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特殊的问题

树突细胞:传染病和自体免疫的免疫反应

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2018年 |文章的ID 9368295 | https://doi.org/10.1155/2018/9368295

亨瑞特损失,Jorg r·奥森巴哈Karsten Tedin,弗雷德里克•it Ulrike Lodemann, ”产肠毒素的炎症反应大肠杆菌和益生菌大肠都有效在Coculture猪肠道上皮细胞和树突细胞模型”,炎症介质, 卷。2018年, 文章的ID9368295, 16 页面, 2018年。 https://doi.org/10.1155/2018/9368295

产肠毒素的炎症反应大肠杆菌和益生菌大肠都有效在Coculture猪肠道上皮细胞和树突细胞模型

亨瑞特损失,1 Jorg r·奥森巴哈,1 卡斯滕Tedin,2 Friederike it,3 和 Ulrike Lodemann1

1兽医学院生理学、柏林自由大学兽医学系Oertzenweg 19 b, 14163年柏林,德国

2研究所的微生物学和传染病之一,柏林自由大学,Robert-von-Ostertag-Str兽医学系。7 - 13,14163年柏林,德国

3免疫学研究所Robert-von-Ostertag-Str柏林自由大学兽医学系。7 - 13,14163年柏林,德国

客座编辑:Renata Sesti-Costa
收到了 2018年8月22日
接受 2018年10月23日
发表 2018年12月20日

文摘

肠道上皮构成肠道内容和底层之间的一个接口内脏相关淋巴组织(GALT)包括树突细胞(DC)。肠上皮细胞的相互作用(IEC)和居民DC具有双向相声由各种因素,如转化生长因子-β(TGF -β),胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)。在目前的研究中,我们的目的是(1)模型在猪细胞的相互作用在体外coculture组成的IEC(细胞系IPEC-J2)和monocyte-derived直流(MoDC)和(2)评估免疫反应的细菌是否改变因为IPEC-J2细胞之间的相互作用和MoDC。对于后者,我们专注于inflammasome通路。在这里,我们建议caspase-13作为一个有前途的候选人为经典之中inflammasome激活在猪身上。我们进行了实验与产肠毒素的挑战大肠杆菌(ETEC)和益生菌肠球菌都有效(大肠都有效)NCIMB 10415。作为潜在的IEC /直流介质相互作用,TGF -β和TSLP选择分析。Cocultured MoDC显示减毒ETEC-induced inflammasome-related和促炎白介素8 (IL)反应而MoDC单一栽培。Caspase-13更强烈表达IPEC-J2细胞cocultured MoDC和ETEC孵化。我们发现IPEC-J2细胞和MoDC能够释放TSLP。当后者细胞分泌大量的胸腺基质淋巴细胞生成素cocultured IPEC-J2细胞。TGF -β没有调制在目前的实验条件下两种细胞类型。我们得出结论,在IPEC-J2细胞的存在,猪MoDC展出更多的耐受性表型,可能部分受到自分泌TSLP生产。经典之中inflammasome信号调制在IPEC-J2细胞。我们的研究结果表明,肠道上皮和高尔特的互惠的相互作用是至关重要的促进平衡的免疫反应。

1。介绍

肠上皮细胞衬肠道黏膜持续不断地暴露在各种有害抗原和建立一个物理接口,分离腔的内容从宿主环境(1]。在肠道中发现的固有层,牙龈丘地区的派尔集合淋巴结补丁,和单独淋巴结如肠系膜淋巴结(2- - - - - -4]。在肠上皮细胞之间的动态通信系统和粘膜免疫细胞,IEC直接居民DC的功能通过释放免疫介质,如监管细胞因子TGF -β和TSLP5,6]。肠道DC和IEC都是至关重要的维持正常屏障功能,因为它们支持炎症之间的歧视和耐受性免疫反应(7,8]。因此,肠道上皮细胞的功能属性不能完全理解使用在体外模型中上皮细胞仅成长为单一栽培[7]。我们的目标是重建肠道环境在体外通过实现的存在MoDC牙龈隔间的猪空肠上皮细胞系生长在细胞培养Transwell系统的插入。

因为腔的微生物群也参与相声(9,10),我们假设IEC和免疫细胞的炎症反应模式,不同类型的细菌是相互影响相互作用的细胞。因此,致病性ETEC毒株经常导致仔猪断奶腹泻(11,12)和一个apathogenic大肠都有效包括研究设计的压力。益生菌在猪身上大肠都有效NCIMB 10415,用作饲料添加剂对母猪和小猪,曾被证实施加不同的有利影响免疫系统和性能参数在体外(13- - - - - -15),在活的有机体内(16- - - - - -19),尤其是在断奶期间。

我们旨在揭开炎症反应的变化IEC和coculture条件下直流信号通过inflammasome通路。核苷酸寡聚化域(点头)——细胞内的受体(NLR)代表一个类模式识别受体(PRR),其中一些能够形成inflammasomes [20.]。著名inflammasome-forming受体家族的成员NLRP3 (NLR家庭,pyrin域包含3)(21]。其他刺激,NLRP3 inflammasome可以激活通过细菌感染22]。规范和经典之中inflammasome激活可以区分关于inflammasome信号的特征23]。在规范inflammasome激活,效应caspase-1导致生产和分泌的促炎细胞因子il - 1β和地震24]。相比之下,经典之中inflammasome激活caspase-1以外的要求还存在物种特异性炎症,尤其是caspase-11小鼠(25和人类caspase-4和526,27]。牛caspase-13认为代表人类的直接同源caspase-4 [28]。基于这些结果,我们建议caspase-13施加类似的函数在猪身上。经典之中inflammasome激活已经证明对各种革兰氏阴性细菌,如霍乱弧菌,大肠杆菌(大肠杆菌),沙门氏菌沙门氏菌感染(25,29日]。大多数inflammasome研究在人类和小鼠模型进行,但猪inflammasome途径缺乏深入了解。特别是,不存在研究关于经典之中inflammasome激活在猪身上。进一步假设进行本研究猪caspase-13参与中的inflammasome激活在猪身上。

2。材料和方法

2.1。猪小肠上皮细胞

细胞行IPEC-J2被用作猪肠道上皮细胞模型。细胞系最初源自于空肠提供的新生的小猪,请教授安东尼Blikslager(美国北卡罗莱纳州立大学)。细胞培养所描述的其他地方(15]。媒介改变了每周3次。每7天,细胞分裂的比率1:3。段落之间的73年和80年被包括在实验。IPEC-J2细胞被播种的顶面collagenized细胞培养的插入12-well Transwell系统(12毫米直径1.12厘米2增长的表面积,0.4μm孔隙大小,配角,康宁BV, Schiphol-Rijk、荷兰)1×10的密度5每个细胞培养细胞插入。细胞培养在湿润的气氛中5%的有限公司2在37°C,直到达到confluency 14 - 21天。

2.2。代Monocyte-Derived树突细胞

血从传统饲养Danbred×大猪(10到12周的年龄)保存在动物营养研究所(德国柏林自由大学)或从临床健康猪在勃兰登堡的屠宰场,德国。血液样本收集过程是按照指南进行动物福利和动物福利伦理委员会批准,即“Landesamt毛皮和Soziales一厢情愿”(LaGeSo柏林,没有。T0264/15)。血液样本被收集在9毫升乙二胺tetra-acetic酸(EDTA)涂血管(S-Monovette®, SARSTEDT, Numbrecht,德国)。

外周血单核细胞(PBMC)是由密度梯度离心法纯化所描述的损失等。30.)通过使用Ficoll-Paque™+ (1.077 g / l,通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。单核细胞随后被丰富了磁标签根据CD14表达和随后的细胞分选MidiMACS分离器和LS分离列(从Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)。CD14+单核细胞被稀释在rpmi - 1640 (Biochrom,柏林,德国)补充10%胎牛血清(FCS Biochrom), 100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(Sigma-Aldrich化学GmbH)。细胞被播种密度为1.44×106细胞/毫升,1毫升/ 12-well细胞培养板(TPP,浮士德实验室、Klettgau、德国或埃普多夫GmbH,汉堡,德国)。MoDC区分单核细胞,细胞补充与重组猪(rp)集落刺激因子(gm - csf, 20 ng / ml)和il - 4卢比(50 ng / ml;从研发系统,明尼阿波利斯,美国)。细胞生长在37°C下5%的调湿大气CO26天。3天后,细胞被美联储与另一个1毫升新鲜分化培养基。6天,附着不成熟MoDC用于实验。为了确保成功的分化,细胞的形态和表型特征被相衬显微镜检查(徕卡DMI 6000系列,徕卡微系统,海德堡,德国)和流式细胞术。流仪表型特征进行描述的其他地方(30.]。短暂,单克隆抗体反CD14分子(克隆REA599,同形像IgG1, Miltenyi研究),anti-pig CD16(克隆七国集团(G7),同形像IgG1, Bio-Rad实验室GmbH,慕尼黑,德国),anti-pig CD1(克隆76-7-4,同形像IgG2ακSouthernBiotech剑桥,英国),anti-pig猪白细胞抗原(SLA) II(克隆K274.3G8,同形像IgG1,主要组织相容性复合体(MHC) II, Bio-Rad实验室GmbH)。成功分化被认为是发生在细胞显示DC形态和测试是CD14特征+CD16+CD1+SLA+。

2.3。菌株

两个不同的菌株被用于实验:益生菌菌株大肠都有效NCIMB 10415 (Cylactin®、DSM Kaiseraugst,瑞士)和产肠毒素的大肠杆菌IMT4818(孤立从降生仔猪腹泻,O149: K91: K88 [F4])。大肠都有效和ETEC是生长在BHI(脑心浸液)和磅(Luria-Bertani)琼脂板,分别。在孵化后,大肠都有效是生长在BHI肉汤(OXOID GmbH, Wesel,德国)和ETEC磅中含10 g / l胰蛋白胨,5 g / l酵母提取物,和10 g / l氯化钠,在pH值7.0(罗斯,卡尔斯鲁厄,德国)。每个菌株培养在37°C到midlog阶段了。细菌被离心机和洗两次冷PBS。之前除了IPEC-J2细胞,细菌在血清稀释,不需抗生素IPEC-J2细胞培养基的浓度大约108菌落(CFU) /毫升。为他们的应用程序到MoDC隔间,rpmi - 1640用于再悬浮细菌细胞的浓度大约107CFU /毫升。为了量化细菌浓度、光密度(OD)测量的波长600 nm Helios™ε分光光度计(热科学,罗克福德,IL)。此外,稀释系列是用磅平皿上后续CFU计数。

2.4。Coculture模型和实验设计(图1)
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图1
实验设计的原理说明。(a) IPEC-J2单一栽培种植Transwell的顶部表面的单层细胞培养插入。细菌被添加到IPEC-J2隔间。(b) MoDC单一栽培在12-well细胞培养板培养。细菌被添加到MoDC隔间。(c)——(d) Cocultures IPEC-J2 Transwell插入细胞生长和附着MoDC位于舱底部。在不同的方法,增加了细菌(c) IPEC-J2舱或MoDC舱(d)。闪电表明细菌挑战的本地化大肠都有效或ETEC。

在目前的研究中,包括IPEC-J2细胞和猪MoDC coculture模型利用如图1 (c)和1 (d)。为此,Transwell插入与支流IPEC-J2层生长在他们的顶面被转移到包含底部附着MoDC 12-well文化板块。实验前的那天,每个细胞类型再辅以适当的细胞培养基。在coculture 24 h后,上述菌株的细胞被质疑。

细菌感染之前,FCS -和penicillin-streptomycin-supplemented媒体从细胞培养中删除,取而代之的是血清,不需抗生素IPEC-J2或MoDC细胞培养基,分别与上述适当的细胞被洗后媒体。

实验,细胞被孵化的益生菌大肠都有效应变或者致病性ETEC毒株。数量根据不同细胞类型的细菌感染。IPEC-J2 / MoDC cocultures孵化了细菌通过添加1×106CFU /插入IPEC-J2隔间的文化或5.4×104CFU / MoDC舱(数据1 (c)和1 (d))。适合的应用细菌浓度在初步评估实验。

除了IPEC-J2 / MoDC cocultures,单一栽培的IPEC-J2细胞或MoDC也包括控制评估共培养的影响反应的每一个细胞类型(数据1(一)和1 (b))。

为了完整性,我们检测了免疫反应直接孵化后的菌株(比较mono -vs。coculture),以及间接后细菌培养。在这些化验,我们另外的炎症反应评估cocultured IPEC-J2细胞当MoDC被挑战反之亦然。因此,一个在活的有机体内——情况区分单个细菌的顶端或基底外侧出现模拟。预期更高的流明比牙龈细菌负荷的空间也是如上所述建模;这必须考虑到当解释的结果间接挑战。

为了防止细菌过度生长,细胞用gentamicin-containing中等(150μg / ml, Biochrom) 2 h后细菌培养。中被替换为媒介与庆大霉素补充最后的50浓度μ克/毫升。这种介质改变后,细胞孵化为进一步4 h。

2.5。Transepithelial电阻(te)测量

transepithelial电阻(te)跨在Transwell IPEC-J2层测量系统通过使用Millicell-ERS(电阻系统、微孔GmbH Schwalbach,德国)。在实验过程中,t形测量每两个小时(在细菌加法和2 h, 4 h,和6 h(孵化)。t值修正对空白控制(颗粒细胞培养插入介质)和膜区。对于每一个实验条件,三个井使用。结果报告(Ω×厘米2]。

2.6。实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

执行mRNA表达分析,样本收集RT-qPCR 6 h后细菌之外。MoDC PBS和IPEC-J2细胞被洗冷,刮收获,存储在RNA晚些时候RNA稳定剂(试剂盒GmbH是一家现代化、希尔登,德国)−20°C。隔离的RNA及其定量和定性分析所描述的Kern et al。14]。样本时使用RNA完整性数量高于或等于8。整除的100 ng总RNA reverse-transcribed进cDNA Mastercycler™Nexus梯度(埃普多夫GmbH)通过使用iScript™互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad实验室GmbH)。所有引物合成了RT-qPCR欧陆坊MWG合成GmbH (Ebersberg,德国)。在初步实验中,各种参考基因验证细胞系利用ge-Norm®软件。三个参考基因选择标准化(MoDC: tata结合蛋白(真沸点),酪氨酸3-monooxygenase /色氨酸5-monooxygenase激活蛋白泽塔(YWHAZ)和beta-2-microglobulin [B2M];IPEC-J2:真沸点、YWHAZ glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH))。目标和参考基因引物信息表1。RT-qPCR进行在一个iCycler智商™实时PCR检测系统(Bio-Rad实验室GmbH)通过使用SYBR绿色我检测。样本一式三份。最后的体积反应(20μl)是由智商SYBR绿色Supermix (Bio-Rad实验室GmbH),引物(0.38μ20 pmol / lμl) 5μl的互补。inter-run校准样品是用于正确运行的变化。检查可能的基因组DNA污染,minus-reverse转录酶控制被包含在实验。软件iQ5 (Bio-Rad实验室GmbH)是利用计算通过使用ΔΔCt目标基因的相对表达方法。
基因信息 引物序列 扩增子的长度 加入数量 参考
IL1B1(interleukin-1 beta 1,野猪) (S) 5 - - - - - -有条件现金援助有条件现金援助CCC gg有条件现金援助TCT GT 3
()5 - - - - - -GGG CCA GCC阿克查CTA呕吐3 		178个基点 (31日]
地震-(interleukin-18野猪) (S) 5 - - - - - -ACG ATG亚美大陆煤层气有限公司ACC TGG AAT CG 3
()5 - - - - - -GCC AGA有条件现金援助CTA GTG gg CTA 3 		205个基点 AF191088.1
NLRP3(NLR家庭,pyrin域包含3,野猪) (S) 5 - - - - - -AGC AGA TTC CAG TGC ATC AAA 3 G
()5 - - - - - -有条件现金援助GGT棉酚GCG TTT GTT GAG-3 		75个基点 NM_001256770.2 (32]
NLRC4(NLR家族,卡域包含4,野猪) (S) 5 - - - - - -TGC TCT棉酚ACA有条件现金援助TGC 3
()5 - - - - - -GCA标记攻击力有条件现金援助GCC太极拳AG) 3 		92个基点 XM_013987922.1
CASP13(caspase-13 apoptosis-related半胱氨酸肽酶,野猪) (S) 5 - - - - - -GTG CTA CAG AAA公司治理文化猫GA 3
()5 - - - - - -gg GCA亚美大陆煤层气有限公司总部GAG GGT在3 		150个基点 XM_003129812.6
CASP1(caspase-1 apoptosis-related半胱氨酸肽酶,野猪) (S) 5 - - - - - -CTC太极拳ACA GGT柠檬酸CAA TC 3
()5 - - - - - -棉酚广汽GCA GGC TTA GG 3 		116个基点 NM_214162 (33]
ASC (LOC100522011)(凋亡speck-like蛋白质包含一个卡,野猪) (S) 5 - - - - - -在20 ACG AGC柠檬酸AGA AGT TT 3
()5 - - - - - -AGC柠檬酸GCG CTG TAC苑3 TC 		154个基点 XM_003124468.4
引发(interleukin-8野猪) (S) 5 - - - - - -GGC AGT TTT有条件现金援助GCT TTC T 3
()5 - - - - - -CAG TGG GGT CCA CTC柠檬酸在3 		154个基点 X61151 (34]
TLR4(toll样受体4野猪) (S) 5 - - - - - -AGA法GCA GGT GCT GGA TT 3
()5 - - - - - -gg TTT GTC柠檬酸ACG GCA交流3 		180个基点 AB188301
TGF-β(转化生长因子β野猪) (S) 5 - - - - - -TGA CCC GCA GAG gg CTA助教3
()5 - - - - - -猫插科打诨插科打诨CAG棉酚GGG C 3 		164个基点 NM_214015.2
真沸点(TATA框结合蛋白,野猪) (S) 5 - - - - - -手枪GGA CGT TCG GTT标签3 G
()5 - - - - - -自动增益控制AGC ACA侠盗猎车手注册会计师GCA 3 		124个基点 DQ178129 (35]
YWHAZ(酪氨酸3-monooxygenase /色氨酸5-monooxygenase激活蛋白质、ζ多肽,野猪) (S) 5 - - - - - -ATG CAA CCA ACA猫有条件现金援助ATC 3
()5 - - - - - -GCA TTA TTA GCG TGC TGT CTT 3 		178个基点 DQ178130 (35]
B2M(beta-2-microglobulin野猪) (S) 5 - - - - - -AAA CGG AAA GCC AAA TTA CC 3
()5 - - - - - -ATC CAC AGC GTT gg AGT GA 3 		178个基点 DQ178123 (35]
GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶,野猪) (S) 5 - - - - - -行动CAC TCT TCT ACC TTT手枪GCT 3
()5 - - - - - -TGT TGC TGT AGC CAA攻击力CA 3 		100个基点 DQ178124 (35]
表1
寡核苷酸引物,扩增子PCR产品的长度。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)

分析细胞因子释放MoDC或IPEC-J2细胞,通过细胞培养上清液收集后6 h细菌,离心5分钟(6000 rpm),并存储在−80°C到使用。il - 1β引发,TGF -β,TSLP使用下面的ELISA试剂盒测定浓度根据制造商的指示:猪il - 1βELISA (Quantikine ELISA,猪il - 1β/ IL-1F2免疫测定、研发系统),猪引发ELISA(表达载体酶联免疫试剂盒,猪引发,英杰公司生命技术GmbH),猪TGF -βELISA (Quantikine ELISA,猪TGF -β1免疫测定、研发系统)和猪TSLP ELISA(酶联免疫试剂盒,猪胸腺基质淋巴细胞生成素BlueGene,上海,中国。标(EnSpire多模板读者,珀金埃尔默,Rodgau,德国)来测量吸光度值和计算OD-specific样品浓度的标准曲线用四个参数逻辑斯蒂曲线拟合。结果报告(pg / ml)。

2.8。统计分析

统计分析和图表的创建是由使用SigmaPlot 11.0为Windows (Systat软件公司,圣何塞、钙、美国)。统计学意义上的差异的各种治疗组进行双向重复测量方差分析(方差分析)因素“细菌”(“控制”、“大肠都有效”、“ETEC”)和“文化”(“IPEC-J2单作”/“MoDC单一文化”,“coculture IPEC-J2挑战”,和“coculture MoDC挑战”)。除了这两个主要的影响的分析,我们还测试了这两个因素之间的相互作用。如果发生相互作用,比较在不同治疗组的因素“细菌”是为每个条件和“文化”反之亦然。结果被认为是重要的时候 。当整体分析每个单元格的数据类型和特定参数(三通、信使核糖核酸或蛋白质表达)显示统计差异治疗组(包括交互),费舍尔有显著差异事后进行了测试。提出了在数据,结果意味着±标准错误的方法(SEM)。

3所示。结果

3.1。三通

实验过程中,t值测量IPEC-J2单层膜的四个时间点,以便监控屏障完整性(图2)。除了cocultures,三通也确定相应IPEC-J2单一栽培。如图2(一个),最初的t值cocultures没有差别的IPEC-J2单一栽培在细菌的挑战。

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图2
Transepithelial电阻(teΩ×厘米2)刺激后IPEC-J2层大肠都有效(Ecf)或ETEC。在IPEC-J2 / MoDC cocultures,Ecf或添加ETEC IPEC-J2细胞的顶端或MoDC隔间。在IPEC-J2单一栽培,细菌被添加到顶端隔间。三通测量值在0 h, 2 h, 4 h、6 h (a) - (d)。数据表示为±SEM手段。 每条独立的实验。方差分析的结果显示如下图。的结果事后测试是在补充表1。

在IPEC-J2单一栽培,ETEC显著减少了te 2 h后( )(图2 (b)4 h(后), )的孵化(图2 (c))。与挑战cocultures IPEC-J2细胞,这种ETEC效应只是出席2 h后细菌感染( )(图2 (b))。细菌感染的cocultured MoDC并没有发现ETEC-induced一滴te IPEC-J2层在每一个时间点。ETEC不同,大肠都有效治疗导致三通没有修改整个实验周期在每个实验设置。

3.2。在IPEC-J2细胞炎症相关的基因的表达

各种炎症相关的基因的mRNA表达分析在IPEC-J2细胞(下一节和猪MoDC-see)后6 h的细菌刺激。细胞培养与益生菌大肠都有效或致病性ETEC。样本从cocultures或获得相应的单一栽培。

了解潜在的参与inflammasome通路,il - 1β、地震和NLRP3被选为分析inflammasome响应应用菌株。如图3(一个)、mRNA表达il - 1的含量βIPEC-J2细胞仍相当稳定独立的培养方法(cocultures或单一栽培)和细菌的挑战。然而,地震mRNA的表达IPEC-J2细胞一般较高coculture设置当MoDC被挑战而IPEC-J2单一栽培( )(图3 (b))。这种影响是一种趋势,主要是基于与ETEC cocultures挑战更大的值。孵化与致病性ETEC毒株还引发了一场upregulation IPEC-J2 NLRP3 mRNA表达的细胞相比,控制和大肠都有效集团( )(图3 (c))。

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图3
(a)的mRNA表达il - 1β,(b)的地震,(c) NLRP3, (d) caspase-13, (e)引发,(f) TGF -β在IPEC-J2细胞刺激后大肠都有效(Ecf)或ETEC。在IPEC-J2 / MoDC cocultures,Ecf或添加ETEC IPEC-J2细胞的顶端或MoDC隔间。在IPEC-J2单一栽培,细菌被添加到顶端隔间。采集标本后6 h添加细菌(意味着±SEM)。 每条独立的实验。规范化褶皱ΔΔCt表达式计算的方法。方差分析的结果显示如下图。的结果事后测试是在补充表2。

我们假设caspase-13将是一个有前途的候选人针对经典之中inflammasome激活在猪身上。显示在图3 (d),caspase-13 mRNA表达强烈增强ETEC-infected IPEC-J2细胞培养方法(下 )。值得注意的是,观察到在cocultured upregulation更明显比IPEC-J2单一栽培IPEC-J2细胞( )。额外一个有趣的发现是,共培养的IPEC-J2 MoDC(无论感染)随后更高caspase-13 mRNA表达IPEC-J2细胞( )。

进一步阐明经典之中inflammasome IPEC-J2细胞信号通路,我们另外包括以下基因分析:inflammasome-forming NLRC4 (NLR家庭,卡域包含4),适配器ASC(凋亡speck-like蛋白质包含一张卡片),caspase-1, toll样受体(TLR) 4(补充表6和7)。我们发现缺乏NLRC4 mRNA IPEC-J2细胞(补充表6)。同时ASC mRNA表达不规范,caspase-1 mRNA表达调节在cocultured IPEC-J2细胞( )。TLR4 mRNA水平更高ETEC-incubated治疗组( )。

促炎的mRNA表达趋化因子引发IPEC-J2细胞显著增强通过孵化ETEC每种文化条件下( )(图3 (e))。与caspase-13, IPEC-J2细胞的设置cocultured MoDC是治疗细菌表现出最大的ETEC响应( )。

相比之下,大肠都有效治疗没有改变被认为是基因的mRNA表达在实验设计和显示表达水平类似的挑战控制。

调节细胞因子,我们也调查了TGF -的表达β,这是由细菌培养方法和影响孵化IPEC-J2细胞(图所示3 (f))。

3.3。在猪MoDC炎症相关的基因的表达

同样,信使rna在猪MoDC表达进行了研究。表达水平之间的比较cocultured MoDC(与细菌感染的直接或间接挑战IPEC-J2细胞)和MoDC来自单一栽培。

inflammasome-linked基因(il - 1的分析β、地震和NLRP3)显示一个由ETEC upregulation MoDC单独培养( )(数据4(一)- - - - - -4 (c))。影响程度显著,ETEC增强il - 1的mRNA的表达β在挑战、地震和NLRP3 MoDC cocultures ( )。此外,cocultured MoDC仍相对不受细菌的挑战IPEC-J2细胞。同样,ETEC引起肿大caspase-13转录MoDC挑战时在mono -和cocultures ( )(图4 (d))。相比与规范inflammasome相关的基因激活,诱导caspase-13 mRNA增加cocultured MoDC MoDC单一栽培的。

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图4
(a)的mRNA表达il - 1β,(b)的地震,(c) NLRP3, (d) caspase-13, (e)引发,(f) TGF -β在猪MoDC刺激后大肠都有效(Ecf)或ETEC。在IPEC-J2 / MoDC cocultures,Ecf或添加ETEC IPEC-J2细胞的顶端或MoDC隔间。在MoDC单一栽培,细菌被添加到基底外侧隔间。采集标本后6 h添加细菌(意味着±SEM)。 每条独立的实验。规范化褶皱ΔΔCt表达式计算的方法。方差分析的结果显示如下图。的结果事后测试是在补充表3。

引发与il - 1的表达模式β和NLRP3(图4 (e))。最高的响应发现ETEC MoDC单一栽培,而弱ETEC-triggered放大引发的信使rna发生在cocultured MoDC ( )。

暴露在益生菌大肠都有效应变导致只有略有增加的地震- mRNA表达MoDC单独培养( )(图4 (b))。类似的倾向被公认为il - 1βNLRP3,引发mRNA表达没有达到统计学意义(数字4(一),4 (c),4 (e))。

类似于IPEC-J2细胞,抗炎的mRNA表达TGF -β在MoDC没有显示出明显的效果在细菌治疗或栽培技术(图4 (f))。平均而言,最小的表达水平检测IPEC-J2 / MoDC cocultures IPEC-J2细胞被细菌挑战( );这是由于一个数值ETEC-induced减少。

3.4。IPEC-J2细胞分泌的细胞因子

引发的蛋白质分泌il - 1βTGF -β,TSLP进入细胞培养上清液IPEC-J2细胞和猪MoDC(参见下一节)是由ELISA。对选定的细胞因子的分析,样本收集细菌后6 h。

在mono, cocultures挑战IPEC-J2细胞,一个强大的感染引发归因于ETEC的分泌可以观察到( )(图5(一个))。这些结果与qPCR的分析。有趣的是,结果后细菌除了MoDC舱从信使rna蛋白质水平的差异很大。引发的高upregulation mRNA表达无法验证在蛋白质水平。

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图5
蛋白表达(pg / ml) (a) (b)和引发的TSLP ELISA检测的上层清液IPEC-J2细胞刺激后大肠都有效(Ecf)或ETEC。在IPEC-J2 / MoDC cocultures,Ecf或添加ETEC IPEC-J2细胞的顶端或MoDC隔间。在IPEC-J2单一栽培,细菌被添加到顶端隔间。采集标本后6 h添加细菌(意味着±SEM)。 每条独立的实验。方差分析的结果显示如下图。的结果事后测试是在补充表4。

IPEC-J2细胞分泌TSLP,我们提出的是一种很有前途的候选人协调互动IEC / DC相声除了TGF -β,水平约300 pg / ml,检测到的含量变化不显著,但由于不同栽培变种和细菌刺激(图5 (b))。

il - 1β和TGF -β浓度的测试IPEC-J2上层清液样本大多低于最低检测水平的ELISA试剂盒(分别为6.7和4.6 pg / ml,;数据未显示)。

3.5。由猪MoDC细胞因子分泌

在上层的mono -和cocultured MoDC,直接ETEC孵化造成了il - 1β积累( )的趋势降低il - 1β浓度的IPEC-J2细胞(图6(一))。

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图6
蛋白表达(pg / ml) (a) il - 1β,(b)引发,(c) TGF -β,(d) TSLP ELISA检测的上层清液的猪MoDC刺激后大肠都有效(Ecf)或ETEC。在IPEC-J2 / MoDC cocultures,Ecf或添加ETEC IPEC-J2细胞的顶端或MoDC隔间。在MoDC单一栽培,细菌被添加到基底外侧隔间。采集标本后6 h添加细菌(意味着±SEM)。 每条独立的实验。方差分析的结果显示如下图。的结果事后测试是在补充表5。

引发释放ETEC-infected MoDC MoDC单一栽培比于cocultures IPEC-J2细胞( )(图6 (b))。这是在协议与结果在mRNA水平。此外,孵化与益生菌大肠都有效也引起了更高的引发蛋白质水平直接挑战MoDC单一栽培(与之相比大肠都有效反应在剩下的文化条件下),但这是低于ETEC-induced增加( )(图6 (b))。

猪MoDC分泌少量的TGF -β成相应的上层清液,这往往是在增加大肠都有效培养细胞( )(图6 (c))。令人惊讶的是,我们也发现TSLP表达的蛋白质水平MoDC样品(图6 (d))。的数量MoDC-derived TSLP在IPEC-J2可比与测量细胞。MoDC栽培的上层清液的存在IPEC-J2细胞包含更多TSLP比单一栽培,无论细菌治疗( )。

4所示。讨论

在目前的研究中,主要目标是确定炎症反应在猪细菌挑战MoDC IPEC-J2细胞改变了他们的相互干涉在体外coculture模型。遇到肠道细菌可以是不同的类型,我们进行挑战apathogenic实验大肠都有效应变和致病性大肠杆菌应变,后者有猪疾病相关性,尤其是在断奶期。

4.1。三通

t值的分析IPEC-J2 / MoDC cocultures及其对应的IPEC-J2单一栽培透露,IPEC-J2细胞的共培养与MoDC本身没有影响IPEC-J2单层膜的三通。类似的研究结果与人类肠道模型组成的人类实现IEC和MoDC36,37]。

以前的研究已经表明ETEC能够改变水感染IPEC-J2单层膜的屏障功能不利剂量和时间的方式(15,38- - - - - -40]。在目前的研究中,ETEC对屏障完整性的影响主要是检测2 h后孵化。水挑战IPEC-J2单一栽培表现出显著降低te即使4 h,这表明IPEC-J2单一栽培ETEC-induced略更敏感比cocultures上皮屏障功能的障碍。令人惊讶的是,对三通管基底细菌感染没有影响在任何时间点。后者可能是由于致病菌的低数量添加到cocultured MoDC IPEC-J2基底外侧的细胞导致较低的细菌:IPEC-J2细胞比率。当添加相同的细菌浓度,其他研究小组表明,基底外侧感染人类IEC(细胞系T84)单一栽培的病原菌,如adherent-invasive大肠杆菌(41]或空肠弯曲杆菌(42),导致相当大的te下降,基底后更大的应用程序相比,顶端的应用程序。尽管如此,低数量的ETEC IPEC-J2细胞应用于基底外侧舱在当前的研究中引起明显的促炎反应(见下一节)。

4.2。IPEC-J2细胞的炎症反应

在目前的研究中,我们提供的证据表明,inflammasome激活后致病ETEC挑战发生在两种细胞类型检查。IPEC-J2细胞,这是尤其有效的upregulation NLRP3 mRNA的表达。除了主要的细胞壁成分脂多糖(LPS),其他inflammasome-stimulating组件的致病性大肠杆菌包括毒素,如enterohemolysin和heat-labile肠毒素(43,44),或细菌RNA (45,46]。NLRP3在肠道炎症和内稳态的作用是有争议的47- - - - - -49]。莱斯那和Siegmund50)强调结果取决于细胞类型的影响。在上皮细胞内,NLRP3执行监管职能,例如,通过促进肠上皮细胞增殖,而不成比例的NLRP3激活固有层免疫细胞引起不利影响(50]。的保护作用NLRP3 inflammasome在IEC提出了宋昭和et al。51和扎基等。52]。在最近的一项研究中,风扇等。53)解决inflammasome IPEC-J2细胞活化在刺激与真菌毒素玉米烯酮和报告证据支持的监管职能NLRP3 inflammasome肠道内(53]。

我们进一步研究了NLRC4 mRNA表达在IPEC-J2细胞NRLC4 inflammasome特征明显是另一个inflammasome NLRP3之外。我们没有发现NLRC4 mRNA在这些细胞。我们和其他人先前不同的猪细胞和组织报告了类似的结果,表明功能NLRC4基因缺失在猪30.,54,55]。

在IEC是地震的主要来源为上皮再生(尤其重要52,56,57),IEC产生il - 1的能力β是一个有争议的问题58]。根据我们的结果,il - 1β中扮演微不足道的角色IPEC-J2细胞,而地震mRNA表达倾向于遵循相似的表达模式作为caspase-13决定,表明可能有caspase-13与地震之间的相关性。

基于假设caspase-13小鼠caspase-11猪同行,罢工的upregulation IPEC-J2 caspase-13 mRNA表达的细胞在ETEC曝光表明ETEC可能主要引发IPEC-J2经典之中inflammasome活化细胞。此外,caspase-13感应的致病性ETEC挑战更明显cocultured IPEC-J2细胞比IPEC-J2单一栽培。在人类和小鼠IEC, Knodler et al。59已经观察中的inflammasome激活通过caspase-4 caspase-11,分别以应对enteropathogens。最近的研究分配鼠直接同源caspase-11保护功能在胃肠道炎症状态(60- - - - - -62年]。例如,caspase-11-deficient小鼠显示过敏症硫酸葡聚糖sodium-induced结肠炎与阻碍有关地震生产(60,61年),这表明caspase-11在肠道炎症的改善效应(63年]。到目前为止,它是未知inflammasome信号由IEC交联与其他防御机制,最终协调相邻的招聘免疫细胞(58]。

一些作者已经证明caspase-11 caspase-1-dependent的上游激活行为规范inflammasome形成(64年,65年),而另一些报道,caspase-11形成中的inflammasome复杂本身(25,66年]。Caspase-1与caspase-4 5,到-11年,有能力处理白细胞介素(67年]。分析caspase-1 mRNA表达IPEC-J2细胞共培养后,增加透露曾同样被发现在IPEC-J2 caspase-13水平细胞,表明caspase-13和caspase-1之间可能的联系。取得了类似的结果在小鼠cocultures preadipocytes和肌肉细胞和成纤维细胞组成的,在mRNA的表达还存在某些(caspase-3 7和9)在某些情况下增强的效应coculturing [68年,69年]。据我们所知,还存在类似的调查与经典之中inflammasome信号尚未执行。

此外,一些作者表明caspase-11激活包括TLR4信号通路(和TLR适配器TRIF(包含适配器诱导干扰素-行动领域β]),感官细胞外有限合伙人(66年,70年]。IPEC-J2细胞,我们可以验证ETEC-associated upregulations TLR4 mRNA的表达,这可能表明,这个信号级联同样参与猪中的inflammasome激活。

转录控制还存在不同的物种之间的不同,例如,它已经建立了小鼠caspase-11但不是人类caspase-4,这是既定的表达(71年]。总结当前研究的观察,表明猪直接同源caspase-13响应类似于小鼠。在这方面,在将来的研究中验证是否caspase-13构成的猪还存在相当于上述经典之中inflammasome途径将是有趣的。集体,我们可以得出这样的结论:DC-driven监管邻近caspase-13调制IPEC-J2细胞主要是证明了这一点。这caspase-13调制可能是一个可能的解释为改变三通反应后观察到顶端ETEC感染IPEC-J2 mono -vs。cocultures和缺乏一个三通后反应管基底ETEC IPEC-J2细胞的感染。

4.3。猪MoDC的炎症反应

炎症反应在猪MoDC调查显示,MoDC IPEC-J2 / MoDC cocultures反应更适度致病性ETEC的挑战比单作MoDC;il - 1的表达β、地震和NLRP3减毒在mRNA水平和il - 1β作为一个趋势,也在蛋白质水平。促炎细胞因子引发的一个类似的模式指出mRNA和蛋白水平。与IEC特区已知表达NLRP3丰富并生成高il - 1β水平(72年]。夸张的细胞因子的生产,如il - 1β和引发,可导致肠道疾病的发展与肠道屏障的破坏,如炎症性肠病(73年,74年]。因此,有关inflammasome和引发反应我们的研究结果支持假设IEC实益MoDC促炎反应的适应行动入侵enteropathogens。我们提出一个inflammation-restricting相邻IPEC-J2细胞对猪的影响MoDC在目前的研究。其他研究小组提供了证据表明,IEC能够抑制促炎反应cocultured免疫细胞(37,75年]。在人类的肠道上皮细胞模型在直接接触培养IEC对有限合伙人不太敏感,表现出减少促炎反应(37]。

值得注意的是,caspase-13 mRNA表达MoDC似乎并未影响与IPEC-J2细胞共培养后;和ETEC-induced caspase-13 upregulation减少与IPEC-J2细胞中检测到。我们假定转录诱导猪MoDC caspase-13扮演一个次要角色,至少,在我们的实验设计。这突显出观察不同细胞类型实现一个独特的贡献免疫反应的发展,特别是在肠道(58]。

的apathogenic大肠都有效菌株用于本研究只有轻微影响某些炎性标志物(地震,il - 1β在MoDC单一栽培,引发)。与促炎反应不同大肠都有效菌株被几个工作组,记录记录毒株特异性诱导存在剂量依赖的相关性,例如,il - 1β引发,白介素、肿瘤坏死因子-α,在人类直流或小鼠巨噬细胞76年- - - - - -79年]。TGF -β建议为probiotic-triggered免疫调节机制(80年- - - - - -82年]。因此,一个趋势大肠都有效全身的TGF -增加β分泌到MoDC还指出在我们的实验。

4.4。潜在的介质IPEC-J2细胞和猪MoDC之间的串扰

作为减毒猪MoDC显示炎症ETEC响应cocultured IPEC-J2细胞时,我们旨在更密切地关注底层IPEC-J2 / MoDC交互。在我们的实验设计,与周边IPEC-J2细胞MoDC没有直接的联系。因此,调制的免疫细胞通过细胞衍生假设发生体液信号穿过过滤膜的能力。在我们的分析中,我们包括TSLP和TGF -β,我们认为是潜在的介质在这个双向相声。

一致认为可溶性因子可能是负责直流响应的规定,Rimoldi et al。8]表明,人类直流条件IEC的浮层显示一个表达下调il - 1β分泌后沙门氏菌感染。在他们的研究中,IEC-derived TSLP被确认为控制剂(8]。尽管TSLP通常被视为一个epithelial-derived细胞因子,它曾被发现在小鼠83年和人类直流84年,85年),它以自分泌的方式发布在致病性和过敏。在目前的研究中,我们观察到TSLP表达IPEC-J2和猪。出乎意料,MoDC-derived TSLP似乎为一个coculture条件下自分泌调节。

自分泌调控机制的MoDC也同样被提议的基础上TGF -β分泌(37]。巴特勒et al。37)观察到一个更高的TGF -β释放由人类直接接触IEC直流cocultured;这是伴随着弱致病性刺激炎症反应,如前所述。然而,这种效应会缺席coculture分开设置,更类似于我们的IPEC-J2 / MoDC cocultures [37]。根据我们的结果,共培养TGF -没有明显的影响β表达猪MoDC在场,信使核糖核酸或蛋白质水平。

因为它是不清楚IPEC-J2细胞能够产生TGF -β(86年),我们测量了TGF -β在mRNA水平。我们验证了TGF -βmRNA表达IPEC-J2细胞但是,然而,并不是监管在不同的治疗组。与我们的数据一致,巴特勒et al。37]发现只有非常少量的TGF -β解放了IEC, TGF -β不能确认为调制IEC-derived中介在目前的实验设计。

未来的研究需要获取知识的结果可能不同程度共培养技术使用时,允许cocultured细胞类型之间的直接接触。在这里,我们提供的证据可能参与TSLP派生的猪MoDC IPEC-J2细胞和MoDC之间的沟通。

5。结论

在目前的研究中,我们建立了一个猪肠道模型IPEC-J2细胞和MoDC组成。我们研究了炎症反应选择细菌代理和发现更多的耐受性表型MoDC cocultured IEC。inflammasome-related的差别这一结论支持了对这些和其他促炎细胞因子与MoDC相比单独培养。我们进一步提供了第一个证据表明猪caspase-13监管IPEC-J2细胞和猪MoDC应对细菌感染。IPEC-J2细胞,可能相关的经典之中inflammasome途径似乎诱导不仅通过ETEC感染还MoDC的存在。最后,我们证明的能力IPEC-J2细胞和分泌TSLP MoDC,即自适应的cocultured MoDC表示。我们的研究结果表明,控制炎症反应的IEC至关重要,防止无限制的居民生产的细胞因子的免疫细胞。还需要更多的研究来进一步揭示与IEC / DC的可溶性因子交互作用和验证的功能方面猪caspase-13在经典之中inflammasome信号。我们建议的提出在体外coculture等学习模型是一个有前途的工具在未来的交互。

缩写

方差分析: 方差分析
ASC: 凋亡和speck-like蛋白质包含一张卡片
嗨: 脑心浸液
B2M: Beta-2-microglobulin
菌落: 克隆形成单位
DC: 树突细胞
大肠杆菌: 大肠杆菌
EDTA: 乙二胺tetra-acetic酸
大肠都有效: 肠球菌都有效
ELISA: 酶联免疫吸附试验
ETEC: 产肠毒素的大肠杆菌
FCS: 胎牛血清
高尔特: 内脏相关淋巴组织
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶
gm - csf: 集落刺激因子
IEC: 肠上皮细胞
IL: 白介素
磅: Luria-Bertani
有限合伙人: 脂多糖
MHC: 主要组织相容性复合体
MoDC: Monocyte-derived直流
NLR: nod样受体
NLRC4: 域包含4 NLR家庭,卡
NLRP3: NLR家庭,pyrin域包含3
点头: 核苷酸寡聚化域
OD: 光密度
PBMC: 外周血单核细胞
PBS: 磷酸盐
PRR: 模式识别受体
总机: 重组猪
RT-qPCR: 实时定量聚合酶链反应
扫描电镜: 标准错误的意思
SLA: 猪白细胞抗原
真沸点: tata结合蛋白质
te: Transepithelial电阻
TGF -β: 转化生长因子-β
TLR: toll样受体
TSLP: 胸腺基质淋巴细胞生成素
YWHAZ: 酪氨酸3-monooxygenase /色氨酸5-monooxygenase激活蛋白质ζ。

数据可用性

三通、ELISA和qPCR数据用于支持本研究的结果中包括补充信息文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

确认

作者感谢k Sollig的帮助我将非常感谢。我们感谢p . Schwerk技术支持与提供的菌株和j·舒尔特TGF -β引物。这项研究是财务支持的德国研究基金会(批准号LO 2058/1-1)和埃尔莎的诺伊曼格兰特h的损失。

补充材料

在补充表1,三通的事后测试结果数据。补充表2、3、6和7显示的结果事后测试IPEC-J2 mRNA表达分析的细胞和MoDC。表4和表5的补充,这些蛋白表达分析的结果提出了IPEC-J2细胞和MoDC。(补充材料)

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