文摘

的关键转录因子辅助T细胞亚群,包括T-bet GATA3 RORγt, Foxp3参与各种自身免疫性疾病。甲基化是否这些大师的转录因子与实验性自身免疫性葡萄膜炎(淡)的发展和可能的表观遗传调控机制有但是没有解决。在我们的研究中,重要的甲基化变化Tbx21和Rorc观察视网膜CpG网站之一的水老鼠。两个CpG的网站Tbx21CpG网站之一Rorc显示明显的淡期间动态RPE-choroid甲基化变化复杂。mRNA表达Tbx21和Rorc在视网膜和RPE-choroid复合物与甲基化的变化在各个时间点淡发展。与生产相关的甲基化变化Th1 / Th17细胞的签名细胞因子、干扰素-γ和IL-17。mRNA表达的动态变化的DNA甲基转移酶(DNMT1)也指出,这可能与观察到的这些基因甲基化的变化。本研究提供的证据表明,DNA甲基化Tbx21和Rorc可能与淡的发展。DNMT1激活可能对调节DNA甲基化动力学有重要影响。

1。介绍

葡萄膜炎是一种炎症,影响视觉眼部疾病主要发生在世界范围内,影响劳动年龄人口(1,2]。它被定义为一个人工的葡萄膜炎症,尽管其他眼内结构,如视网膜和玻璃也可能参与进来。实验性自身免疫性葡萄膜炎(淡)是一个经典的葡萄膜炎动物模型,已被广泛用于研究人类葡萄膜炎(3]。特定的视网膜抗原,如interphotoreceptor retinoid-binding蛋白质(IRBP),可以用来在易感品系小鼠诱导淡(4]。淡IRBP诱导_{161 - 180}B10R肽在一个高度敏感。三世鼠标应变显示严重的炎症涉及的前和后段眼和相似的临床异常在人类panuveitis [5]。

越来越多的证据表明的重要性Th1、Th2, Th17, Treg淋巴细胞亚群在临床葡萄膜炎的发病机制6- - - - - -9]。T-bet(也称为Tbx21), GATA3(叫结合蛋白3),RORγt (retinoid-related孤儿受体γt,也称为Rorc), Foxp3(转录因子forkhead盒蛋白3)特定关键转录因子对这些Th细胞[子集10,11]。先前的研究表明,高基因拷贝数变化(CNVs) Rorc赋予眼部的遗传病风险的疾病(BD)和基因拷贝数异变低Foxp3女性倾向于双相障碍患者(12]。此外,基因拷贝数高Tbx21和Gata3被发现与高易感性急性前葡萄膜炎(AAU)和高拷贝数的Foxp3与疾病易感性AAU (13]。此外,异常的表情Tbx21,Gata3,Foxp3一直在观察实验性自身免疫性葡萄膜炎模型(14- - - - - -16]。

DNA甲基化是表观遗传研究修改。它是由特定的酶催化地活跃,DNA甲基转移酶(DNMTs),包括DNMT1 DNMT3a,种能阻碍DNMT3b和DNA复制过程中不同的角色在维持甲基化DNA (DNMT1)或作为新创methylators (DNMT 3 a / b) (17,18]。DNA甲基化是一种行之有效的表观遗传的基因调控在免疫系统19]。改变DNA甲基化水平已被证明与各种自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮(SLE) [20.,21),类风湿性关节炎(RA) (22),多发性硬化症(MS) (23),1型糖尿病(T1DM) [24,25)、眼部的疾病26],Vogt-Koyanagi-Harada (VKH)疾病(27]。最近的观察表明Th细胞转录因子子集的特定甲基化变化可能参与自身免疫性疾病(28- - - - - -30.]。一个异常的变化Foxp3甲基化水平一直在观察RA患者(28),以及在暴发性1型糖尿病(FT1D) [29日从我们组)病人,最近的一项研究显示更高的甲基化水平Gata3VKH葡萄膜炎患者(30.]。

此外,DNA甲基化的动态变化一直注意到与发展协会和其他病理生理过程31日,32]。然而,我们所知,DNA甲基化的动力学Tbx21,Gata3,Rorc,Foxp3在自身免疫性疾病尚未研究的发展,因此我们的研究的主题,即我们选择葡萄膜炎的疾病模型。结果显示显著的甲基化变化Tbx21和Rorc眼部组织发炎的老鼠接受淡,我们提供证据表明DNMT1可能发挥重要作用的调节DNA甲基化这两个转录因子。

2。材料和方法

2.1。和实验动物伦理语句

所有的实验的基础上下午声明使用动物在眼科和视觉研究。第一附属医院的伦理委员会重庆医科大学批准了这项研究的所有协议。所有的努力都是尽量减少动物不适和压力。B10。RIII老鼠从杰克逊实验室购买(美国巴尔港)和小鼠6到8周时被用于本研究。动物被安置在动物保健服务的特定的无菌条件下重庆医科大学12-12-hour光暗周期。

2.2。感应的淡

Interphotoreceptor类维生素a结合蛋白(IRBP)肽_{161 - 180}(IRBP_{161 - 180}由上海Sangon SGIPYIISYLHPGNTILHVD)合成(上海,中国)。淡是诱导如前所述33]。总之,小鼠皮下注射免疫底部的尾巴和两大腿50μg人类IRBP_{161 - 180}肽在100年μl PBS,乳化1:1(卷/期)完全弗氏佐剂(CFA, Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国)补充1.0毫克/毫升结核分枝杆菌菌株。总共有200μl乳液是注入/鼠标。

2.3。视网膜和RPE-Choroid复合物的集合

前炎症检查段每两天就从7天到第14天(炎症)的峰值确认老鼠成功开发了淡。在这个时期,老鼠的眼睛逐渐增加的炎症的迹象,包括角膜水肿、结膜充血、眼前房积脓,后粘连我们前面描述的33]。视网膜和收集RPE-choroid复合物在第0天(幼稚),第七天,14天,21天,IRBP免疫后的28天。

2.4。DNA制备亚硫酸氢和治疗

QIAamp DNA迷你包(试剂盒、瓦伦西亚、美国)是用于视网膜的DNA提取和RPE-choroid复合物作为制造商的指令。EZ DNA甲基化工具包(美国欧文Zymo研究)是用来执行亚硫酸氢转化基因组DNA (800 ng)以下循环条件重复20周期:95°C 30秒钟50°C 15分钟紧随其后。那么硫酸氢DNA用于进一步分析。

2.5。定量的甲基化分析T-bet、GATA3 RORγt, Foxp3的Sequenom MassARRAY EpiTYPER系统

的MassARRAY EpiTYPER(美国圣地亚哥Sequenom Inc .)被用来检测的DNA甲基化水平Tbx21,Gata3,Rorc,Foxp3使用下面的过程。PCR扩增开始孵化在95°C 4分钟,然后变性进行了45周期在95°C 20秒钟,随后退火60°C 30秒和扩展在72°C 1分钟,最后在72°C的环境为3分钟。设计的引物进行甲基化分析如表所示1。中央人民政府网站的Tbx211806年至1998年,中央人民政府网站的Gata3895年至1217年,中央人民政府网站的Rorc从1459年到1739年,中央人民政府网站Foxp3在1496年和1848年之间的转录开始站点(TSS)根据设计引物检测。甲基化检测引物的位置信息和CpG岛为每个基因如表所示S1和图S1。随后,虾碱性磷酸酶(SAP) (Sequenom Inc .)是用来脱去磷酸非公司核苷酸在37°C 20分钟,其次是85°C 5分钟。然后MassCLEAVE反应是根据制造商的说明进行3小时的37°C。一个MassARRAY™Nanodispenser(美国圣地亚哥Sequenom Inc .)用于最终产品分发到SpectroCHIP(美国圣地亚哥Sequenom Inc .)。的光谱是MassARRAY紧凑matrix-assisted激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)(美国圣地亚哥Sequenom Inc .)。EpiTYPER软件(美国圣地亚哥Sequenom Inc .)应用于量化每个CpG位点的甲基化水平或平均聚合CpG网站的价值。

2.6。实时PCR试验

眼睛是无核的老鼠在淡在不同时间点的发展和组织从这些眼睛仔细解剖。试剂盒试剂(美国卡尔斯巴德英杰公司)被用来从视网膜中提取总RNA和RPE-choroid复杂根据制造商的指示。PrimeScript RT试剂盒(豆类生物技术,大连,中国)是用于生成互补DNA(互补)。实时PCR进行实时PCR系统(ABI棱镜7500;美国应用生物系统公司,促进城市)根据制造商的指示。真正time-PCR分析,每个反应是运行在复制下列条件:95°C 10分钟,其次是15秒40 95°C的周期,最后孵化为60秒60°C。相对mRNA水平获得了比较2^−ΔΔCt方法如前所述[34]。在这项研究中使用的引物序列如表所示2。

2.7。统计分析

数据表示为±SEM。SPSS 22.0软件(SPSS Inc .,芝加哥,伊利诺斯州,美国)和GraphPad棱镜5软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)被用来执行统计分析。单向方差分析后跟Bonferroni调整用于多重比较。皮尔森相关测试是用于执行CpG甲基化状态之间的相关分析和mRNA转录因子的表达水平在不同的时间点淡发展。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。DNA甲基化动力学Tbx21,Gata3,Rorc,Foxp3在视网膜和RPE-Choroid复杂淡

T-bet、GATA3 RORγt, Foxp3主重要的转录因子Th细胞葡萄膜炎的子集,包括Th1、Th2, Th17, Treg细胞。甲基化变化是否这些转录因子参与淡的发病机制尚不清楚。因此,我们首先研究了动态DNA甲基化的变化Tbx21,Gata3,Rorc,Foxp3水老鼠的视网膜和RPE-choroid复合物在不同时间点由MassARRAY紧凑matrix-assisted激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)。

与IRBP肽免疫小鼠后,葡萄膜炎的最初迹象开始第九天,14天达到高峰,然后逐渐随着时间消退。的临床和组织学评分淡眼睛逐渐恢复正常从21日到28日天还在以前的研究中显示33,35- - - - - -37]。

视网膜的甲基化水平Tbx21和RorcCpG_1网站明显降低,达到了最低点在淡的第14天,随后再次甲基化水平逐渐增加( , , )(表3,数据1(一)和1(b))。RPE-choroid复合物,甲基化水平Tbx21在CpG_1 CpG_5网站和RorcCpG_5网站显示一个类似的配置文件( , , )(表4,数据1(c) -1(e))。

3.2。mRNA的表达Tbx21和Rorc视网膜和RPE-Choroid复合物在淡

甲基化的改变是否会影响基因表达,的mRNA水平Tbx21和Rorc被实时PCR检测。在视网膜(数字2(一)和2(b))和RPE-choroid复合物(数字2(c)和2(d)),信使rna表达显著增加,达到一个峰值在第14天淡然后mRNA水平的发展逐渐减少时间的方式( , , )。信使rna概要文件与上面所示的DNA甲基化水平的变化。这些发现有力地表明,甲基化变化负责mRNA表达变化。

3.3。CpG甲基化和mRNA的表达之间的相关性分析Tbx21和Rorc在淡

调查CpG甲基化之间的关系,这些基因的mRNA表达在淡的发展过程中,相关分析之间的关系进行了分析CpG-1站点和mRNA的表达Tbx21和Rorc淡的老鼠的视网膜在不同时间点在淡的发展。我们发现的甲基化水平CpG-1网站与mRNA的表达呈负相关Tbx21(图3(a))Rorc(图3(b))在小鼠的视网膜在淡发展在不同的时间点。此外,CpG-1的甲基化水平,CpG-5Tbx21(数据4(一)和4(b)), CpG-5Rorc(图4(c))也负相关的mRNA表达RPE-choroid复杂的老鼠在淡。

3.4。签名的mRNA表达细胞因子的Th1和Th17细胞在视网膜和RPE-Choroid复合物在淡

先前的研究表明,异常的表观遗传修饰可能与炎性细胞因子的异常生产密切相关的一些自身免疫性疾病(38]。因此,我们研究了DNA甲基化的变化是否影响生产签名Th1和Th17细胞的细胞因子淡模型。mRNA的表达干扰素-γ实时PCR和IL-17衡量。我们的数据表明,mRNA的表达干扰素-γ和IL-17逐渐增加淡的开发过程中,在第14天达到顶峰,然后减少视网膜(数字5(一)和5(b))和RPE-choroid复合体(图5(c)和5(d)) ( , , )。这些发现表明,DNA甲基化的减少观察在淡增加促炎细胞因子的生产。

3.5。种能阻碍DNMT3b DNMT3a DNMT1的mRNA表达,在淡

DNA甲基转移酶(DNMTs)特定催化地活跃的酶调节的可访问性DNA转录的元素,从而增强DNA甲基化。研究DNMTs参与甲基化的规定Tbx21和Rorc我们检查DNMT1的表情变化,种能阻碍DNMT3b DNMT3a,视网膜和RPE-choroid复合物淡小鼠在不同的时间点。结果表明,视网膜,DNMT1表达式显示动态变化对应的甲基化Tbx21和Rorc,这不是种能阻碍DNMT3b DNMT3a或观察(图6(一))( , )。DNMT1表达随时间显示类似的结果在RPE-choroid复杂视网膜(图6(b)) ( , , )。

4所示。讨论

这项研究显示了重要的DNA甲基化动力学与mRNA表达的变化Tbx21和Rorc小鼠的炎症组织中进行实验性自身免疫性葡萄膜炎。减少DNA甲基化期间观察到淡与Th1 /签名Th17细胞因子表达增加干扰素-γ和IL-17。我们另外提供初步证据的作用DNMT1的甲基化的变化Tbx21和Rorc在淡。综上所述,数据表明,异常的表观遗传变化的Th1和Th17转录因子可能参与淡的发病机制。

越来越多的证据表明,表观遗传修饰可能发挥重要作用在自身免疫性疾病的发病机制26- - - - - -30.]。功能障碍的免疫反应和炎性细胞因子的生产过剩自身免疫性疾病已被证明是与异常的表观遗传修饰(38]。我们的研究,我们表明,DNA甲基化的动力学Tbx21和Rorc对应于他们的基因表达,即甲基化这些因素与干扰素的表达有关γIL-17,支持这些发现。我们的研究结果与之前研究的分歧未能发现异常甲基化Tbx21或Rorc在CD4⁺从VKH葡萄膜炎患者T细胞(30.]。在后者中,甲基化的Gata3指出VKH患者,而在我们淡模型,我们没有任何的改变吗Gata3随着时间的推移,甲基化水平。异常甲基化的变化Foxp3已报告和一些自身免疫性疾病(28,39),也可以不被确认在我们淡模型。之间的差异可能是由于不同的角色不同的转录因子在小鼠自身免疫性模型与人类自身免疫性疾病的发病机制。一个可能的异常甲基化的变化机制Tbx21和Rorc在淡可能反映在Th1和Th17细胞的激活。深入研究,Th1和Th17细胞淡的病理过程中起着至关重要的作用。在目前的研究中,我们注意到动态的甲基化的变化Tbx21和Rorc,签名Th1细胞和Th17细胞转录因子,支持我们发现甲基化状态的改变Tbx21和Rorc葡萄膜炎的疾病进展密切相关。

特定autoimmunity-related基因的甲基化水平在各种自身免疫性疾病,包括系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎,可能与改变相关酶的表达调控DNA甲基化等DNMTs [22,40]。DNMT1的mRNA表达和DNMT3a降低外周血单核细胞(PBMCs)的系统性红斑狼疮患者比健康者(41]。DNMT1也观察到的异常的mRNA表达PBMCs白癜风患者(42]。这些观察结果证实了我们的研究结果显示在淡DNMT1 mRNA表达的动态变化。进一步证实了DNA甲基化变化由DNMT1的规定,染色质免疫沉淀反应(芯片)分析DNMT1浓缩的启动子Tbx21和Rorc需要在将来的研究中进行的基因。

众所周知,分子和细胞事件不是静态的在不同临床阶段的一种自身免疫性疾病。在疾病的发展过程中,动态DNA甲基化变化调节基因的表达,进而确定分子和细胞活动。因此,某些基因的甲基化程度可以作为敏感的生物标志物早期诊断和评估疾病的状态。此外,DNA甲基化动力学的评估也能导致小说发展的干预目标自身免疫性疾病。

我们意识到我们的研究有许多局限性,应该在将来的研究中得到解决。首先,技术的局限性MassARRAY系统不容忽视。DNA甲基化常发生在随后的CpG岛在启动子区域影响相关基因的转录。因此,我们设计了甲基化检测引物根据启动子区域的DNA序列中每个基因的CpG岛。然而,甲基化检测引物的覆盖范围仅限于不到500个基点,导致地区有限的启动子,可以覆盖这个方法(30.,43,44]。此外,数量有限的CpG甲基化分析网站可能不足以研究总体监管影响表观遗传这种基因。因此,与其他检测技术进一步的研究,如酸性亚硫酸盐测序或epigenome-wide协会(ewa)的研究,需要解决的确切作用后生监管效果实验以及临床葡萄膜炎的发病机制。我们的发现在老鼠身上进行,每个人都应该小心推断这些发现给人类。此外,虽然我们建议当地增加DNMT1可以用来阻止细胞因子表达在自身免疫性疾病,需要广泛的研究来进一步调查是否可行和治疗是否可以限制到特定的基因。

5。结论

总之,我们首次展示动态的甲基化变化的重要T-bet和ROR T细胞转录调控因素γt过程中可以检测到淡。减少DNA甲基化变化与更高的mRNA表达有关。我们另外提供证据表明,当地DNA甲基化与DNMT1 mRNA表达新开幕场馆等自身免疫性疾病的治疗葡萄膜炎。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者声明没有在本研究金融利益。

确认

作者感谢Jihong唐博士和俄文林博士的帮助育种研究中使用的老鼠。这项工作是支持的主要研究发展计划(2016 yfc0904000),中国自然科学基金重大国际(地区)合作研究项目(81720108009),重庆的眼科学重点实验室(CSTC, 2008 ca5003)和重庆科技平台和基地建设项目(cstc2014pt-sy10002)。

补充材料

表S1:位置信息的甲基化检测引物和Tbx21 CpG岛,Gata3 Rorc, Foxp3。图S1:甲基化检测引物的位置信息Tbx21, Gata3 Rorc, Foxp3。Tbx21基因甲基化primer-detected地区位于1806年至1998年,发现基因Gata3地区位于895年至1217年,发现基因Rorc地区位于1459年至1739年,发现Foxp3基因地区是位于1496年至1848年从转录起始站点(TSS)。(补充材料)