海)2 h。之后,乐队被暴露于ECL可视化方法和蛋白质乐队的整体灰度值(平均灰度值或灰度值区域)量化;GAPDH是作为一个内部标记,即靶蛋白整体灰度值灰度值/内部参考。
2.10。实时聚合酶链反应
简而言之,总RNA提取试剂盒和评估由分光光度计。然后,从每组和10 RNAμ解决方案添加到10 l PCR反应μl '脚本的RT试剂盒(Beyotime生物科技、上海、中国)为逆转录37°C条件(15分钟)和85°C (5 s)。引物设计与合成由上海生物技术服务公司依照基因库中的基因序列基因序列设计,加上低聚糖v6.6。序列如表所示1。qPCR使用预混料Taq SYBR交货执行绿色PCR(豆类)根据制造商的说明ABI 7300棱镜(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。单个基因的mRNA水平正常化GAPDH和计算2−ΔΔCT数据分析方法。
2.11。统计分析
使用GraphPad Prism 6.0执行统计分析软件(美国圣地亚哥,CA)。数据了 (SD)。集团与单向方差分析或评估学生的比较 - - - - - -测试或双向方差分析与Bonferroni事后测试多个列的比较。的值 (双尾)被视为具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。滑膜巨噬细胞在洋槐Pyroptosis模型大鼠
一个免疫荧光试验(图1(一))进行确认滑膜巨噬细胞被耗尽。亚组导致显著upregulation CD68的百分比+细胞(图1 (b)与正常组相比)。与此同时,高雅+ CL组相比差别显示对这些高雅组表明巨噬细胞的损耗高雅+ CL组。比较的相对集成光密度(IOD)值在每个组和CD68的变化趋势是一致的+细胞(图1 (c))。随后,我们分析了基因和蛋白质表达caspase1 NLRP3, ASC,构成了NLRP3 inflammasome。我们的数据表明,高雅集团导致显著upregulation(数字1 (d)- - - - - -1 (f))与正常组相比,洋槐+ CL组相比差别显示对这些高雅组。此外,GSDMD水平表现出同样的趋势。
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3.2。抑制滑膜巨噬细胞Pyroptosis老鼠可能减轻滑膜炎高雅
为了评估滑膜炎、苏木精和伊红染色。与高雅组相比,高雅+美国青年代表大会组显示滑膜细胞有序安排衬里,疏松结缔组织,并减少炎性细胞浸润(图2(一个))。此外,信使rna和蛋白质表达il - 1β测量、地震和HMGB1(数字2 (b)- - - - - -2 (d))。我们发现有显著减少这些促炎细胞因子的表达高雅+美国青年代表大会组。
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3.3。抑制滑膜巨噬细胞Pyroptosis老鼠可能减轻纤维化高雅
量化的膝盖肿胀程度老鼠,横向直径测量(图右膝盖3(一个))。14天,亚组的膝关节直径明显大于正常组,28天,膝关节直径的洋槐+美国青年代表大会组明显小于的高雅。观察滑膜组织的纤维化,我们进行了小天狼星红染色。与正常组相比,亚组明显显示胶原沉积增加。这个变化是缓解高雅+美国青年代表大会组(图3 (b))。Semiquantification天狼星红染色(图3 (c))是评估使用的平均积分光密度(AIOD)。高雅+美国青年代表大会组显示相比差别很大对这些亚组。此外,我们分析了信使rna和蛋白质的表达TGF -β、PLOD2 COL1A1和TIMP1(数据4 (d)- - - - - -4(f))。我们发现有显著减少这些profibrotic物质水平高雅+美国青年代表大会组。
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3.4。Pyroptosis在LPS诱导+ ATP-Treated巨噬细胞
在巨噬细胞模仿成立一个有限合伙人+ ATP-induced模型的炎性环境高雅,诱导巨噬细胞pyroptosis。的沉默效果caspase1核和小干扰rna PCR证实了GSDMD(图4(一))。赫斯特和PI染色显示pyroptotic细胞的数量增加了有限合伙人+ ATP治疗,可以扭转这个趋势,caspase1核(图4 (b))。ASC,除此之外,蛋白质的表达NLRP3 GSDMD,和cleavage-GSDMD (GSDMD-N)高雅组高于正常组和Caspase1 siRNA组明显下降,这些关键pyroptosis-related物质与高雅集团(数字4 (c)和4 (d))。
3.5。巨噬细胞Pyroptosis移植肝纤维化标志物Cocultured与滑膜成纤维细胞的表达
coculture 48小时后,信使rna和蛋白质的表达TGF -β,COL1A1 PLOD2和TIMP1滑膜成纤维细胞被发现。这些纤维化标记显示显著upregulation高雅组与正常组相比,相比差别和对这些siRNA GSDMD集团(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
目前的研究表明,滑膜巨噬细胞pyroptosis参与高雅的病理过程。抑制滑膜巨噬细胞在洋槐pyroptosis减轻滑膜炎症和纤维化。ACLT手术进行构造高雅模型大鼠。从Hulth ACLT修改方法和广泛用于建模高雅。ACLT导致关节的稳定性,从而诱发软骨变性,软骨下骨硬化、骨赘形成,模仿了病理变化观察到人类OA (22]。这种方法不如Hulth方法创伤和生理结构变化和发展迅速而少米娅方法(23]。因此,它更适合本研究的。
我们发现pyroptosis发生在滑膜巨噬细胞通过比较滑膜组织有或没有滑膜巨噬细胞的损耗。我们还进行了一系列的定量研究表明,滑膜巨噬细胞pyroptosis体内滑膜炎和纤维化有关。此外,我们发现纤维化标志物的高表达引起pyroptosis通过巨噬细胞和滑膜成纤维细胞cocultured体外。因为高雅的症状是滑膜炎的严重程度直接相关和纤维化,本文的结果可能表明小说角色滑膜巨噬细胞在高雅的发病机理。
巨噬细胞发挥着至关重要的作用在高雅和滑膜巨噬细胞活动的进展及其介质在OA被认为是潜在的治疗靶点。而暴露在炎症条件下,巨噬细胞会激活并可能获得表型,从促炎(M1)抗炎(M2)表型(24]。Utomo等人证明了巨噬细胞表型调制可以用来指导关节炎症。此外,该小组还证明软骨炎症和变性可以增强通过upregulation M1巨噬细胞il - 1βil - 6, MMP-13, ADAMTS-5 [25,26]。越来越多的证据表明,巨噬细胞在不同组织pyroptosis如肝、肾、气道组织参与慢性无菌性炎症,可以组织纤维化有关。也是公认的乳沟GSDMD在pyroptosis[中起着至关重要的作用16- - - - - -18]。规范的途径,pyroptosis可能需要两步机制。在第一阶段,促炎介质pro-IL-1β,caspase1 pro-IL-18和NLRP家庭成员产生的转录。第二阶段是激活,包括NLRP inflammasomes组装和caspase1激活。激活caspase1 pro-IL-1进一步的原因β和pro-IL-18成熟和诱发pyroptosis根据解理GSDMD [11]。与规范的途径不同,caspase1可以直接感应激活细胞内有限合伙人和通过促进pyroptosis GSDMD劈理;这就是所谓的经典之中通路pyroptosis [27]。Pyroptosis原因快速质膜破裂,导致细胞内的促炎介质的释放il - 1β地震,HMGB1 [28]。摘要caspase1 mRNA和蛋白表达,NLRP3, ASC, GSDMD高雅滑膜组织导致重大upregulation与正常组相比。同时,巨噬细胞的损耗与Clodronate脂质体,这些差别高雅+ CL组显示对这些pyroptosis-related蛋白质与高雅。此外,有限合伙人+ ATP-treated巨噬细胞显示pyroptotic细胞数量的增加和NLRP3的蛋白表达,ASC, GSDMD, GSDMD-N与正常组相比,这一趋势可以由siRNA caspase1逆转。最重要的证据表明pyroptosis发生在滑膜巨噬细胞的高雅。
il - 1β和地震不仅pyroptosis的下游产品,但也有炎症的重要推动者。il - 1β,以及HMGB1作为门房的炎症和直接导致滑膜炎症。为了观察巨噬细胞之间的关系pyroptosis滑膜炎,他进行染色。Caspase1-inhibitor-treated老鼠(洋槐+美国青年代表大会组)显示一个更有序的安排衬里的滑膜细胞和炎性细胞浸润。此外,信使rna和蛋白质表达il - 1β地震,HMGB1在高雅+美国青年代表大会组降低。他们不仅指标滑膜炎,但也为pyroptosis下游的证据。因此,我们推测,滑膜巨噬细胞pyroptosis可以促进滑膜炎,从而进一步高雅进展。
响应TGF -β是一个关键事件在滑膜纤维化的发病29日]。雪等人证明,smad4沉默可以抑制慢性炎症和纤维化在关节组织通过抑制TGF -β/ Smad通路,可以发挥积极作用在关节刚度的预防和治疗30.]。此外,基因的表达PLOD2 COL1A1,在OA和TIMP1调节成纤维细胞与TGF -刺激β和老鼠TGF -β全身的纤维化(31日]。因此,我们首先测量横向直径合适的膝盖量化膝盖肿胀的程度执行老鼠和小天狼星红染色观察胶原沉积。然后,我们测量mRNA和蛋白表达TGF -β、PLOD2 COL1A1和TIMP1评估纤维化滑膜。洋槐+美国青年代表大会组织这些profibrotic差别显示对这些物质与高雅。随后,滑膜的滑膜成纤维细胞是主要的效应细胞纤维化,我们建立了一个coculture模型的巨噬细胞和滑膜成纤维细胞。coculture 48小时后,信使rna和蛋白质的表达TGF -β,COL1A1 PLOD2和TIMP1滑膜成纤维细胞显示显著upregulation高雅组与正常组相比差别和对这些核GSDMD组。因此,我们推测,抑制滑膜巨噬细胞pyroptosis可以减轻纤维化。
目前的研究仍有一些限制。首先,由于实验条件的限制,我们未能提取直接从滑膜组织巨噬细胞。我们已经尝试的方法排序的磁珠,但获得滑膜巨噬细胞的数量很小。幸运的是,巨噬细胞的提取从腹膜渗出液作为一种替代方法已被许多研究人员支持(32- - - - - -34]。在临床研究中,巨噬细胞在外周血高雅的病人通常用作代替滑膜巨噬细胞。其次,实验动物的样本规模会更大,如果可能的话。未来的研究将集中于探索医学单体可以抑制pyroptosis为了减轻滑膜炎和纤维化高雅。
5。结论
总之,尽管存在一些限制,本研究还证明了pyroptosis滑膜巨噬细胞发生发展的高雅的老鼠,这在一定程度上解释了高雅的发病机理。此外,研究还表明,滑膜巨噬细胞可能是一个有效的目标治疗膝骨关节炎滑膜炎和纤维化。的抑制滑膜巨噬细胞pyroptosis减轻滑膜炎和纤维化高雅;因此,它提供了一个高雅的临床治疗的新目标。
缩写
| 高雅: | 膝骨关节炎 |
| 读者: | 呈synoviocytes |
| NLRP: | nod样受体蛋白质 |
| ASC: | 凋亡和speck-like蛋白质caspase-recruitment域 |
| GSDMD: | Gasdermin D |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| ATP: | 三磷酸腺苷 |
| siRNAs: | 小干扰rna |
| HIF-1α: | 低氧factors-1α |
| TGF -β: | 转化生长因子-β |
| PLOD2: | Procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 |
| COL1A1: | 胶原蛋白I型α1链 |
| TIMP1: | 的金属蛋白酶组织抑制剂1。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
所有作者声明没有实际或潜在的利益冲突,包括任何金融、个人、或其他关系与他人或组织不当影响,或被认为影响我们的工作。
确认
目前的工作是由中国国家自然科学基金(81573993和81573993号),中药的主要人才项目(SLJ0207)和种植项目的南京中医药大学附属医院(Y17001)。