文摘
circRNA CDR1as (CDR1as)已被证实能扮演重要角色在各种炎症相关的疾病通过扮演microrna的海绵。本研究旨在调查的潜在角色CDR1as人类牙周韧带干细胞的增殖(PDLSCs)引起的炎症条件下Porphyromonas gingivalis派生的脂多糖(LPS)。人牙周韧带细胞(液晶)隔绝牙周韧带组织,从液晶和PDLSCs排序基于STRO-1表达式通过fluorescence-activated细胞排序。我们进一步发现CDR1as显著下调LPS-treated PDLSCs比未经处理的细胞,以及在正常牙周韧带组织相比,牙周炎组织。击倒PDLSCs CDR1as提升LPS-induced增殖抑制,而过度的CDR1as缓解PDLSCs LPS-induced增殖能力。从力学上看,CDR1as充当一个miR-7海绵激活ERK信号通路调节抑制LPS对细胞增殖的影响。综上所述,我们的研究结果显示的影响相互作用的一对CDR1as / miR-7 PDLSCs的扩散能力在他们周围牙周炎的炎症微环境。
1。介绍
牙周炎是最常见的慢性炎症性疾病的tooth-supporting组织引起的龈下的斑块的累积和特定periodontopathogenic细菌的作用1]。Porphyromonas gingivalis(p . gingivalis)的一个主要细菌与慢性牙周炎(2]。慢性牙周炎导致牙周韧带的破坏,牙骨质和骨(3]。牙周韧带干细胞(PDLSCs)是一个独特的人口间充质干细胞(msc),已经成功地从人类牙周韧带分离研究人员通过不同的方法包括传统塑料的依从性和immunomagnetic选择基于MSC-associated表面标记物的表达STRO-1抗原,CD146, CD29、CD44、CD106 [4]。PDLSCs展览成骨潜能诱导体外培养条件下和PDLSCs移植疗法在动物模型5]。PDLSCs已经显示出典型的牙周组织再生ligament-like组织受到牙周炎(6),这对牙周组织再生提供了新的前景。牙周组织再生与细胞增殖的能力有着密切关系,msc的迁移、分化和骨的/ dentinogenic炎症利基(7]。在执行他们的牙周组织再生活动炎症被认为是组织损伤的原因,PDLSCs与周围的炎性微环境(4]。因此,拯救msc的受损的功能,如增殖能力,在治疗牙周炎是关键,特别是在独立于外源性msc。
圆形rna (circRNAs)构成小说类的非编码rna扮演重要角色在各种疾病通过中介可变剪接或作为microrna的海绵,如骨关节炎(8,9和动脉粥样硬化10]。新兴证据提供了一个假定的一些circRNAs成骨分化的作用[11]。此外,几个circRNAs预测和识别潜在的角色PDLSCs[骨生成的6]。CDR1as,也称为CiRS-7 miR-7 circRNA海绵,于70年左右确认保存种子匹配miR-7和充当miR-7海绵执行生物功能(12,13]。积累报告建议CDR1as参与各种生理和病理过程通过各种途径。功能的调查表明,CDR1as-miR-7轴可以调节神经系统的发展13],转录和分泌胰岛素的胰岛细胞[14的过程,各种类型的癌症,包括结肠癌、肝细胞癌、黑色素瘤(15]。此外,环状RNA CDR1as调节成骨细胞的分化PDLSCs通过miR-7 / GDF5 / SMAD和p38 MAPK信号通路(16]。进一步功能研究证明CDR1as产生促进或抑制对细胞增殖的影响在不同类型的癌(17- - - - - -19]。因此,有趣的是调查CDR1as是否有潜在的角色规范的扩散PDLSCs再生组织,由牙周炎牙齿受损。
在这项研究中,我们调查的角色CDR1as PDLSCs扩散,以及所涉及的机制,在炎症条件下引起的P gingivalis-derived有限合伙人,革兰氏阴性细菌的外膜的主要组件和相关口腔微环境有害因素。
2。材料和方法
2.1。人类牙周韧带组织收集和主要的细胞培养
人类牙周韧带组织得到来自健康的牙齿矫正目的或病变的牙齿拔牙后慢性牙周炎。这项研究是经当地伦理委员会批准的西安交通大学(西安、陕西,中国),并从捐赠者得到同意。捐赠者都是30到40岁,无系统性疾病。他们没有接受抗生素治疗在过去的3个月。捐赠者是基于视觉的临床诊断和影像学评估牙周组织。组织被轻轻刮掉表面的根,洗净,用剪刀剪成小块,然后切碎的完全使用无菌手术刀叶片,其次是孵化与I型胶原酶在0.75毫克/毫升30分钟来隔离人牙周韧带细胞(液晶)如前所述3]。单细胞悬浮体酶消化和一个过滤器过滤后得到被播种在培养皿中包含10厘米αmem补充15%的边后卫,2更易与谷酰胺,100 U /毫升青霉素和链霉素100毫克/毫升和孵化37°C公司5%2。
2.2。流式细胞术和细胞Fluorescence-Activated排序(流式细胞仪)
主要液晶是首先检查表达式的造血干细胞(HSC) CD34、CD45标记流式细胞术。短暂,在通道3,液晶与货代经常收获和阻塞阻止试剂(Miltenyi研究,赤褐色,CA)在4°C 10分钟。然后,液晶与反CD34-phycoerythrin孵化(PE)或CD45-PE(圣地亚哥BD Pharmingen CA) 20分钟在黑暗中在冰上。洗两次后,细胞在哈佛商学院resuspended / 2%的边后卫(σ)。暂停是一个70毫米尼龙网过滤。分析了样品在FACSCalibur流式细胞分析仪(加利福尼亚州圣何塞,正欲)。
从液晶进一步孤立干细胞,通过immunomagnetic选择排序的主要细胞是单细胞悬液的流式细胞仪基于标记STRO-1 MSC-associated表面抗原的表达。收获细胞孵化与人类MSC积极STRO-1-PE制造商(BD Pharmingen) 20分钟在黑暗中在冰上,其次是洗涤和再悬浮在哈佛商学院/ 2%含有1毫克/毫升7-AAD的边后卫。最后,样品进行了分析和排序BD FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学,NJ)。排序后,STRO-1 +细胞被认为是PDLSCs和维护在完全培养基组成的αmem补充15%的边后卫,2更易与谷酰胺,100 U /毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升、37°C的5%股份2。
2.3。RNA提取和实时定量pcr (RT-qPCR)
从组织总RNA或细胞系使用试剂盒提取试剂(转基因、上海、中国),按照制造商的指示和执行RT-qPCR iQ5光周期计(Bio-Rad大力神,CA)。2−ΔΔCt方法被用来估计的相对表达变化的基因CDR1as miR-7。CDR1as和miR-7规范化的表达水平β肌动蛋白和U6,分别。引物的序列RT-qPCR如下:CDR1as 5 - - - - - -TCTGCTCGTCTTCCAACATC-3(向前)和5 - - - - - -AGATCAGCACACTGGAGACG-3(反向);GAPDH 5 - - - - - -CGACAGCAGCCGCATCTT-3(向前)和5 - - - - - -CCAATACGACCAAATCCGTTG-3(反向);miR-7 5 - - - - - -TGGAAGACTAGTGATTTTGTTG-3(向前)和5 - - - - - -ACGCTGGAAGACTAGTGATTTTG-3(反向);U6, 5 - - - - - -CTCGCTTCGGCAGCACA-3(向前)和5 - - - - - -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3(反向)。
2.4。炎症诱导PDLSCs
炎症诱导,80%汇合的PDLSCs在完全培养基包含培养p . gingivalis派生有限合伙人(Sigma-Aldrich中国有限公司上海)最终浓度的10μ6克/毫升3 h, h,和12 h,根据推荐的浓度,和肿瘤坏死因子-α(TNF -α)治疗细胞释放介质是用作LPS-induced指标免疫反应。
的分泌TNF -α在中使用ELISA测定。PDLSCs在完全培养基培养另一个治疗后24 h有限合伙人。中收集,通过离心分离和细胞碎片取出。肿瘤坏死因子的水平α分泌在中使用的酶联免疫试剂盒测定肿瘤坏死因子-α(Huzhen生物技术有限公司、上海、中国)按照制造商的指示。
2.5。细胞增殖实验
细胞增殖是研究利用细胞计数Kit-8 (CCK-8 Beyotime,中国上海)按照制造商的协议。简单地说,在96孔板的细胞被镀在同一密度 细胞/好,培养为0,1,2,3天。在指定的时间点,CCK-8溶液的介质稀释1:10稀释是添加到每个板是在37°C孵化3小时。吸光度是衡量标(Bio-Rad大力神,CA)的波长450 nm。细胞数量计算引用标准曲线在相同条件下获得的。
2.6。瞬时转染
转染时进行PDLSCs达到70 - 80%的融合使用Lipofectamine 3000(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的协议。miR-7模仿,miR-7抑制剂、si-CDR1as pcdna3.1-circ-mini-CDR1as,和相应的负控制分别转染或cotransfected。收集细胞转染后48 h或72 h mRNA和蛋白检测,分别。所有试剂都是购自GenePharma(上海,中国)。这些RNA oligoribonucleotides的序列如下:miR-7模仿,5 - - - - - -UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3(向前)和5 - - - - - -AACAAAAUCACUAGUCUUCCAUU-3(反向);miR-7抑制剂,5 - - - - - -ACAACAAAAUCACUAGUCUUCCA-3 ;si-CDR1as 5 - - - - - -GGUCUUCUAAUAUCUCCAATT-3(向前)和5 - - - - - -UUGGAGAUAUUAGAAGACCTT-3(反向);miR-NC 5 - - - - - -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 ;和si-NC 5 - - - - - -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3(向前)和5 - - - - - -ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3(反向)。表达质粒表达CDR1as序列DNA3.1 (+) CircRNA迷你向量,杰里米的礼物Wilusz (Addgene质粒# 60648)。
2.7。西方墨点法
总蛋白提取使用PRO-PREP从PDLSCs蛋白质提取解决方案(内含子生物技术有限公司、京畿道、韩国)根据制造商的指示。布拉德福德的蛋白质含量测定简单蛋白质定量工具(转基因)。等量的蛋白质提取物在裂解缓冲受到sds - page 4 - 12%聚丙烯酰胺凝胶然后转移到PVDF膜。膜是孵化主要抗体total-ERK,一夜之间phospho-ERK, GAPDH在4°C。与TBST清洗后,膜与HRP-conjugated孵化二级抗体在室温下2小时。最后,免疫反应性的蛋白质与发射极耦合逻辑检测可视化工具包(Beyotime)。
2.8。统计分析
结果报告为 。所有数据都来自至少三个独立的实验。所有统计分析使用方差分析(、SPSS 11.5, IBM公司,纽约Armonk)。统计上的显著差异被认为是 。
3所示。结果
3.1。隔离和PDLSCs的识别
牙周韧带组织得到来自捐赠者有或没有牙周炎,和临床诊断证实了视觉和影像学评估牙周组织的捐助者。代表x光照片来自捐赠者有或没有牙周炎可以看到在图1。
(一)
(b)
液晶与牙周韧带组织的健康个体拥有长纺锤状形态在相差显微镜检查(图2(一个))。流式细胞仪分析显示,这些孤立的细胞为阴性HSC CD34标记(图2 (b))和CD45(图2 (c))。此外,约45%的这些孤立的细胞表达STRO-1(图2 (d)),一个著名的MSC成骨细胞表面标记区分。获得均匀的干细胞群从这些孤立的细胞,流式细胞仪进行排序STRO-1视为PDLSCs +细胞。排序STRO-1 +人口的纯度> 96%,揭示了postresorting分析(图2 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。CDR1as在炎症条件下PDLSCs表达下调
探索CDR1as的势函数在牙周炎的过程中,我们首先研究了CDR1as的表达水平在人类牙周韧带组织。我们发现CDR1as明显表达下调与牙周炎牙周韧带组织与正常组织相比(图3(一个))。此外,PDLSCs治疗p . gingivalis派生的有限合伙人模仿由于炎症条件p . gingivalis的一个主要细菌与慢性牙周炎有关。促炎细胞因子TNF的表达水平α有限合伙人治疗后显著调节3 h。3 h之间没有区别观察在治疗后6小时,有一个最高的分泌TNF -α在12 h(图3 (b))。因为明显LPS诱导细胞死亡12小时治疗有限合伙人,我们使用了3小时治疗10点μg / ml为后续实验。此外,我们发现两个促炎细胞因子的分泌引发地震和显著调节治疗后在10μ对3 h(图g / ml3 (c)),指示成功的炎症PDLSCs的感应。
(一)
(b)
(c)
(d)
与牙周韧带组织的表达趋势一致,CDR1as表达水平也显著降低PDLSCs炎症条件下比在正常PDLSCs(图3 (d))。这些结果表明,减少表达CDR1as极度参与牙周炎的过程。
3.3。CDR1as介导LPS-Induced PDLSC增殖的抑制作用
CCK-8试验是检查PDLSCs扩散。细胞增殖的标准曲线和数学公式描述OD值和细胞数量在同等条件下(图得到4(一))。播种后的密度在96 -孔板和培养为0,1,2,,3天,PDLSCs LPS处理显著低于没有有限合伙人的细胞治疗在每一天(图表示4 (b)),这表明PDLSCs较低引起的炎症条件下扩散能力有限合伙人比细胞处于正常状态。调查的功能在PDLSCs CDR1as牙周炎的过程中,获得和丧失进行了实验。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
击倒CDR1as的表达,进行转染和表达CDR1as CDR1as下降了大约70%的可拆卸的组比对照组经RT-qPCR分析(图4 (c))。扩散能力下降CDR1as击倒组相比si-NC组治疗后由有限合伙人(图4 (d),对酒吧)。此外,与生长培养基培养时没有LPS处理、扩散能力也减少了CDR1as击倒组相比si-NC组(图4 (d)左栏)。
pcDNA3.1-circ-mini-CDR1as质粒构建,转染PDLSCs。证实了的CDR1as upregulation PDLSCs RT-qPCR(图4 (e))。CDR1as超表达显著提升PDLSC扩散CDR1as组相对于circ-control群over-NC(图4 (f)左栏)。此外,CDR1as超表达部分缓解LPS-induced增殖抑制PDLSCs(图4 (f),对酒吧)。
3.4。CDR1as / miR-7介导LPS-Induced PDLSC增殖的抑制作用
鉴于CDR1as已被证实能充当miR-7海绵执行生物功能(12,13),有可能CDR1as可能涉及LPS-induced增殖抑制PDLSCs通过抑制miR-7活动。
我们首先研究了是否miR-7介导LPS-induced PDLSC增殖的抑制作用。要验证这一点,我们实验中过表达或推翻miR-7 miR-7模仿或抑制剂PDLSCs的转染。RT-qPCR结果表明miR-7有效增加miR-7模仿组和显著降低miR-7抑制组miR-NC相比对照组(图5(一个))。增殖能力下降在miR-7超表达组和增加miR-7击倒组有限合伙人治疗后(图5 (b)),这表明miR-7做调解LPS-induced PDLSC增殖的抑制作用。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
据报道,针对miR-7抑制细胞增殖的ERK信号通路(20.,21]。验证是否ERK活化作为下游miR-7的目标,激活ERK的调查研究磷酸化的蛋白表达和总ERK在PDLSCs转染miR-7模仿或抑制剂。免疫印迹结果表明miR-7模仿抑制phosphor-ERK表达式,同时miR-7抑制剂增强其表达水平与这些细胞相比,PDLSCs miR-NC组(图5 (c))。
进一步证明细胞增殖之间的链接,CDR1as / miR-7兵,我们检查的表达式phospho-ERK和total-ERK PDLSCs cotransfected si-CDR1as和miR-7模仿或miR-7抑制剂。我们发现cotransfection miR-7抑制剂与si-CDR1as部分缓解si-CDR1as-induced phospho-ERK表达的增加,和cotransfection miR-7模仿与si-CDR1as稍微增强的抑制作用si-CDR1as phospho-ERK表达式在PDLSCs(图5 (d))。此外,细胞增殖能力的细胞cotransfected PDLSCs增加si-CDR1as和miR-7抑制剂,而在细胞减少cotransfected si-CDR1as和miR-7模仿相比细胞转染si-CDR1as(图5 (e))。
4所示。讨论
PDLSCs msc的一个独特的人口拥有的能力来生成牙骨质、牙周ligament-like结构(22]。因此,PDLSCs为小说的发展提供潜在的细胞疗法治疗创伤造成的损害或牙周疾病,如牙周炎(23]。最近的发现表明,特定circRNAs可能函数作为内源性rna促进PDLSC牙周再生(6]。在这项研究中,circRNA CDR1as证明LPS-induced炎症条件下调节扩散骗取miR-7激活ERK信号通路。
PDLSCs已经分离出人类牙周韧带组织通过使用至少两种方法,包括传统塑料的依从性和immunomagnetic选择表达式的基础上MSC-associated表面标记(22]。虽然没有表明特异性抗体对msc、STRO-1是相关的所有研究的常用标记PDLSC隔离(4]。在这项研究中,我们孤立STRO-1 +细胞,流式细胞仪同质PDLSCs人口。所有这些细胞HSC被排除在外的消极HSC CD45标记和CD34的表达,他们表现出MSC-like形态学描述时首先确定(24]。时牙周组织再生过程中炎症被认为是组织损伤的原因,PDLSCs与周围的炎性微环境相互作用,这可能影响他们的命运,包括具备干细胞增殖、迁移、分化、和免疫调节属性,可能潜在的细胞内机制,和任何牙周干细胞再生活动的结果25]。p . gingivalis是一个主要的革兰氏阴性细菌与慢性牙周炎(2]。有限合伙人,革兰氏阴性细菌外膜的主要组成部分,是一个有关口腔微环境有害因素(26]。在这里,我们发现p . gingivalis -派生的有限合伙人治疗能够PDLSCs在炎症条件下,所表示的高蛋白质的分泌TNF -α由PDLSCs,引发地震。
CDR1as已被证实能影响生物功能作为一个microrna的海绵或抑制剂的miR-7 [13),其功能是澄清调节成骨细胞的分化PDLSCs通过miR-7 / GDF5 / SMAD和p38 MAPK信号通路(16]。但CDR1as是否有其他功能尚未阐明。在这项研究中,我们证实CDR1as表达下调与牙周炎牙周韧带组织以及PDLSCs引起的炎症状态下p . gingivalis派生的有限合伙人与相应的同行相比,表明CDR1as可能调解牙周炎和有潜力的过程对PDLSCs的功能或特性的影响。正如我们所料,CDR1as介导LPS-induced PDLSC增殖抑制由增益和损失函数实验证实CDR1as。PDLSCs CDR1as过度缓解LPS-induced增殖抑制,而CDR1as击倒增强这种抑制效应。鉴于CDR1as函数作为上游miR-7 [16,27针对]和miR-7抑制细胞增殖的ERK信号通路(20.,21),我们进一步研究了CDR1as介导的机制LPS-induced PDLSCs的增殖抑制。机械,我们发现CDR1as充当miR-7海绵激活ERK信号通路促进PDLSC扩散。这些发现强调的功能角色CDR1as / miR-7 PDLSCs处于炎症状态。
缩写
| CDR1as: | circRNA CDR1as |
| PDLSCs: | 牙周韧带干细胞 |
| p . gingivalis: | Porphyromonas gingivalis |
| 有限合伙人: | 脂多糖 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α |
| 硕士: | 间充质干细胞 |
| IL: | 白介素。 |
数据可用性
没有数据被用来支持本研究。
的利益冲突
作者宣称他们没有竞争的经济利益。
作者的贡献
王芳和吴Guofeng参与的设计研究。王芳,习副主席陈应汉,习霜进行了实验和分析数据。王芳和习近平陈起草了手稿。王芳提供研究经费,吴Guofeng修订后的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。王芳和ξ陈了同样的工作。
确认
基础研究基金支持的研究是中央大学(2108号xjj166),陕西省卫生委员会的科研项目(2016号d017)和陕西的主要研究和开发项目(2017 sf - 106)。